CC BY
109
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 621.793
И. Ш. Абдуллин, М. М. Гребенщикова
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЛАЗМЕННЫХ КОНДЕНСАТОВ
Ключевые слова: плазменные конденсаты, биологические свойства, цитотоксичность, индекс пролиферации, биологическая совместимость, нитрид гафния, нитрид титана.
Исследованы металлы - медь, титан, сталь, цирконий, гафний и их нитриды. В качестве объектов исследования выбраны перевиваемые культуры живых клеток. Установлена цитотоксичность у меди, частичная цитотоксичность у титана, его нитрида, циркония и гафния, отсутствие цитоток-сичногсти у стекла, стали, и смеси нитридов гафния и титана.
Keywords: plasma condensates and biological properties, cytotoxicity, proliferation index, biocompatible nitride, hafnium, titanium nitride.
Investigated metals - copper, titanium, steel, zirconium, hafnium and their nitrides. As objects of study chosen transplantable culture of living cells. Established the presence of cytotoxicity of copper, partial cytotoxicity of titanium nitride and zirconium and hafnium. The absence of cytotoxicity set in glass, steel, and a mixture of nitrides of hafnium and titanium.
Актуально получение новых материалов, свойства которых позволяют использовать их в тесном контакте с тканями живого организма, в частности, с кожей человека. Такие материалы называют биосовместимыми. Они оказывают минимальное воздействие на организм.
Установлено, что металлы четвертой группы и другие d-элементы и их нитриды обладают в определенной степени бактерицидными и бактериостатическими свойствами в отношении болезнетворной микрофлоры т.е. оказывают воздействие на биологические объекты. [1,2]. При использовании этих материалов в контакте с живым организмом необходимо установить их биосовместимость, в первую очередь, отсутствие цитотоксичности.
Плазменные конденсаты получали на поверхности металлических образцов из нетоксичной нержавеющей стали марки 12Х18Н9 методом КИБ (конденсация из пламенной фазы в условиях ионной бомбардировки). Результаты исследований могут быть перенесены на полимерные материалы, в частности на натуральную кожу и мех с волосяным покровом с покрытием из тех же материалов [1]. На стальных подложках получены также конденсаты меди и серебра, являющиеся известными эталонами биологической активности. Все покрытия имели толщину 2 - 5 мкм, при параметре шероховатости 0,2 - 0,8 мкм. Ток дуги испарителей составлял для титановых и медных катодов 55 - 60 А, а для циркониевых, танталовых и гафниевых 70 - 80 А.
Конденсацию покрытий нитридов производили при давлении азота 10-3мм.рт.ст, а металлов в остаточной воздушной атмосфере при давлении 5-10"5 мм.рт.ст. Время конденсации 20 - 40 минут.[3]
Для определения цитотоксичности образцов была применена методика исследования на цитотоксичность (ГОСТ Р ИСО )10993.5 - 99 [4], с использованием перевиваемых культур клеток и питательных сред с нормированным составом. Перед испытанием проводилась сухожаровая стерилизация образцов при температуре 180°С.
Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в возможности неограниченного роста и деления вне организма, а так же в относительной автономности существования, приближающей культуры клеток к бактериям и другим микроорганизмам, выращиваемым на искусственных средах [5]. В работе использованы следующие перевиваемые линии культур клеток и питательные среды:
- Невринома Гессерова узла крысы (НГУК), состоящая из фибробластоподобных
клеток.
- Трахея эмбриона крупного рогатого скота (ТР), состоящая из эпителиоподобных
клеток.
- Перевиваемая почка эмбриона свиньи (СПЭВ), состоящая из эпителиоподобных
клеток.
- Перевиваемая почка эмбриона овцы (ППЭО), состоящая из фибробластоподоб-ных клеток.
- Перевиваемые почки взрослой свиньи (ПК-15), состоящие из эпителиоподобных
клеток.
- Культура, полученная из миеломы линейных мышей Ва1в/с (Р 2/0), состоящая из эпителиоподобных клеток.
В питательные среды добавляли глютамин, антибиотики. Подсчет посеянных и выросших клеток проводили в камере Горяева.
Проводили исследование по определению токсичности вытяжек из плазменных конденсатов, приготовленных на основе питательной среды гидролизата лактальбумина (ГЛА). Его термостатировали при температуре 37°С в течение 30 суток с образцами из стали, нитрида титана, нитридом циркония, смесью нитридов титана и гафния. Установлено, что ГЛА, выдержанный в течение 30 дней с конденсатами металлов был токсичен для культур клеток НГУК, ППЭО, ТР, а для культур клеток ПК-15 и СПЭВ эти же питательные среды были, в основном, не токсичны. Конденсаты нитридов были нетоксичны.
Далее проводили опыты с внесением 1,5 мл суспензии культур клеток в колбу с исследуемыми образцами, находившимися в питательной среде и выдержанных в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов. В качестве контроля использовали клетки, росшие на покровном стекле. О росте клеток судили по индексу пролиферации, который рассчитывали по отношению выросших клеток к внесенным.
Проведено две серии опытов. В первой серии опытов использованы культуры клеток: НГУК, р 2/0, ТР, СПЭВ, ППЭО, ПК-15. Через 48 часов монослой клеток в колбах с пробами и контролем просматривали под микроскопом. В контроле на покровном стекле просматривался ровный монослой, так же как и в опыте, во всех колбах с образцами на металлической основе, кроме меди, вырос хороший ровный монослой клеток. Результаты анализа показали, что перевиваемые культуры клеток НГУК, р 2/0, ТР, ППЭО и ПК-15 на образцах с плазменными конденсатами металлов прикрепляются и растут.
