CC BY
130
DOI: 10.23868/202104006
ТЕСТ-СИСТЕМА IN VITRO ДЛЯ СКРИНИНГА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ^-17А ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
Поступила: 26.06.2020 Принята к печати: 12.03.2021 Опубликована on-line: 25.03.2021
Н.К. Осина1, Е.И. Пугачев1, И.А. Коляденко2, В.В. Пряжкина1, Э.Г. Шакуров1, Е.В. Орлов1, Л.Т. Волова1
1 Самарский государственный медицинский университет, Самара, Россия
2 Институт Белка РАН, Пущино, Россия
TEST-SYSTEM IN VITRO FOR SCREENING OF THERAPEUTIC DRUGS WITH IL-17A INHIBITORY ACTIVITY
N.K. Ossina1, E.I. Pugachev1, I.A. Kolyadenko2, V.V. Pryazhkina1, E.G. Shakurov1, E.V. Orlov1, L.T. Volova1
1 Samara State Medical University, Samara, Russia
2 Institute of Protein Research of the RAS, Moscow region, Pushchino, Russia
e-mail: nossina@gmail.com
В современной биотехнологии для поиска новых лекарственных препаратов требуется создание высокоспецифичных тест-систем in vitro, основанных на использовании клеток человека. Цель исследования — разработка клеточной тест-системы in vitro для скрининга лекарственных препаратов с IL-17A ингибирующей активностью, основанной на использовании ювенильных фибро-бластов, выделенных из послеоперационного материала. Культуру ювенильных дермальных фибробластов человека обрабатывали препаратом IL-17A (1 серия) и смесью IL-17A с ингибитором IL-17A — нетакимабом (2 серия). ^-17А-зависимую секрецию медиаторов воспаления IL-6, IL-8, MCP-1 в кондиционированной среде после культивирования дермальных фибробластов оценивали с помощью иммуноферментного анализа. Полученные результаты продемонстрировали способность ювенильных фибробластов человека, культивированных в течение >20 пассажей, отвечать на IL-17A стимуляцию повышенной продукцией воспалительных цитокинов — IL-6, IL-8, MCP-1. Нейтрализация IL-17A ингибитором нетакимаб приводила к дозо-зависимому снижению секреции воспалительных цитокинов в культуральную среду.
Таким образом, разработан и апробирован новый способ оценки биологической активности ингибиторов IL-17A, основанный на анализе ^-17А-зависимой продукции воспалительных ци-токинов дермальными фибробластами человека. Показано, что нетакимаб является высокоэффективным ингибитором IL-17A.
Ключевые слова: псориаз, фибробласты, цитокины, интерлейкин-17A, интерлейкин-8, интерлейкин-6, моноцитар-ный хемотаксический белок-1.
To achieve greater clinical relevance of the newly discovered compounds, modern drug discovery requires disease-targeted assays based on human cells. The specific aim of this study was to design and develop a new cell-based assay for screening of compounds with IL-17A inhibitory activity. Human foreskin fibroblasts (HFF) were treated with IL-17A alone (experimental conditions I) or a mixture of IL-17A inhibitor netakimab and IL-17A (experimental conditions II). IL-17A — dependent production of inflammatory mediators IL-6, IL-8, MCP-1 was evaluated by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). The study demonstrated the ability of HFF subcultured in vitro for a long time (>20 passages) to respond to IL-17A treatment by increased production of inflammatory cytokines IL-6, IL-8, MCP-1. Neutralization of IL-17A by netakimab (IL-17A inhibitor) resulted in a dose-dependent decrease of inflammatory cytokines production into cell growth medium.
Thus, a new cell-based assay to evaluate the biological activity of Il-17A inhibitors has been developed and tested. The assay is based on the analysis of IL-17A-dependent production of inflammatory cytokines synthesized by human dermal fibroblasts. Netakimab has been shown to be a highly potent inhibitor of IL-17A.
Keywords: Psoriasis; Fibroblasts; Cytokines; Interleukin-17A; Interleukin-8; Interleukin-6; Monocyte chemoattractant protein-1.
Введение
Внедрение в широкую клиническую практику генно-инженерных моноклональных антител можно считать одним из важных достижений медицины за последние десятилетия. В настоящее время такие социально-значимые хронические заболевания как псориаз, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона, рефрактерная астма и другие успешно лечатся моноклональными антителами, ингибирующими молекулы-триггеры воспалительного процесса [1].
