CC BY
23
DOI: 10.21294/1814-4861-2021-20-4-73-83 УДК: 576.3:546.62:57.085.23
Для цитирования: Ложкомоев А.С., Бакина О.В., Казанцев С.О., Иванова Л.Ю., Августинович А.В., Афанасьев С.Г., Спирина Л.В., Добродеев А.Ю. Цитотоксические свойства нанолистовых структур на основе оксидных и гидроксидных фаз алюминия в отношении опухолевых клеток. Сибирский онкологический журнал. 2021; 20(4): 73-83. - doi: 10.21294/1814-4861-2021-20-4-73-83
For citation: LozhkomoevA.S., Bakina O.V., KazantsevS.O., Ivanova L.Yu., Avgustinovich A.V., AfanasyevS.G., Spirina L.V., Dobrodeev A.Yu. Cytotoxic properties of nanostructures based on aluminum oxide and hydroxide phases in relation to tumor cells. Siberian Journal of Oncology. 2021; 20(4): 73-83. - doi: 10.21294/1814-4861-2021-20-4-73-83
цитотоксические свойства нанолистовых структур на основе оксидных и гидроксидных фаз алюминия в отношении опухолевых клеток
А.С. ложкомоев1, О.В. Бакина1, С.О. Казанцев1, л.Ю. Иванова1, А.В. Августинович2, С.г. Афанасьев2, л.В. Спирина2, А.Ю. Добродеев2
Институт физики прочности и материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук, г Томск, Россия1
Россия, 634055, г. Томск, пр. Академический, 2/4. E-mail: ovbakina@ispms.tsc.ru1 Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, г Томск, Россия2 Россия, 634009. г Томск, пер. Кооперативный, 52
Аннотация
Введение. Применение наночастиц и наноструктур в качестве компонентов терапии опухолей является предметом большого количества научных исследований. Одним из наиболее перспективных подходов подавления жизнеспособности опухолевых клеток является изменение величины водородного показателя рН их микроокружения при добавлении наночастиц и наноструктур. Гидроксиды и оксиды алюминия имеют ряд преимуществ перед другими частицами благодаря развитой поверхности, низкой токсичности и термической стабильности. Целью исследования явилось изучение влияния кислотно-основных свойств нанолистовых структур на основе гидроксидов алюминия с различным фазовым составом на жизнеспособность широкого спектра опухолевых клеток: HeLa, MDA, PyMT, А549, B16F10. Материал и методы. В качестве прекурсора для получения наноструктур различного фазового состава использовали наночастицы алюмонитридной композиции. Наночастицы алюминия были получены электрическим взрывом алюминиевой проволоки в атмосфере азота. Такие наночастицы реагируют с водой уже при температуре 60 °С. В результате формируются пористые наноструктуры, которые представляют собой агломераты нанолистов с планарным размером до 200 нм и толщиной 5 нм. Фазовый состав наноструктур варьировали температурой прокаливания. Изменение фазового состава наноструктур приводило к изменению кислотно-основного покрова их поверхности. Для оценки количества кислотных и основных центров на поверхности наноструктур использовали адсорбцию индикаторов Гаммета. Количество адсорбированных красителей определяли спектрофотометрически. Результаты. Отличия кислотно-основных характеристик поверхности синтезированных наноструктур приводят к изменению их цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. У гидроксида алюминия в фазе Y-Al203 основных центров было в 6,5 раза больше, чем кислотных, что обусловливает его способность проявлять более выраженные антацидные свойства, т.е. дольше нейтрализовать протоны, выделяемые опухолевыми клетками. Данный образец обладает наибольшей активностью в отношении всех клеточных линий. Заключение. Противоопухолевая активность синтезированных наноструктур обусловлена не только повышением величины рН микроокружения клеток, но и возможностью дольше поддерживать щелочность микроокружения за счет адсорбции протонов, выделяемых опухолевыми клетками.
Ключевые слова: наноструктуры, цитотоксичность, кислотно-основные свойства, опухолевые клетки.
