CC BY
18
УДК 616.5, 615.011
Цитотоксичность и дермальная проницаемость (skin PAMPA) ингибиторов P38MAPK (SB203580) и MAPKAPK2 (MK2.III)
Б.А. Умбаев, А. Масуд, Д.С. Алимбетов, А.К. Цой, Ю.И. Сафарова, Ф.С. Олжаев, А.А. Ермекова, Ш.Н. Аскарова
National laboratory Astana, Назарбаев Университет, г. Нур-Султан, Казахстан
Растущий объем данных, полученных на различных моделях воспалительного процесса в условиях in vitro и in vivo, убедительно свидетельствует о том, что ингибирование сигнальных путей, связанных с киназой р38, является многообещающей профилактической и терапевтической стратегией, заслуживающей пристального внимания. Тем не менее, возможность регулирования р38 с помощью малых молекул в коже является малоизученным вопросом, требующим дальнейших исследований. Начальным этапом любого исследования по влянию различных веществ на структуру и функции кожи является изучение их цитотоксичности и оценка дермального транспорта при топическом применении. Объектами данного исследования явились малые молекулы SB203580 (ингибитор р38) и MK2.III (ингибитор MAPKAPK2). Целью исследования явилось изучить цитотоксичность данных молекул на фибробластах человека и оценить дермальную проницаемость (skin PAMPA) в условиях in vitro. В результате проведенных исследований было показано, что ингибитор MK2.III обладает более высокой степенью проницаемости при пассивном транспорте по сравнению с ингибитором р38 - SB203580. В тоже время, коэффициент проницаемости исследуемых соединений свидетельствует о том, что оба вещества являются плохо проницаемыми через искусственную мембрану. Оценка цитотоксичности SB203580 и MK2.III выявила, что концентрации 0.1 цМ, 1 цМ, 2 цМ и 5 цМ не являются токсичными для фибробластов человека, тогда как концентрации 10 цM и 20 цM вызывают гибель клеток. Ключевые слова: Цитотоксичность, дермальная проницаемость, р38MAPK, MAPKAPK2, малые молекулы
Введение
Митоген-акктивированные протеинкиназы (МАР)-киназы являются эволюционно консервативным семейством ферментов, которые образуют высоко-интегрированную сеть, необходимую для достижения специализированных клеточных функций, контролирующих пролиферацию, дифференцировку и гибель клеток [1]. Р38 МАРК являются важными представителями МАП-киназ, включающими в себя
4 фермента: , р38а, p38p, p38б и p38Y. Данные киназы примерно на 60% идентичны по своим аминокислотным последовательностям, но кодируются разными генами и имеют разные особенности тканевой экспрессии [1]. Одним из наиболее известных ингибиторов р38 является малая молекула SB203580 (производное пиридинилимидазола), широко используемаяй для изучения роли белков p38, формула которой указана на рисунке 1.
Рисунок 1 - Формула SB203580
SB203580 показала свою эффективность и применяется при исследовании роли киназы p38 в регуляции транскрипции, трансляции и в элементах цитоскелета в ответ на различные стрессовые и цитокиновые стимулы [2]. Этот препарат специфически ингибирует изоформы р38а и p38p, действуя как конкурентный ингибитор связывания АТФ [3]. SB 203580 был исследован в ряде фармакологических моделей как in vitro, так и in vivo; его опосредованная TNF-a активность была продемонстрирована на большом количестве моделей животных,. SB 203580 ингибирует LPS-индуцированный TNF-a in vivo как у мышей, так и у крыс, с IC50 15 и 25 мг / кг соответственно. SB 203580 дозируется в течение 7 дней при 50 мг / кг перорально (два раза в день) снижает отек суставов на модели индуцированного коллагеном артрита у мышей
DBA/1 LACJ [4]. SB 203580 был очень эффективен для уменьшения воспаления лапы у крыс с адъювантным артритом (AA) в дозах 30 и 60 мг / кг / день, с оптимальным ингибированием, наблюдаемым при 60 мг / кг / день (86% ингибирование в день 16).