Псориаз — хроническое аутоиммунное заболевание кожи, которое активируется многочисленными факторами-триггерами, включая Т1\1Р-а и 11_-12, 11_-23, 11_-17 [1-5]. Среди этих цитокинов 11_-17А отводится особая роль [6]. Он оказывает плейотропное действие на разные типы клеток: фибробласты, кератиноциты, моноциты, эндотели-альные клетки, вызывая синтез воспалительных цитоки-нов, ускоренную пролиферацию кератиноцитов и синтез хемокинов, что способствует инфильтрации иммунными клетками очагов поражения [5-7]. Ключевая роль 11_-17А в патогенезе псориаза подтверждена успехами биологической терапии с применением антител-ингибиторов 11_-17А [8, 9]. Первыми антителами-ингибиторами 11_-17А
для лечения псориаза стали секукинумаб (AIN457, Швейцария) и иксекизумаб (LY2439821, США) [1]. Стратегия развития фармацевтической промышленности в России включает импортозамещение лекарственных препаратов. В апреле 2018 г. было зарегистрировано оригинальное моноклональное антитело к IL-17A — нета-кимаб (Биокад, Россия) [10]. Многие биотехнологические лаборатории работают над поиском новых IL-17 ингибиторов, а также над выпуском более дешевых копий уже зарегистрированных ингибиторов, так называемых биоаналогов, например, CNTO 6785 (Janssen, США), CJM112 (Novartis, США) и др. [1, 11]. Так как количество разрабатываемых антител-ингибиторов растет с каждым годом, возникает необходимость в сравнении их биологической активности. Исторически сложилась тенденция испытывать лекарственные препараты in vitro, используя иммортализованные клеточные линии, которыми легко манипулировать в лабораторных условиях. Однако, фармакологический эффект лекарственного препарата будет отличаться в зависимости от выбранного для тестирования типа клеток, поэтому при создании клеточных тест-систем нового уровня в современной биотехнологии растет интерес к использованию более физиологически
и клинически значимых клеточных фенотипов, которые максимально отражают физиологические процессы, происходящие in vivo [12-14]. Совершенно очевидно, что антиаритмические препараты оптимально будут протестированы только на кардиомиоцитах человека [15, 16], а заболевания нейрогенеративной этиологии требуют разработки тест-систем, основанных на нейронах [17]. Тем не менее, для использования данных типов клеток существует ряд ограничений: источник получения клеток человека должен соответствовать биоэтическим и законодательным требованиям; клетки должны обладать высокой пролиферативной активностью, так как для тестирования требуется большое количество клеток; тестируемая культура клеток должна синтезировать белки-мишени, специфичные для клинических проявлений заболевания. В нашу задачу входило создание клеточной тест-системы для тестирования противовоспалительного действия ингибиторов IL-17A, применяемых в лечении псориаза, поэтому выбор был сделан из клеточных культур тканей кожи человека, где происходит синтез воспалительных цитокинов при псориатическом поражении. Кожа крайней плоти ювенильных доноров, которая после операции циркумцизии подлежит утилизации, является доступным источником ювенильных дермальных фибробластов человека (HFF—human foreskin fibroblasts). Было доказано, что клетки HFF обладают высокой пролиферативной активностью [18-20], принимают участие в развитии патогенеза псориаза, способны синтезировать воспалительные цитокины [21-23] и, таким образом, могут служить адекватной клеточной моделью для оценки биологической активности IL-17A ингибиторов.
Цель исследования — разработка клеточной тест-системы in vitro для скрининга лекарственных препаратов с IL-17А-ингибирующей активностью, основанной на использовании ювенильных фибробластов, выделенных из послеоперационного материала.
