CC BY
5
УДК в13.632.4:6в2.749.3].07в.5
цитотоксичность АЭРОЗОЛЯ УГЛЕВОДОРОДОВ
ТЯЖЕЛОЙ КАМЕННОУГОЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ПРИ ВДЫХАНИИ
Проф. О. В. Перов Кафедра гигиены Тернопольского медицинского института
Комплекс углеводородов тяжелой фракции каменноугольной смолы широко применяется в народном хозяйстве. При получении сырья, на промежуточных этапах обработки последнего дистиллята каменноугольной смолы и при образовании производственных отходов мигранты углеводородов появляются в окружающей среде (О. В. Перов): загрязнение воздуха подобными продуктами имеет наибольшее значение, предопределяя ингаляционный путь проникновения в организм токсических веществ.
Недостаточность сведений о влиянии вдыхания смеси углеводородов тяжелой каменноугольной фракции послужила основанием для проведения специального исследования. Были изучены некоторые реакции клеток ткани легких на присутствие в воздушной среде указанной группы соединений в субтоксической концентрации, так как это позволяет выявить ранние отклонения в жизнедеятельности клеток, т. е. обнаружить первичный токсический эффект. Опыты проведены на 80 белых крысах-самцах 3-месячного возраста весом 160—170 г. В качестве продукта воздействия, отвечающего требованиям предпринятого изучения, использовалось антраценовое масло (AM) стандартного образца. Для ингаляции животных ежедневно (кроме выходных дней) помещали на 6 часов в экспериментальную камеру, где создавалась концентрация аэрозоля AM на уровне 100 ±15 мг!м3.
За время опыта выполнены 3 серии исследований: I серия — ингаляция в течение 60 суток с изучением последовательных изменений в ткани и альвеолярных клетках легких; II серия — наблюдение периода восстановления (36 суток); III серия — повторная ингаляция после периода восстановления для изучения стойкости репарации (38 суток). В каждой серии декапи-тировали по 1—2 крысы каждые 2—3 дня. Фоновые данные получены на 15 крысах контрольной группы.
При изучении цитотоксических явлений и восстановительных процессов в клетках паренхимы легких использованы следующие методы: гистологический обзор с окрашиванием срезов по Карацци и для выявления ме-тахромазии — толуидиновым синим; люминесцентно-цитохимическое определение ДНК вариантом реакции Фельгена по Bosshard и РНК—по Schümmelfeder и соавт. с контролем по Н. Е. Воротницкой и соавт., фотометрическое интерполирование для оценки интенсивности люминесценции; тонкослойная хроматография по Stahl и спектрофотометрия для изучения веществ, экстрагируемых из гомогената легких подопытных животных. Идентифцировали извлеченные соединения определением спектров поглощения (Goggeshal; Pao); витальное окрашивание производили нейтральным красным (НК) в концентрации 3,5-Ю-4 М. В клетках легких определяли степень гранулирования и спектроскопически — величину сорбции красителя.
Полученные величины обработаны статистически; выводы основываются только на данных с достоверностью различия (Р<0,05). В 1 серии опытов после 4 суток ингаляции в малых альвеолярных клетках замечено снижение интенсивности люминесценции ДНК до 25%, в некоторых участках левого легкого — до 30%, а также резкое контурирование клеточных границ. Сорбция НК клетками паренхимы легких уменьшилась уже через сутки от начала опыта и достигла на 4-й день 67±5% фонового уровня, принятого за 100. Одновременно клеточная способность гранулирования красителя снизилась на 30+3%. На 8—9-й день хроматографически и по спектрам поглощения в экстрактах из ткани легких обнаружено присут-
ствие AM — до 2,5±0,3 мкг на 1 г сырой ткани. Однако к 12-му дню количество экстрагируемого AM значительно снизилось и вместе с тем наблюдалось возрастание величины сорбции НК до фонового уровня. В течение следующей недели на хроматограмме и при спектрофотометрии элюатов выделены группировки хинонового характера, в основном фенолхиноны (Ятах 302 ммк) и некоторые экстракты содержали дигидроантрацены (Я,шах 271 ммк). Рост сорбции красителя замедлился, но с 19-го дня от начала ингаляции кривая поглощения НК пошла круто вверх и с небольшими колебаниями на 60-е сутки достигла 150%.