Ключевым эффектором р38 является МАР - киназа-активируемая протеинкиназа 2 (MAPKAPK2 или MK2), которая регулируется путем прямого фосфорилирования киназой p38 MAP и участвует во многих клеточных процессах, включая стрессовые и воспалительные реакции, ядерный экспорт, регуляцию экспрессии генов и пролиферацию клеток [5]. В качестве ингибитора MK2 особый интерес представляет малая молекула MK2.III (рисунонок 2) - проницаемое для клеток пирролопиридинильное соединение, действующее как АТФ-
конкурентный ингибитор MK-2 / MAPKAP-K2 (IC50 = 8,5, 81 и 210 нМ против MK-2, MK-5 и MK-3, соответственно) и проявляющее гораздо меньшую активность против 8 других обычно изучаемых киназ.
Было показано, что пирролопиридиновые ингибиторы МК2 эффективны в модели острого воспаления ревматоидного артрита (РА). Обнаружено, что эти ингибиторы, имея значения IC 50 =10 нМ, также показывают хорошие профили селективности против других родственных МК, CDK2 и киназ, связанных с продукцией TNF- а (MNK1, MSK1, MSK2, CDK2, ERK, JNK и p38). Показано, что они подавляют продукцию TNF-а в клетках U937 (IC50 = 4,4 мкМ) и эффективны в отношении крысиной ЛПС модели (модель острого воспаления). Это исследование подтверждает роль MK2 в РА с использованием низкомолекулярных ингибиторов [6]. Результаты наших
собственных in vitro исследований показали, что воздействие ингибитора MK2 на человеческие фибробласты, выделенные у пожилых доноров, приводит к снижению секреторного фенотипа, связанного со старением (The Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP)) [7]. Все эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование связанных с киназой р38 клеточных сигнальных путей малыми молекулами SB203580 и МК2, является многообещающим направлением исследований для разработки методов профилактики и терапии многих хронических возраст-ассоциированных заболеваний. Тем не менее, возможность регулирования р38 с помощью малых молекул в коже является малоизученным вопросом, требующим дальнейшего изучния.
Рисунок 2 - Формула MK2.III
Поскольку одной из особенностей кожи является ее функционирование в качестве физико-химического барьера и для достижения дермального слоя кожи, химическим соединениям необходимо преодолеть эпидермис с его роговым слоем [В], первым этапом изучения влияния различных веществ на структуру и функции кожи является проведение in vitro исследований их эпидермальной проницаемости. Было показано, что молекулярная масса (MW) соединения должна быть ниже 500 дальтон, чтобы обеспечить абсорбции через человеческий кожный барьер. Данное правило было сформулировано как правило «500 Дальтон» [9]. Молекулярные массы SB203580 и MK2 III, равны 377.43 и 340.38 дальтон соответственно, что, в теории, должно обеспечивать их хорошую чрезкожную проницаемость. Тем не менее, помимо молекулярной массы вещества, на дермальную абсорбцию могут оказывать влияние и другие факторы, что приводит к необходимости проведения in vitro исследования проницаемости. В этой связи, наиболее доступной моделью исследования является PAMPA - parallel artificial membrane permeability assay - модель проникновения через искусственные мембраны, которая используется для оценки пассивной проницаемости соединения через эпителиальные клетки [10]. Кроме того, на первом этапе исследований необходимо проведение оценки дермальной цитотоксичности малых молекул. В этой связи, целью настоящего исследования явилось изучение дермальной проницаемости и цитотоксичности малых молекул SB203580 и MK2 III.