Материал и методы
Получение культуры дермальных фибробластов
человека из кожи крайней плоти
Исследования с использованием культур клеток проводили в научно-производственном центре Самарского Банка Тканей СамГМУ. Первичный материал — фрагменты кожи, получали у доноров-мальчиков в возрасте до 10 лет во время операции циркумцизии после подписания добровольного информированного согласия законными представителями и одобрения исследования Комитетом по биоэтике ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (протокол № 184 от 03.05.2017). Доноры были соматически здоровы, результаты анализов на ВИЧ, сифилис, гепатиты В и С были отрицательны. HFF выделяли методом миграции из измельченных (3-5 мм) фрагментов кожи по методике К.Н. Гринберга и соавт. (1987) [24]. Чтобы избежать донор-специфичной вари-абильности клеток для разработки тест-системы были выбраны HFF одного донора (ЦА17) позднего пассажа (1 8 пассаж), которые после разморозки высевали в Т25 флаконы (ТРР, Швейцария), культивировали в ростовой питательной среде 1 99 (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Биолот, Россия) и 40 мкг/мл гентамицина (Дальхимфарм, Россия), до образования субконфлюент-ного монослоя и пересевали с помощью Версен-трипсина (Биолот, Россия) в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (ТРР, Швейцария) для проведения IL-17A (Институт Белка, Россия) стимуляции.
Клеточные культуры были охарактеризованы по индексу пролиферации, времени удвоения и индексу адгезии.
Индекс пролиферации (IP) определяли по формуле:
IP --
N
N
где 1\10 -количество прикрепившихся клеток через 2 ч. после посева, N — количество клеток через время t. Время удвоения (TD) определяли по формуле:
TD = t х
lg 2
lg(Nt /No)'
где t — время инкубации (ч.); N0 — исходное количество клеток; Nt — количество клеток через время t; lg2=0,30103.
Индекс адгезии рассчитывали через 24 ч. после посева клеток в лунки планшета по формуле:
ИА = N2 х100 / N1,
где N1 — посевная доза; N2 — количество клеток через 24 ч. после посева.
Морфологию клеток оценивали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX41 (Япония).
Результаты представленных экспериментов были получены на культуре клеток ЦА17-ИРР 20-24 пассажей.
^-17А стимуляция клеток
Эффект стимуляции фибробластов IL-17A тестировали на субконфлюентом монослое клеток (80%). Фибробласты высевали в лунки 96-луночного планшета (ТРР, Швейцария) с высокой плотностью (1,5х104 клеток на лунку) для получения субконфлюентного монослоя в короткие сроки. За 3 ч. до стимуляции клеток ростовую среду 1 99 меняли на бессывороточную среду 1 99, не содержащую антибиотики.
Было поставлено 2 серии экспериментов. В 1 серии (стимуляция) в бессывороточную среду 199 добавляли IL-17A в концентрации 10 нг/мл. Во 2 серии экспериментов (нейтрализация) IL-17A (5 нг/мл) смешивали с ингибитором IL-17A — нетакимабом (коммерческий препарат Эфлейра®, Биокад, Россия), в двукратно уменьшающихся концентрациях (10,0; 5,0; и 2,5 нг/мл.) Приготовленные среды инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре и затем добавляли к клеткам. Контролем служили клетки, инкубируемые в среде 199 без добавок. Все эксперименты проводили минимум в дубликатных повторах. После 18 ч. инкубации кондиционированные среды отбирали из каждой лунки в отдельный эппендорф и хранили при -20 °С для последующего анализа секреции цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Иммуноферментный анализ
Для определения концентрации интерлейкинов IL-6, IL-8 и моноцитарного хемоаттрактантого белка MCP-1 образцы кондиционированной среды анализировали с помощью ИФА согласно инструкции фирмы-производителя набора реактивов для ИФА (Вектор-Бест, Россия). Чувствительность ИФА составляла 0,5 пг/ мл для IL-6; 2 пг/мл для IL-8 и 15 пг/мл для MCP-1.
Статистический анализ
Статистический анализ данных выполняли с использованием программы SPSS 25. Применяли
однофакторный дисперсионный анализ и моделирование нелинейной регрессией. Результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения (M ±SD). Уровень статистической значимости различий (р) был принят за 0,05. Регрессионный анализ проводили по уравнению Хилла [25]. Общий вид зависимости:
E = Eo+ (E„- Eo) х Ch/(Ch+EC5oh),
где: E — моделируемая продукция интерлейкинов; Eo — максимально возможный эффект или продукция интерлейкинов в присутствии только IL-17A стимулятора — с нулевой концентрацией нетакимаба; — минимально возможный эффект или продукция интерлейкинов с бесконечной дозой ингибитора нетакимаб; С—концентрация нетакимаба, нг/мл; h — параметр Хилла, определяющих наклон кривой эффект-доза в точке перегиба; EC5o—50% эффективная концентрация ингибитора нетакимаба.