Гранулирование, хорошо выраженное на 12—18-е сутки (85±2% гра-нулосодержащих клеток в поле зрения), сменилось до конца опыта диффузным поглощением. В период 22—60 суток опыта в экстрактах из легких обнаруживались следы хинонов и рост количества AM с накоплением его на последней неделе до 7±0,5 мкг на 1 г сырой ткани. Замечено меньшее поглощение AM правым легким крысы, что, по-видимому, зависит от аэродинамических особенностей воздухоносных путей: увеличение дольчатости легкого, помимо усложнения в строении бронхиального дерева, связано с развитием ацинусов менее ветвистой структуры и с уменьшением массы альвеолярной ткани (Boyden; Engel).
При гистологическом обзоре срезов из легких, сделанных во второй половине I серии опытов, замечено гнездное изменение альвеолярных клеток: в некоторых местах они стали более вытянутыми. Люминесцентно-цитохимически в таких группах выявлено нарушение структурного градиента цитоплазматической РНК: неравномерная плотность последней и у ряда клеток — концентрация у полюсов со снижением яркости люминесценции на 50±10%. Это явление сопровождалось увеличением у-мета-хромазии основного вещества альвеолярных перегородок при окрашивании толуидиновым синим; наблюдалась пролиферация гистиоретикулярных элементов. В последние 2 недели до конца серии в ряде срезов из легких стали попадаться вначале точечные, а затем мелкоочаговые включения AM, заметные в легочной паренхиме по желтой флюоресценции (рис. 1).
Во 11 серии опытов после прекращения ингаляции явления клеточного повреждения наблюдались еще около 20 суток. У больших клеток альвеолярного эпителия очень медленно восстанавливалась люминесценция РНК: к исходу 10-го дня она была еще сниженной на 30±5%; вместе с тем удерживалась ослабленная флюоресценция ДНК. Затем эти нарушения начали постепенно восстанавливаться, в ряде ацинусов появились цито-морфологические признаки реактивации. К 20-му дню альвеолярные клетки приобрели обычный вид; в течение следующей недели до уровня фона восстановилась люминесценция нуклеиновых кислот цитоплазмы и ядра. Медленнее всего устранялись пролиферативные явления: на 30-е сутки в некоторых участках паренхимы легких были еще заметны остатки гистиоци-тарной реакции.
В экстрактах из легких в первые дни восстановительного периода находили AM (до 6—4 мкг на 1 г сырой ткани) и только в некоторых пробах — хиноновые группировки. В последующее время и до конца 2-й недели содержание AM в экстрактах постепенно снижалось, все чаще в них
Рис. 1. Точечные и мелкоочаговые включения антраценового масла в альвеолярной ткани легких крысы.
СвежезамороженныА срез при люминесцентной микроскопии: ок. 7Х. об. 10X .
¡so ISO /40 /30 120 Но wo
90 SO 70 60 SO 40
ii'i
i i
i i i i i i ' '
появлялись хиноиы. Максимально они выявлялись на 16—18-е сутки с момента прекращения ингаляции (в 12 из 16 проб), а затем стали убывать. После 21-го дня опыта AM в пробах не обнаруживали; в течение недели постепенно исчезли и хиноновые соединения.
После прекращения ингаляции первые 3 суток на высоком уровне держалось диффузное поглощение НК клетками ткани легких (150±5% фонового). Затем сорбция красителя начала снижаться, появились гранулосодер-жащие клетки, количество которых к 15-му дню достигло 30±5% в поле зрения; еще через неделю кривая поглощения НК перешла фоновую границу. В течение последующих 9 дней отмечалось некоторое снижение сорб-ционной способности, но с началом 2-го месяца опыта поглощение клетками
красителя установилось в пределах фонового значения.
В III серии опытов группу из 20 крыс подвергали повторной ингаляции AM в той же концентрации после 40 суток восстановительного периода. Через 5 суток при анализе экстрактов из легких обнаружено присутствие AM, количество которого к 10-му дню достигло 5 + 0,5 мкг на 1 г сырой ткани. При люминесцентно-цитохимическом исследовании срезов из легких в период 11—20 суток ингаляции найдено прогрессирующее снижение флюоресценции клеточных ядер малых альвеолярных клеток (до 50±10%). Наблюдалась умеренно выраженная проли-феративная реакция.
Сорбция легкими НК уже на другой день после начала ингаляции оказалась равной 120+5%, затем этот уровень стал довольно быстро повышаться и на 20-е сутки достиг 145%. Впервые 3 дня от начала вдыхания AM отмечено слабое гранулирование альвеолярными клетками НК: в поле зрения обнаруживалось 30±5% клеток, содержащих мелкие и в небольшом количестве зерна красителя. С продолжением опыта все более увеличивалось диффузное поглощение, однако с начала 4-й недели ингаляции в течение 9 суток зафиксировано снижение сорбции НК, дошедшее до 127%. В это время в отдельных группах альвеолярных клеток замечено гранулирование красителя и в экстрактах из ткани легких появились фенолхиноны. Затем эти явления исчезли, в экстрактах находили только AM, и сорбция красителя пошла на повышение.