Материалы и методы
Малые молекулы. В экспериментах использовали малые молекулы SB203580, CAS 152121-47-6, 4- (4-фторофенил) -2-(4-метилсульфинилфенил) -5- (4-пиридил) -1Н-имидазол ( Sigma-Aldrich) и MK-2.III, CAS 11В664В-22-5, 1,5,6,7-тетрагидро-2- [2- (3-хинолинил) -4-пиридинил] -4Н-пирроло [3,2-с] пиридин-4-один (Calbiochem). Оценка цитотоксичности
Для оценки цитотоксичности были использованы фибробласты крайней плоти человека. Для оценки цитотоксичности использовали коммерческий набор Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich). Для культивации фибробластов, после размораживания, клеточную суспензию высеивали в культуральном флаконе Т-75 при 37° С, 5% СО2 в инкубаторе. Для культивации была использована специальная культуральная среда (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко с высоким содержанием глюкозы 4500 мг/л, Л-глутамином и бикарбонатом натрия, без пирувата натрия, 15% фетальная бычья сыворотка, 1% пеницилин-стрептомицин). Культуральную среду меняли через 24 часа. После достижения культурой 80% конфлюентности, культуру пересеивали. Клеточную суспензию получали с помощью TrypLE™. Добавляли по 100 мкл клеточной суспензии (5000 клеток/лунку) в 96-луночный планшет. Далее планшет инкубировали 24 часа для адгезии клеток фибробластов в инкубаторе при 37°С 5% СО2. Использовались 6 концентраций малых молекул: 0.1 цМ, 1 цМ, 2 цМ, 5 цМ, 10 цМ и 20 цМ. Добавляли 10 мкл среды с малыми молекулами, а контрольная лунка содержала 5000 клеток фибробластов со средой содержащей DMSO. Планшет с клетками инкубировали 48 часов, затем в каждую лунку добавляли 10 мкл раствор ССК-8. После 4 часа инкубации при 37°С 5% СО2 оптическую плотность измеряли при 450 нм на многофункциональном ридере Synergy H1 (BioTek). Масс-спектрометрический анализ
Растворы испытуемых образцов и растворы стандартных образцов SB203580 и МК-2 Inhibitor III попеременно хроматографировали методом тандемной
высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) на жидкостном хроматографе Agilent 1260 Infinity с масс-спектрометром.
Количественное содержание малых молекул в испытуемых образцах в мг/мл определяли методом сравнения с внешним стандартом по формуле:
S ■ mo ■ 0,1 ■ 1 ■ P
So ■ 4 ■ 2,5 ■ V ■ 100
где, S - площадь пика малых молекул на хроматограмме раствора испытуемого образца; Бо - площадь пика малых молекул на хроматограмме раствора стандартного образца МК; V - объем испытуемого образца, мл; то - навеска стандартного образца малых молекул, мг;
Р - процентное содержание малых молекул в стандартном образце малых молекул; 0,1 - аликвота раствора стандартного образца малых молекул, мл; 1; 2,5; 4 - разведения, мл.
PAMPA
Для проведения параллельного анализа проницаемости искусственной мембраны был использован набор MultiScreen® Permeability Filter Plate Assembly (Merck). Использовался 96-луночный планшет, который состоял из верхней (акцепторной) и нижней (донорной) частей, которые разделялись искусственной мембраной на основе изопропилмиристат (30%) и силиконовое масло (70%). Чтобы сбалансировать уровни жидкости, рекомендуемый объем составлял 125 мкл для донорной ячейки и 200 мкл для
акцепторной ячейки. Раствор малых молекул с рН 7.4 добавляли в донорские ячейки. Исходная концентрация малых молекул в ячейке составляла 500мМ. Время инкубации составило 5 и 16 часов при комнатной температуре, чтобы соединение перераспределялось между двумя отсеками и мембраной. После инкубации удаляли донорский планшет с акцепторного планшета. Концентрацию веществ определяли с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Коэффициент проницаемости определяли с помощью формулы:
где, СА = конечная концентрация малой молекулы в акцепторной ячейке (мМ);
CD = конечная концентрация малой молекулы в донорной ячейке(мМ) ;
VD = объем в донорной ячейке (см3) ;
VA = объем в акцепторной ячейке (см3) ;
S = площадь поверхности (см2 ), обычно 0,268 см2 ;
VD = объем в донорной ячейке (см3) ;
t - время (с) инкубации
Cequilibrium = теоретическая равновесная концентрация = [CD ^ +СА ^А]/^ +VA] ;
В качестве контрольных образцов использовали растворы верапамила (высокая проницаемость) и ранитидина (низкая проницаемость). Концентрацию данных веществ определяли с помощью УФ спектрометрии. Статистический анализ
Полученные данные были представлены в виде средней ± стандартная погрешность средней величины (Mean± SEM). Стандартные отклонения между экспериментальными группами были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Значения считались достоверно различными при p < 0.05. Анализ проводился с использованием статистической программы SigmaPlot.