Результаты
Характеристика ювенильных дермальных
фибробластов, полученных из кожи крайней плоти
На базе Самарского медицинского института созданы банки клеточных линий (фибробластов, хондро-бластов), полученных из различных ювенильных тканей человека, которые охарактеризованы по способности синтезировать провоспалительные цитокины в ответ на сигнальные молекулы воспаления. Для разработки тест-системы была выбрана культура клеток одного донора (ЦА17-ИРР), так как была выявлена донор-специфичная вариабельность синтеза цитокинов. Клетки культуры цА17-ИРР 18 пассажа были разморожены из клеточного мастер-банка. В нативной культуре HFF имели вытянутую, веретеновидную форму, 2-4 отростка, гомогенную цитоплазму (рис. 1А), после криоконсерва-ции морфология клеток не изменялась (рис. 1Б). Индекс адгезии HFF (пассаж 9) был равен 98%, индекс пролиферации — 2,oo±o,o2, время удвоения — 23,93 ±o,29 ч.
Для экспериментовпо скринингу препаратовнеобходимо большое количество клеток: по нашим расчетам от одного донора к 2o пассажу можно получить более 3хЮ9 клеток. Такого количества клеточного материала достаточно для проведения крупномасштабных экспериментов in vitro, что делает культуру клеток HFF сопоставимой с «бессмертными» иммортализованными линиями клеток. Однако культивирование всех клеток от одного донора до 2o пассажа
трудоемко и потребует около 30000 литров культуральной среды. Криоконсервация клеток от одного донора дает возможность уменьшить затраты на поддержание клеточной линии, выбранной для тестирования, и достичь максимальной воспроизводимости результатов [26].
Провоспалительная секреторная активность
HFF в различных экспериментальных моделях
Была предложена следующая схема оценки биологической активности лекарственных препаратов: для запуска цитокинового синтеза клетки стимулировали !Ь17А [1 серия], а для оценки ингибирующей активности !Ь17А ингибитора клетки обрабатывали смесью !Ь17А с ингибитором в разной концентрации [2 серия]. Опосредованный эффект !Ь17А на клетки оценивали по уровню секреции провоспалительных белков, принимающих участие в патогенезе псориаза: !Ь6, !Ь8 и МСР-1. Кондиционированная среда от клеток, не обработанных !Ь17А [контроль], содержала следовые [пг/мл] количества данных факторов [рис. 2]. После обработки клеток !Ь17А в концентрации 10 нг/мл содержание всех цитоки-нов в кондиционированной среде на порядки [нг/мл] возрастало. Однако !_-17А-зависимая секреция МСР-1 была самой низкой по сравнению с секрецией И-6 и !Ь8 при равных экспериментальных условиях, поэтому для дозо-зависимого анализа нетакинаб-ингибирующей активности были выбраны только цитокины !Ь6 и !Ь8.
Рис. 2. Содержание провоспалительных медиаторов
[!1_-6 и 11_-8 и МСР-1] в кондиционированной среде
ЦА17-НРР, стимулированных !_-17А [10 нг/мл].
Результаты представлены как М ± ЭО
120
г£ 100 i at 90 - X
с 100 ^
± о 80
о цг 70 -
4 X * 60 \ 5 \ S 40 N. CL с
1 50 - О АГ) .