Нарушения клеточной жизнедеятельности, показанные в III сериях опытов, отражены в кривых поглощения клетками НК (рис. 2).
Подопытные животные за все время эксперимента казались здоровыми. Лишь у некоторых крыс в I и III сериях опытов наблюдалось прерывистое дыхание с кашлевыми толчками, уменьшилась двигательная активность. •
Изменения в состоянии клеток ткани легких, вызванные вдыханием аэрозоля углеводородов, дают возможность представить следующую конструкцию ответных реакций на это токсическое воздействие. В первичной атаке на клетки углеводородного комплекса проявляет себя заметная карио-тропность, что приводит к снижению активности нуклеопротеидов ядра клеток. Уменьшение интенсивности люминесценции ДНК и кривая сорбции красителя показывают, что клеточный стресс в опытах I серии продолжал-
13 6 9 12 /S18 2t 242730333S 3S424S4SS/S4S760
Рис. 2. Сорбция легкими крысы нейтрального красного при вдыхании аэрозоля антраценового масла и в период восстановления.
На оси абсцисс — продолжительность опыта (в сутках); на оси ордина!— сорбция (в %); фон— 100%. / — ингаляция 60 суток; 2 — период восстановления; 3 — повторная ингаляция; вертикальные штрихи — доверительный интервал - 95% уровня.
ся около 5 суток, после чего возникла тенденция к преодолению альтерирующего влияния. В клетках наблюдается рост гранулирования H К, де-токсикация доходит до образования хиноновых группировок, указывая на усиление деятельности внутриклеточных мембран (Л. Ингрэм; Morton). Последний комплекс признаков можно квалифицировать как проявление адаптационных механизмов. Однако их уровень оказывается недостаточным, и продолжающееся поглощение легкими частиц AM увеличивает клеточную альтерацию. Об этом говорит отсутствие в экстрактах из ткани легких продуктов обезвреживания AM и, наоборот, рост количества последнего.
По-видимому, основные нарушения жизнедеятельности клеток происходят на молекулярном уровне в области субклеточных структур, так как липопротеидный характер мембран (Green; Deenen) дает возможность составным частям AM свободно проникать в подобные образования. Можно представить, что таким же путем преодолена и плазматическая оболочка, поскольку увеличенное поглощение клетками молекул красителя указывает на повышение ее проницаемости.
Таким образом, вдыхание комплекса углеводородов тяжелой каменноугольной фракции вызывает в альвеолярной ткани длительное напряжение клеточных функций на почве сильного угнетения мембранных процессов детоксикации и кариотропных нарушений. Развитие альтерации дополняют мукоидная дезорганизация основного вещества паренхимы легких, заметная по росту 7-метахромазии, и усиливающаяся клеточная пролиферация.
Изменения в легких в постингаляционный период подтверждают сказанное. Как видно из II серии опытов, восстановление функциональной активности ткани легких происходит медленно. Более 2 недель поддерживается паранекротическое состояние клеток; только к концу месяца постепенно нормализуются реактивные центры внутриклеточных структур, возвращается их временно утраченная каталитическая способность. В сравнении со сроками восстановления, известными при других видах повреждения (Д. С. Саркисов; Wood), это затянувшийся процесс. Результаты III серии эксперимента позволяют оценить полноту достигнутого восстановления. Оно оказалось не вполне устойчивым: при повторном вдыхании аэрозоля AM повреждение ткани легких происходит быстрее, чем это наблюдается в опытах I серии. Мобилизация механизмов адаптации выражена слабее, по времени отодвигается и укорачивается, хотя нужно отметить ее проявление на известной высоте клеточной альтерации (130% сорбции НК). Наблюдаемый в данной серии опытов несколько ускоренный процесс поражения клеток паренхимы легких может говорить не только о недостаточности периода восстановления, но и о возможном повышении чувствительности к повтсрной ингаляции. Последнее, однако, требует выяснения.
Мы не ставили перед собой задачу решить вопрос о допустимой концентрации в воздухе комплекса углеводородов тяжелой каменноугольной фракции. Однако, очевидно, что концентрация подобных продуктов на уровне 100 мг/м3 не может быть допущена в местах их воздушного выброса.