Результаты исследований
Результаты оценки переноса веществ в кожу в условиях in vitro с использованием искусственной миметической мембраны модель PAMPA
Для проведения масс-спектрометрического анализа содержания малых молекул был подобран и адаптирован протокол. Были подобраны следующие условия:
Для SB203580:
- аналитическая колонка, заполненная сорбентом Zorbax SB-C18, 50x2,1 мм с размером частиц 1,8 мкм;
- состав подвижной фазы: смесь 10 мМ раствора аммония формиата в воде и ацетонитрила в соотношение 40:60, изократический режим элюирования;
- параметры масс-детектора: режим детекции ионов: SM; таргетная масса для аналита: 378,00 m/z; fragmentor: 80; gain factor: 3.0; dwell: 350 мсек; dwell %/Ref: 100 %; вольтаж камеры распыления: 3000 В; поток осушающего газа: 6 л/мин; давление в небулайзере: 55 psig; температура осушающего газа: 320 °С;
- дополнительное УФ-детектирование при длине волны 280 нм;
- температура термостата колонки - 25°С;
- скорость подвижной фазы 0,250 мл/мин;
- объем вводимой пробы 0,5 мкл.
- время анализа: 5 минут.
Время удерживания SB составило 1,34±0,2 мин.
Рисунок 3 - Хроматограмма SB203580
Для MK2.III:
- аналитическая колонка, заполненная сорбентом Zorbax SB-C18, 50x2,1 мм с размером частиц 1,8 мкм;
- состав подвижной фазы: смесь 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде и 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле, соотношение растворителей 50:50, изократический режим элюирования;
- параметры масс-детектора: режим детекции ионов: SIM; таргетная масса для аналита: 341,00 m/z; fragmentor: 80; gain factor: 3.0; dwell: 350 мсек; dwell %/Ref: 100 %; вольтаж
камеры распыления: 4500 В; поток осушающего газа: 6 л/мин; давление в небулайзере: 45 psig; температура осушающего газа: 350 °С;
- дополнительное УФ-детектирование при длине волны 280 нм;
- температура термостата колонки - 40°С;
- скорость подвижной фазы 0,100 мл/мин;
- объем вводимой пробы 2 мкл.
- время анализа: 10 минут.
Время удерживания МК2 III составило 2,15±0,3 мин.
Рисунок 4 - Хроматограмма МК2 I Результаты определения малых молекул с помощью масс-спекктрометрии приведены на рисунка 5-6.
Рисунок 5 - Содержание в донорских и акцепторских ячейках SB203580
Рисунок 6 - Содержание в донорских и акцепторских ячейках MK2.III
Полученные результаты были использованы при расчете Результаты оценки переноса веществ в кожу в условиях in
коэффициента проницаемости. vitro приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Коэффициент проницаемости Log Pe малых молекул SB203580 и MK2 III и контрольных веществ
Верапамил Верапамил SB203580 SB203580 MK2 III MK2 III Ранитидин Ранитидин
5 часов 16 часов 5 часов 16 часов 5 часов 16 часов 5 часов 16 часов
Log -3,43 3,27 -6,34 -6,20 - 5,62 -5,11 5,51 5,24
Pe
Полученные результаты показывают что, при сравнительном анализе с контрольными веществами (верапамил и ранитидин), оба ингибитора имеют низкий коэффициент проницаемости, что свидетельствуют о том, что они являются плохо проницаемыми через искусственные мембраны соединениями. Следует также отметить, что ингибитор МК2 обладает более высокой степенью проницаемости при
пассивном транспорте по сравнению с ингибитором р38 -SB203580.
Результаты анализа цитотоксичности ингибиторов р38: SB203580; и MK2: MK2.III.
Эксперименты по анализу цитотоксичности ингибиторов были проведены на фибробластах крайней плоти человека (Рисунок 7).