щ чп
о 20 - • • - —
£ 20 а 0 Д ИЛ-17А ИЛ17+ИигЗ ИЛ17+Имг2 ИЛ17+Имг1 О 10 -
( Б 1 3 4 5 6 7 8 Концентрация нетакимаб, нг/мл 10 11
120 120
г юо I \ о 80 \ °Р \ «60 \ « 40
Ч пи ® 100 ¡Е 90 ° во 70 t во-
•
g 50 ё 40 о. зо • - - --------- --------- ----- --------- --------
1 20 0 g ИЛ-17А ИЛ17+ИмгЗ ИЛ17+Имг2 ИЛ17+Инг1 С JU £ 20 m 10 — -1 1
Г 3 4 5 6 7 ! Концентрация нетакимаб, нг/м 9 10 11 п
Рис. 3. Ингибирование 11_-17А-стимулированной секреции интерлейкинов в культуральной среде ИРР моноклональными антителами нетакимаб: А — 1_-6, средние значения; Б — 1_-6, аппроксимация зависимости доза-эффект моделью Хилла; В — 1_-8, средние значения; Г — 1_-8, аппроксимация моделью Хилла. Во всех случаях содержание обоих цитокинов (1_-6 и 1_-8) в кондиционированной среде без добавления моноклональных антител принято за 100%
Таблица. Параметры уравнения Хилла
Параметры регрессии IL-6 IL-8
EC50 3,83 (3,06- 4,60) 1,51 (0,16- 2,87)
Параметр Хилла, h 1,92 (1,03- 2,80) 0,77 (0,12- -1,42)
Примечание: в скобках приведены 95% доверительные интервалы регрессионных параметров
Во 2 серии экспериментов перед внесением IL-17A в культуральную среду он был нейтрализован в течение 30 мин. антителами нетакимаб, которые специфично связываются с IL-17A. После 18 ч. инкубации клеток с IL-17A (5 нг/мл) или со смесью IL-17A с антителами нетакимаб в концентрациях 10,0; 5,0; 2,5 нг/мл кондиционированная среда была отобрана и проанализирована на содержание IL-6 и IL-8. Нетакимаб продемонстрировал высокую эффективность блокирования синтеза воспалительных маркеров псориаза IL-6 (рис. 3А) и IL-8 (рис. 3В). Взаимосвязь между дозами нетакимаба и продукцией интерлейкинов клетками представлена на рис. 3Б, Г.
Регрессионный анализ по модели Хилла проводили с нормированной продукцией интерлейкинов, где E0=100 и Ея=0 [25]. С учетом двух известных параметров уравнение выглядело следующим образом:
E=100-100 xCh/(Ch+EC50h)
Оценка оставшихся двух параметров — EC50 и h была проведена с помощью модуля нелинейной регрессии в программе SPSS (табл.). Для обоих интелейкинов было получено хорошее качество аппроксимации (р<0,001) с коэффициентами детерминации по 94% и стандартными ошибками регрессии: 8,4 для IL-6; 8,1 для IL-8.
Дозы нетакимаба, вызывавшие 50% ингибирование продукции интерлейкинов составили 3,83 (95% ДИ: 3,06-4,60) нг/мл для IL-6 и 1,51 (95% ДИ: 0,16-2,87) нг/мл для IL-8.
Полученные данные продемонстрировали, что биологическая активность ингибиторов IL-1 7А может быть оценена в условиях in vitro с использованием культуры HFF по уровню секреции медиаторов воспаления IL-6 и IL-8.
Обсуждение
При псориатическом поражении кожи наблюдается чрезмерная пролиферация основных клеток эпидермиса — кератиноцитов и нарушение их созревания, что приводит к сокращению времени обновления эпидермиса (с 28 до 3-4 дней). Хотя изменения в кератиноци-тах имеют решающее значение для развития псориати-ческих поражений, роль других клеток кожи, таких как фибробласты, не менее важна для поддержания псори-атического фенотипа, поскольку эти клетки гарантируют локальную продукцию факторов роста и цитокинов, стимулирующих пролиферацию кератиноцитов. Цикл обратной связи, действующий между кератиноцитами
Рис. 4. Дизайн тест-системы in vitro для скрининга и сравнения лекарственных препаратов с 11_-17А ингибирующей активностью. Клетки от одного донора могут быть амплифицированы in vitro и хранится в виде охарактеризованного клеточного банка клеток, готового к транспортировке в другие лаборатории. Клетки могут быть использованы для скрининга новых молекул и тестирования лекарственных биоаналогов