ЛИТЕРАТУРА
Воротницкая Н. И., Зеленин A.B., Ляпунова Е. А. мокл. АН СССР, 1963, т. 152, № 3, с. 724.— П е р о в О. В. Гиг. и сан., 1969, № 8, с. 77,— Саркисов Д. С. В кн.: Исследования обратимости острых и хронических изменений внутренних органов. М., 1962, с. 188.— Ингрэм Л. Механизмы биохимических реакций. М., 1964.— Pao Ч. H. Р. Электронные спектры в химии. М., 1964.— Bos-shard U., Z. wiss. Mikr., 1964, Bd 65, S. 391.— В o y d e n E., Segmental Anatomy of the Lungs. New York, 1955.— С о g g e s h a 1 N. В кн.: Physia I Chemistry of the Hydrocarbons. New York, 1950, p. 114,—Deenen van L., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1966, v. 137, p. 717,—Engel S., Anat. Anz., 1959, Bd 106, S. 86.—Green D., Perdue J., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1966, v. 137, p. 667,— M о г t o n R., Biochemistry of Quinones. New York, 1965.— Schümmelfeder N.. Ebshner K-, Krogh E., Naturwissenschaften., 1957, Bd 44, S. 467,— Stahl E., Z. analyt. Chem., 1961, Bd 181, S. 303— Wood R., Am. J. Path., 1965, v. 46, p. 307.
Поступила 29/1X 1970 г.
THE CYTOTOXICITY OF INHALED HYDROCARBONS AEROSOL OF THE HEAVY
COAL FRACTION
О. V. Perov
Inhalation of hydrocarbons eroisol of the heavy coal fraction (anthracene oil) at a concentration of 100 mg/m3 produced in experimental animals lesions of the alveolar tissue cells: the RNA and DNA liminescence was diminished, the detoxicating activity was suppressed and the capacity of cytoplasm to granulate the neutral red stain was restrained. The author concludes that the concentration in the air of hydrocarbons aerosol of the heavy coal fraction at a level of 100 mg/ms cannot be permitted.
УДК 613.281:664.481-099
К ВОПРОСУ О ТОКСИЧНОСТИ L-МОНОГЛЮТАМАТА НАТРИЯ
Проф. А. А. Покровский, В. И. Сомин, М. М. Гаппаров, А. Н. Сычева Институт питания АМН СССР, Москва
В зарубежной печати в последнее время дискутируется вопрос о возможной токсичности L-моноглютамата натрия (МГН), используемого в пищевой промышленности большинства стран в виде приправы к консервам, концентратам, а также к готовой пище как интенсификатор вкуса.
По данным Olney, 1969, однократное подкожное введение МГН (в дозе 0,5—4,0 мг1г) вызывает острый некроз невронов в различных областях мозга, в частности в гипоталамической, у новорожденных белых мышей. Через 5—9 месяцев у этих животных можно наблюдать ряд нарушений, например, недоразвитость скелета, ожирение, изменения в эндокринной системе, стерильность самок и др.
Обсуждая вопросы проницаемости плаценты, автор указал на возможность вредного воздействия МГН на плод при приеме препарата беременными. Определенные отклонения при подкожном введении МГН, выражавшиеся в изменении некоторых биохимических показателей (Freedman и Potts), повреждении ретины (Lucas и Newhouse), склонности к ожирению (Cohen), отмечались и ранее. Эти экспериментальные данные нельзя не сопоставить с работами ряда авторов о патогенезе «синдрома китайских ресторанов» (Schaumburg и Byck; Schaumburg и соавт.; Ambos и соавт.). При анализе причин появления характерных симптомов (чувство жжения в области живота, полнокровие лица, грудные боли и иногда тяжесть и болезненность в области головы), часто возникающих у любителей китайской кухни, которая в значительном количестве применяет МГН как вкусовую приправу к блюдам, Schaumburg и соавт., а также и другими исследователями было показано, что появление данных симптомов обусловлено именно влиянием глютамата натрия, а не каких-либо других компонентов пищи.
Работа Olney (1969) подверглась критике со стороны некоторых американских исследователей (Blood и соавт.), справедливо указавших на неудачный выбор подопытных животных и на неадекватность доз и путей введения МГН. В своей ответной заметке Olney (1969) сообщил, что изменения в мозге при подкожном введении МГН имеют место и у новорожденных обезьян (Macaca mulata).
В связи с запросами по поводу токсичности МГН и противоречивостью литературных данных в Институте питания АМН СССР были проведены специальные опыты на экспериментальных животных и наблюдениях на группе людей-добровольцев.
В настоящем исследовании сделана попытка не только оценить степень токсичности препарата, но и выяснить некоторые стороны механизма его действия. В опытах на животных с этой целью изучена динамика содержания различных свободных аминокислот в плазме крови крыс как при однократном введении внутрь больших доз МГН, так и после ежедневного введения внутрь менее значительных доз препарата в течение ряда дней.