Рисунок 7 - Фибробласты кожи человека. шкала = 50 мкм Результаты по по анализу цитотоксичности ингибиторов приведены на рисунках 8-9
Вестник КазНМУ №3-2020
Рисунок В - Цитотоксичность SB203580 (*-p<0.05**p<0.01)
Рисунок 9 - Цитотоксичность MK2.III(*-p<0.05**p<0.01)
Полученные результаты свидетельствуют о том что, статистически достоверно цитотоксическими являются концентрации 10 цМ и 20 цМ, которые вызывали гибель клеток, тогда как концентрации 0.1 цМ, 1 цМ, 2 цМ, и 5 цМ не являются токсичными для фибробластов человека. Заключение
Оценка переноса веществ в кожу в условиях in vitro с использованием искусственной миметической мембраны модель РАМРА показала, что ингибитор МК2 обладает более высокой степенью проницаемости при пассивном транспорте
по сравнению с ингибитором р38 - SB203580. В тоже время, коэффициент проницаемости обоих веществ свидетельствует о том, что оба вещества являются плохо проницаемыми соединениями и при их топическом нанесении необходимо будет применение дополнительных средств. Оценка цитотоксичности ингибиторов р38: SB203580; и MK2: MK2.III выявило, что концентрации 0.1 цМ, 1 цМ, 2 цМ, и 5 цМ не являются токсичными для фибробластов человека, тогда как концентрации 10 цМ и 20 цМ вызывали гибель клеток.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Labuda T. Selective induction of p38 mitogen-activated protein kinase activity following A6H co-stimulation in primary human CD4+ T cells // International Immunology. -2000. - №12. - Р. 253-261.
2 Badger AM, Bradbeer JN, Votta B, Lee JC, Adams JL, Griswold DE. Pharmacological profile of SB 203580, a selective inhibitor of cytokine suppressive binding protein/p38 kinase, in animal models of arthritis, bone resorption, endotoxin shock and immune function // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 1996. - №279. - Р. 1453-1461.
3 Lee JC, Laydon JT, McDonnell PC, Gallagher TF, Kumar S, Green D, et al. A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis // Nature. - 1994. - №372. - Р. 739-746.
4 Badger AM, Bradbeer JN, Votta B, Lee JC, Adams JL, Griswold DE. Pharmacological profile of SB 203580, a selective inhibitor
of cytokine suppressive binding protein/p38 kinase, in animal models of arthritis, bone resorption, endotoxin shock and immune function // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 1996. - №279. - P. 1453-1461.
5 Hegen M, Gaestel M, Nickerson-Nutter C, Lin L-L, Telliez J-B. MAPKAP Kinase 2-Deficient Mice Are Resistant to Collagen-Induced Arthritis // Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). - 2006. - №177. - P. 1913-1917.
6 Anderson D, Meyers M, Vernier W, Mahoney M, Kurumbail R, Caspers N, et al. Pyrrolopyridine Inhibitors of Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein Kinase 2 (MK-2) // Journal of medicinal chemistry. - 2007. - №50. - P. 2647-2654.
7 Alimbetov D, Davis T, Brook AJC, Cox LS, Faragher RGA, Nurgozhin T, et al. Suppression of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) in human fibroblasts using small molecule inhibitors of p38 MAP kinase and MK2 // Biogerontology. - 2016. - №17. - P. 305-315.
Hadgraft J, John Pugh W. The Selection and Design of Topical and Transdermal Agents: A Review // Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. - 1998. - №3. - P. 131135.
Bos JD, Meinardi MMHM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs // Experimental Dermatology. - 2001. - №9. - P. 165-169.
10 Reis JM, Sinko B, Serra CHR. Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) - Is it Better than Caco-2 for Human Passive Permeability Prediction? // Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. - 2010. - №10. - P. 1071-1076.