и фибробластами, кульминацией которого является пролиферация кератиноцитов, хорошо изучен [22, 27, 28]. Путем паракринной сигнализации кератиноциты стимулируют фибробласты к синтезу цитокинов и факторов роста, необходимых для пролиферации керати-ноцитов [29]. R. Debets и соавт. (1996) обнаружили, что количество IL-6, синтезируемое псориатическими фибробластами, выше по сравнению с контрольными фибробластами и одни из первых предположили, что фибробласты могут продуцировать пролиферативные факторы для кератиноцитов при псориатических поражениях [22]. Недавно была показана центральная роль дермальных фибробластов в ускорении пролиферации кератиноцитов посредством запуска окислительно-восстановительных процессов регулируемых сигнальной молекулой NOX4 (NADPH oxidase 4) [27]. Важная роль фибробластов в патогенезе псориаза предопределила выбор HFF в качестве клеточной модели in vitro для тестирования лекарственных препаратов с IL-17А-ингибирующей активностью, применяемых при лечении псориаза. IL-17A впервые был описан как воспалительный агент, индуцирующий продукцию IL-6 фибробла-стами [30], а позднее роль ^-17А в регуляции синтеза многих медиаторов воспаления была доказана на примере других типов клеток [31]. Важное условие создания современных клеточных тест-систем — выбор клеток, которые способны синтезировать молекулы, специфичные для клинических проявлений заболевания. Давно известно, что фибробласты, выделенные из кожи псори-атических бляшек, вырабатывают повышенные уровни факторов роста и воспалительных цитокинов [22]. Принимая во внимание, что, помимо гиперпролиферации кератиноцитов, псориаз характеризуется выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, мы предположили, что HFF наряду с воспалительными интерлейкинами
!_-6 и !_-8 также могут синтезировать хемокин МСР-1/ СС_2, привлекающий клетки моноцитарного звена в псориатические очаги поражения. Наше исследование показало, что ИГР, как и фибробласты взрослых доноров, способны отвечать на !_-17А стимуляцию увеличением секреции воспалительных цитокинов !_-6 и !_-8. Кроме того, мы подтвердили наше предположение о возможном синтезе клетками ИГР хемокина МСР-1, который при псориатическом поражении кожи считался продуктом синтеза кератиноцитов [32, 33]. Следует отметить, что в наших экспериментах разница в секреции цитокинов !_-6 и !_-8 между !_-17А-стимулированными и контрольными ИГР была существенно выше, чем в публикациях, где использовали дермальные фибробласты взрослых доноров больных псориазом [23] или генетически модифицированные ювенильные фибробласты Ви ИГР [21]. Экспериментальные условия в нашей работе, такие как пассажи, среды, прайминг клеток в бессывороточной среде, концентрации реагентов, характер и время стимуляции, сильно отличались от описанных в статьях других авторов [21, 23] и были оптимизированы под наши задачи с целью достижения максимальной продукции воспалительных цитокинов при !_-17А-стимуляции. Например, незначительная разница в секреции интер-лейкинов контрольными и !_-17А-стимулированными клетками в работе М. \loack и соавт. [2019] была связана с повышенной продукцией !_-6 и !_-8 [5-7 нг/ мл] контрольными [нестимулированными] клетками на ранних пассажах [пассажи 4-9], которые получали от больных псориазом, в то время как в нашей тест-системе нестимулированные ЦА17-ИРР [пассажи 20-24], выделенные их фрагментов кожи здорового донора, демонстрировали минимальную продукцию воспалительных цитокинов [15-70 пг/мл] [23]. Нужно отметить, что время отбора кондиционированной среды
для анализа цитокинов также отличалось: 48 ч. в работе M. Noack и соавт. (2oi9) [23] и 18 ч. в наших экспериментах. В случае культуры клеток BJ HFF (ATCC, США), в отличие от нашей модели, 1_-17А-стимуляцию проводили в среде, содержащей io% сыворотки, при меньшей концентрации 1_-17А (производитель R&D, США) и при более низкой посевной плотности клеток [21].
Следовательно, первичные ювенильные дермальные фибробласты могут быть применены для оценки биологической эффективности лекарственных препаратов. В ходе выполнения данной работы были подобраны оптимальные условия стимуляции клеток таким образом, чтобы секреция воспалительных цитокининов IL-6 и IL-8 многократно возрастала по сравнению с нести-мулированными ЦА^-HFF клетками, что позволяет с высокой степенью точности определить дозо-зависи-мую эффективность ингибирования.