Поскольку индекс пролиферации клеток на стали в среднем по культурам клеток равен единице, то рост клеток на других плазменных конденсатах является положительным при индексе пролиферации 1 и более.
Данные роста перевиваемых культур клеток на исследуемых образцах представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Значение индекса пролиферации перевиваемых культур клеток при взаимодействии с плазменными конденсатами в течение 48 часов
Наименование образца Линии перевиваемых культур клеток
НГУК Р 2/0 ТР СПЭВ ППЭО ПК-1
Контроль(покровное стекло) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
Нитрид титана 2,0 2,2 2,0 2,0 Не вырос 1,0
Медь Клетки не прик эепились к металлу и стеклу колбы
Сталь 12Х18Н9 2,0 2,0 2,0 1,6 1,0 1,3
Нитрид циркония 1,8 1,8 2,0 1,0 1,0 0,6
Тантал 1,6 0,7 4,0 1,0 1,0 Не вырос
Ниобий 1,5 1,0 2,0 1,3 1,0 1,0
Гафний + титан 1,4 1,3 1,0 1,0 0,3 0,3
Титан 1,3 1,0 1,0 0,6 0,6 0,6
Нитрид (титан + гафний) 1,8 1,7 1, 4 1,2 1,0 1,2
Во второй серии для исследования при таком же времени контакта взяты два вида культур клеток: ТР и НГУК (табл. 2). Это, соответственно, эпителиоподобные и фибробла-стные клетки. Проведено исследование с плазменными конденсатами металлов на подложках из стали марки 12Х18Н9 в шести повторах. Образец меди был исключен, как токсичный материал для культур клеток, а покровное стекло служило эталоном инертности.
При значении индекса пролиферации менее единицы, результат принимается как отрицательный рост клеток, что говорит о токсичности образца для данной культуры клеток.
По результатам опытов можно сделать выводы о воздействии плазменных конденсатов исследуемых металлов и их нитридов на клеточные культуры, и, в дальнейшем, в сочетании с данными, полученными по другим методикам, о воздействии на живой организм в целом.
Установлено, что тридцатидневные вытяжки из конденсатов на стали марки 12Х18Н9 не показали однозначных результатов, была установлена токсичность конденсатов металлов для культур клеток. Плазменные конденсаты смеси нитрида гафния и нитрида титана не оказывают угнетающего воздействия на культуры клеток, а так же не способствуют их ускоренному патологическому росту.
В связи с этим можно утверждать, что установлено отсутствие цитотоксичности плазменных конденсатов смеси нитридов титана и гафния, и в отношении ряда перевиваемых культур клеток, а именно: к невриноме Гессерова узла крысы (НГУК), трахее эмбриона крупного рогатого скота (ТР), перевиваемой почке эмбриона свиньи (СПЭВ), пере-
виваемой почке эмбриона овцы (ППЭО), перевиваемой почке взрослой свиньи (ПК-15), культуре, полученной из миеломы линейных мышей.
Таблица 2 - Результаты роста культур клеток ТР и НГУК на металлических образцах с 48 часовым контактом и доверительной вероятностью 0,8
Наименование образца ТР Кол-во клеток х 25OOOO Индекс пролиферации НГУК Кол-во клеток х 25OOOO Индекс пролиферации
Покровное стекло 3,5 і 0,5 2,б і 0,42
Нитрид титана 2,33 і 0,47 0,бб 3,27 і 0,47 1,25
Сталь 5,13 і 0,47 1,4б 2,8 і 0,72 1,07
Нитрид циркония 5,б і 0 1,б0 4,9б і 0,48 1,90
Гафний + титан 7,33 і 0,84 2,09 2,8 і 0 1,07
Титан 4,0 і 0,2б 1,14 3,29 і 0,45 1,30
Нитрид гафния + нитрид титана 5,83 і 0,43 1,бб 2,8 і 0 1,07
Для дальнейших исследований в контакте с живым организмом рекомендуются
смеси нитридов титана и гафния, как наиболее толерантные к клеткам живого организма,
биологически совместимые.
Литература
1. Абдуллин, И.Ш. Плазменные конденсаты с биологически активными свойствами / М. М. Гребенщикова, И.Ш.Абдуллин // Сб. «Новые технологии и материалы легкой промышленности». - 2010. - С.312-317
2. Абдуллин, И.Ш. Новые материалы с биологической совместимостью и бактериостатическими свойствами/ И.Ш. Абдуллин, М.М.Гребенщикова // Научная сессия КГТУ. - 2010 . - С.278.
3. Шарафеев, Р. Ф. Исследование газодинамических характеристик потока высокочастотного емкостного разряда пониженного давления в процессах обработки материалов / Р.Ф. Шарафеев // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. - №2. - С.364-369.
4. ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro.- М.: Изд-во стандартов, 2002.
5. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Адамс Р. - М.: Мир, - 1983. - 223 с.
© И. Ш. Абдуллин - д-р техн. наук, проф., зав. каф. плазмохимических и нанотехнологий высокомолекулярных материалов КГТУ, [email protected]; М. М. Гребенщикова - асп. той же кафедры.