B
9
БА Умбаев, A. Mасуд, Д.С. Aлимбетов, AX. Цой, Ю.И. Сафарова, Ф.С. Олжаев, A.A. Ермекова, Ш.Н. Aскарова National laboratory Astana, Назарбаев Университетi, Н^р-Султан, ^аза^стан
P3BMAPK (SB2035B0) ЖЭНЕ MAPKAPK2 (MK2.III) ИНГИБИТOPЛAPЫНЫH, ЦИТОУЫТТЫЛЫЕЫ
жэне ДEPMAЛДЫKI етазмдтт (skin pampa)
Тушн: Кабыну процеажн in vitro жэне in vivo модельдерЫен алынFан мэлiметтердiн eсiп келе жаткан жиынтыFы р38 киназа сигналдык, жолдарынын тежелуi одан эрi зерттеуге турарлык перспективалык стратегия екенiн дэлелдейдг Алайда терiдегi шаFын молекулалардын p38 реттелу мумкiндiгi - бул косымша зерттелудi кажет ететiн нашар зерттелген мэселе. ЭртYрлi заттардын терЫщ к¥рылымы мен кызметiне эсерi туралы кез-келген зерттеудiн бастапкы кезенi олардын цитотоксикалыFын зерттеу жэне жергiлiктi колданFанда терiнiн тасымалдануын баFалау болып табылады. Вул зерттеудiн объектiлерi SB203580 (p38 ингибиторы) жэне MK2.III (MAPKAPK2 ингибиторы) ш^ын молекулалар болды. Зерттеудiн максаты осы молекулалардын адамнын
фибробласттарындаFы цитотоксикаль^ын зерттеу жэне терУн eткiзгiштiгiн C^i PAMPA) in vitro баFалау болды. Зерттеулер нэтижеанде MK3B. ингибиторынын пассива тасымалдау кезiнде eткiзгiштiк дэрежесi p3B ингибиторымен -SB2035B0 салыстырFанда жоFары екендiгi кeрсетiлдi. Сонымен бiрге зерттелелн косылыстардын eткiзгiштiк коэффициентi екi заттын, да жасанды к,абык,ша аркылы нашар eткiзетiндiгiн кeрсетедi. SB2035B0 жэне MK2.III цитотоксикалыFын баFалау кезiнде 0,1 мМ, 1 мкм, 2 мкм жэне 5 мкм концентрациялары адамнын фибробласттары Yшiн улы емес екендiгi аныкталды, ал 10 мкм жэне 20 мкм концентрациясы жасушалардын eлiмiн тудырады.
ТYЙiндi сeздер: цитоуыттылык, терi eткiзгiштiгi, p3BMAPK, MAPKAPK2, шаFын молекулалар
B. Umbayev, A. Masoud, D. Alimbetov, A. Tsoy, Y. Safarova, F. Olzhayev, A. Yermekova, Sh. Askarova National laboratory Astana, Nazarbayev University,Nur-Sultan, Kazakhstan
CYTOTOXICITY AND DERMAL PERMEABILITY (SKIN PAMPA) OF P38MAPK (SB203580) AND MAPKAPK2 (MK2.III) INHIBITORS
Resume: There is a burgeoning body of evidence that inhibition of the signaling pathways associated with the kinase p38 in in vitro and in vivo inflammation models is a promising area for further research. Mechanism of p38 regulation with small molecules in skin is poorly studied. The initial step is to investigate the cytotoxicity and assess dermal transport during topical application of the small molecules. The objects of current research are the small molecules SB203580 (p38 inhibitors) and MK2 III (MAPKAPK2 inhibitors). Main goal is to assess cytotoxicity of those molecules on human fibroblasts and evaluate the dermal permeability (skin PAMPA) in vitro.
According to the obtained results MK2 inhibitor has higher degree of permeability in passive transport compared to the p38 inhibitor- SB203580. At the same time, permeability coefficients of the studied compounds indicate that both inhibitors are poorly permeable through the artificial membrane. Evaluation of cytotoxicity of SB203580 and MK2.III revealed that substances were nontoxic in concentration of 0.1 ^M, 1 ^M, 2 ^M, and 5 ^M whereas concentration of 10 ^M and 20 ^M resulted in cell death. Keywords: Cytotoxicity, dermal permeability, p38MAPK, MAPKAPK2, small molecules
Финансирование:
Работа поддержана грантом АР05133475 «Разработка анти-SASP терапии для профилактики онкологических заболеваний и активации регенераторного потенциала кожи при старении», Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, 20182020 гг.