Алгоритм использования тест-системы для скрининга и сравнения лекарственных препаратов представлен на рис. 4. HFF на ранних пассажах, прошедшие контроль качества, хранятся в виде клеточного мастер-банка. В зависимости от размера библиотек тестируемых молекул клетки одного донора могут быть размножены in vitro для создания рабочего банка клеток, готового для
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Beringer A., Noack M., Miossec P. IL-17 in chronic inflammation: from discovery to targeting. Trends Mol. Med. 2o16; 22(3): 23o-41.
2. Liang Y., Sarkar M.K., Tsoi _.C. et al. Psoriasis: a mixed autoimmune and autoinflammatory disease. Curr. Opin. Immunol. 2o17; 49: 1-8.
3. Griffiths C.E., Barker J.N. Pathogenesis and clinical features of psoriasis. Lancet 2oo7; 37o(9583): 263-71.
4. Ettehadi P., Greaves M.W., Wallach D. et al. Elevated tumour necrosis factor-alpha (TNF-a) biological activity in psoriatic skin lesions. Clin. Exp. Immunol. 2oo8; 96(1): 146-51.
5. Lee E., Trepicchio W._., Oestreicher J._. et al. Increased expression of interleukin 23 p19 and p4o in lesional skin of patients with psoriasis vulgaris. J. Exp. Med. 2oo4; 199(1): 125-3o.
6. Onishi R.M., Gaffen S._. Interleukin-17 and its target genes: mechanisms of interleukin-17 function in disease. Immunology 2o1o; 129(3): 311-21.
7. Coimbra S., Figueiredo A., Castro E. et al. The roles of cells and cytokines in the pathogenesis of psoriasis. Int. J. Dermatol. 2o12; 51(4): 389-98.
8. Martin D.A., Towne J.E., Kricorian G. et al. The emerging role of IL-17 in the pathogenesis of psoriasis: Preclinical and clinical findings. J. Invest. Dermatol. 2o13; 133(1): 17-26.
9. Mease P.J., Antoni C.E. Psoriatic arthritis treatment: biological response modifiers. Ann. Rheum. Dis. 2oo5; 64 Suppl 2: 78-82.
10. Кубанов А.А., Бакулев А.Л., Самцов А.В. и др. Нетакимаб — новый ингибитор ИЛ-17А: результаты 12 недель клинического исследования III фазы BCD-o85-7/P_ANETA у пациентов со среднетяжелым и тяжелым вульгарным псориазом. Вестник дерматологии и венерологии 2o19; 95(2): 15-28. [Kubanov A.A., Bakulev A._., Samtsov A.V. et al. Netakimab — new !_-17а inhibitor: 12-week results of phase III clinical study BCD-o85-7/ PLANETA in patients with moderate-to-severe plaque psoriasis. Vestnik dermatologii i venerologii 2o19; 95(2): 15-28].
11. Blauvelt A., Puig L., Chimenti S. et al. Biosimilars for psoriasis: clinical studies to determine similarity. Br.J. Dermatol. 2o17; 177(1): 23-33.
12. Horvath P., Aulner N., Bickle M. et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat. Rev. Drug Discov. 2o16; 15(11): 751-69.
13. Eglen R., Gilchrist A., Reisine T. An overview of drug screening using primary and embryonic stem cells. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2oo8; 11(7): 566-72.
14. Dunne A., Jowett M., Rees S. Use of primary human cells in high-throughput screens. Methods Mol. Biol. 2oo9; 565: 239-57.
15. Podgurskaya A.D., Tsvelaya V.A., Slotvitsky M.M. et al. The Use of iPSC-Derived Cardiomyocytes and Optical Mapping for Erythromycin Arrhythmogenicity Testing. Cardiovasc. Toxicol. 2o19; 19(6): 518-28.
16. Liang P., Lan F., Lee A.S. et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation 2o13; 127(16): 1-29.
17. Hunsberger J.G., Efthymiou A.G., Malik N. et al. Induced Pluripotent Stem Cell Models to Enable In Vitro Models for Screening in the Central Nervous System. Stem Cells Dev. 2o15; 24(16): 1852-64.
18. Lago J.C., Puzzi M.B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PLoS One 2o19; 14(7): 1-14
19. Зорина А.И., Бозо И.Я., Зорин В.Л. и др. Фибробласты дермы: особенности цитогенеза, цитофизиологии и возможности клинического
употребления в крупномасштабном скрининге. Клетки из банков могут быть доставлены для тестирования в другие лаборатории. На примере уже известного IL-17A ингибитора нетакимаба было продемонстрировано, что разработанная нами тест-система адекватна и достаточно чувствительна, чтобы оценить биологическую активность IL-17A ингибитора. При скрининге новых молекул с ^-17А-ингибирующей активностью нетакимаб просто заменяется любой другой молекулой биологического или химического происхождения. Таким образом, разработанная тест-система подходит не только для сравнения биоаналогов и контроля качества лотов моно-клональных антител, но и для поиска новых лекарственных препаратов, применяемых для лечения псориаза. Наша тест-система работает в 96-луночном формате и готова для скрининга библиотек новых соединений биологической или химической природы. В перспективе мы рассматриваем применение данной тест-системы в персонифицированной медицине для поиска ингиби-тор-нейтрализующих антител в сыворотках пациентов.
Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов
применения. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(2): 1 5-26. [Zorina A.I., Bozo I.Ya., Zorin V.L. et al. Derma fibroblasts: peculiarities of cytogenesis, histophysiology and possible clinical use. Cellular transplantology and tissue engineering 2011; VI(2): 15-26].
20. Fang F., Ni K., Cai Y. et al. Biological characters of human dermal fibroblasts derived from foreskin of male infertile patients. Tissue Cell 2017; 49(1): 56-63.
21. Wright J.F., Bennett F., Li B. et al. IL-17RA/IL-17RC Receptor Complex Cytokine Signals through the The Human IL-17F/IL-17A Heterodimeric. J. Immunol. Ref. 2008; 181: 2799-805.
22. Debets R., Hegmans P.J.J., Deleuran M. et al. Expression of cytokines and their receptors by psoriatic fibroblasts I. Altered IL-6 synthesis. Cytokine 1996; 8(1): 70-9.
23. Noack M., Beringer A., Miossec P. Additive or synergistic interactions between IL-17A or IL-17F and TNFa or IL-1 ß depend on the cell type. Front. Immunol. 2019; 10: 1-12.
24. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н. и др. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней. В: Вахтин Ю.Б., Соминина А.А., редакторы. Методы культивирования клеток. Ленинград: Наука; 1987. c. 250-7. [Grinberg K.N., Kuharenko V.I., Lyashko V.N. et al. Subculturing of human fibroblasts for the diagnosis of hereditary diseases. In: Vahtin Yu.B., Sominina A.A., editors. Methods of cell subculturing. Leningrad: Nauka; 1987. p. 250-7].
25. Gadagkar S.R., Call G.B. Computational tools for fitting the Hill equation to dose-response curves. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2015; 71: 68-76.
26. Zaman G.J.R., de Roos J.A.D.M., Blomenröhr M. et al. Cryopre-served cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today 2007; 12(13-14): 521-6.
27. Barygina V., Becatti M., Prignano F. et al. Fibroblasts to keratino-cytes redox signaling: The possible role of ROS in psoriatic plaque formation. Antioxidants 2019; 8(11): 1-20.
28. Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С. и др. Дермальные фибро-бласты для лечения дефектов кожи. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; IV(4): 26-40. [Zorin V.L., Zorina A.I., Petrakova O.S. et al. Dermal fibroblasts for skin defects therapy. Cellular transplantology and tissue engineering 2009; IV(4): 26-40].
29. Werner S., Krieg T., Smola H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J. Invest. Dermatol. 2007; 127(5): 998-1008.
30. Yao Z., Fanslow W.C., Seldin M.F. et al. Herpesvirus Saimiri encodes a new cytokine, IL-17, which binds to a novel cytokine receptor. Immunity 1995; 3(6): 811-21.
31. Benedetti G., Miossec P. Interleukin 17 contributes to the chronic-ity of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Eur. J. Immunol. 2014; 44(2): 339-47.
32. Behfar S., Hassanshahi G., Nazari A. et al. A brief look at the role of monocyte chemoattractant protein-1 (CCL2) in the pathophysiology of psoriasis. Cytokine 2018; 110: 226-31.
33. Giustizieri M.L., Mascia F., Frezzolini A. et al. Keratinocytes from patients with atopic dermatitis and psoriasis show a distinct chemokine production profile in response to T cell-derived cytokines. J. Allergy Clin. Immunol. 2001; 107 Suppl 5: 871-7.