ложкомоев Александр Сергеевич, asl@ispms.tsc.ru СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2021; 20(4): 73-83
cytotoxic properties of nanostructures based on aluminum oxide and hydroxide phases in relation
to tumor cells
A.s. Lozhkomoev1, o.V. Bakina1, s.o. Kazantsev1, L.Yu. Ivanova1, A.V. Avgustinovich2, s.G. Afanasyev2, L.V. spirina2, A.Yu. Dobrodeev2
Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 2/41, Akademicheskiy Ave., 634055, Tomsk, Russia1. E-mail: ovbakina@ispms.tsc.ru1 Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences2, 5, Kooperativny per., 634009, Tomsk, Russia2
Abstract
Background. Currently, the use of nanoparticles and nanostructures as components of tumor therapy is the subject of numerous scientific articles. To change the parameters of cell microenvironment in presence of nanoparticles and nanostructures is a promising approach to reducing the tumor cell viability. Aluminum hydroxides and oxides have a number of advantages over other particles due to their porous surface, low toxicity, and thermal stability. The purpose of the study was to investigate the influence of the acid-base properties of aluminum hydroxide structures with different phase composition on the tumor cell viability (HeLa, MDA, PyMT, A549, B16F10). Material and Methods. AlN/Al nanoparticles were used as a precursor for obtaining structures with various phase compositions. The anoparticles were produced by electric explosion of an aluminum wire in a nitrogen atmosphere. Such nanoparticles interact with water at 60 °C, resulting in formation of porous nanostructures. They are agglomerates of nanosheets with a planar size of up to 200 nm and a thickness of 5 nm. The phase composition of the structures was varied by the calcination temperature. A change in the phase composition of nanostructures led to a change in the acid-base properties of their surface. To estimate the number of acidic and basic centers on the surface of nanostructures, the adsorption of Hammett indicators was used. The amount of adsorbed dyes was determined spectrophotometrically. Results. It was found that the differences in the acid-base characteristics of the surface of the nanostructures led to a change in their antitumor activity. Y-Al203 had 6.5 times more basic centers than acidic ones, which determined its ability to exhibit more pronounced antacid properties, i.e. longer to neutralize protons secreted by tumor cells. This sample had the highest antitumor activity against all tested cell lines. conclusion. The antitumor activity of synthesized structures was found to be related not only to an increase in the pH of the cell microenvironment, but also to the ability to maintain the alkalinity of the microenvironment for a longer time due to the adsorption of protons released by tumor cells.
Key words: nanostructures, antitumor activity, acid and base properties, cell microenvironment.
Введение
Уникальные свойства наночастиц и наноструктур открывают новые перспективы для лечения злокачественных новообразований. Для противоопухолевой терапии были разработаны многочисленные системы на основе наночастиц в качестве носителей лекарств для целевой терапевтической доставки [1-6] и проводники для создания гипертермии [7]. Кроме того, наночастицы с определенным размером, морфологией, фазовым составом и другими физико-химическими свойствами могут оказывать прямое влияние на биологические функции раковых клеток [8-10]. Одним из перспективных подходов в борьбе с опухолевыми клетками может стать подавление их жизнеспособности через изменение параметров микроокружения клеток, в том числе изменение водородного показателя рН. В работе Т Li et а1. [11] показаны перспективы использования металлфуллереновых наночастиц Gd@C82(OH)22 при воздействии на опухоль через
ингибирование ангиогенеза, антиоксидантной и иммунной активации. В экспериментах in vitro показана возможность подавления пролиферации клеток оксидом магния (MgO) повышением рН микроокружения клеток [12, 13]. Известно, что кислотность опухолевых клеток вызвана увеличением генерации протонов в результате анаэробного метаболизма за счет сверхэкспрессии димерного изофермента пируваткиназы M2-PK [14]. Благодаря этому опухоли имеют значительно более низкий внеклеточный водородный показатель (рН~6,5-7,1) по сравнению с нормальными тканями (рН=7,4) [15-17]. Разница кислотности микроокружения нормальных и опухолевых клеток также используется для направленной доставки и контролируемого высвобождения химиотерапев-тических препаратов в опухоли [18-21].
Благодаря кислому микроокружению опухолевые клетки в большей степени устойчивы ко многим стандартным лекарственным средствам,
которые являются слабыми основаниями. Препараты быстро нейтрализуются кислым микроокружением опухолевой клетки. Для нейтрализации кислотности внеклеточной среды в настоящее время используются ингибиторы протонного насоса (РРЬ), с помощью которых увеличивается эффективность химиотерапии [22]. Последние исследования показывают, что изменение внеклеточного рН убивает опухолевые клетки, уменьшает метастазирование и снижает устойчивость опухолевых клеток к лекарственным препаратам [23]. Это позволяет рассматривать данный подход в качестве перспективного метода лечения рака, в том числе при использовании субоптимальных концентраций химиопрепаратов.
Перспективными материалами для нейтрализации кислого рН микроокружения клеток могут стать наноструктуры на основе оксидов и ги-дроксидов алюминия. Известно, что гидроксиды алюминия являются нейтрализаторами кислот и адъювантами. Кроме того, они обладают высокой адсорбционной емкостью и пористостью. В зависимости от способа получения можно синтезировать наноструктуры на основе оксидных и гидроксидных фаз алюминия, обладающие различной формой, размером, кислотно-основными свойствами, фазовым составом, дзета-потенциалом и др. Изменение фазового состава наноструктур -это основной фактор, регулирующий кислотно-основной покров поверхности. В настоящей работе фазовый состав наноструктур варьировали температурой прокаливания. Кроме того, было изучено влияние агломератов нанолистовых структур на основе гидроксидов алюминия с различным фазовым составом на жизнеспособность опухолевых клеток.
Цель исследования - изучение влияния кислотно-основных свойств нанолистовых структур на основе гидроксидов алюминия с различным фазовым составом на жизнеспособность широкого спектра опухолевых клеток: ЫеЬа, MDA, РуМТ, А549, Б16Р10.
Материал и методы
Синтез нанолистовых структур на основе гидроксидов алюминия осуществляли окислением водой нанопорошка АШ/А1, полученного методом электрического взрыва алюминиевой проволочки в атмосфере азота [24, 25]. Для этого навеску порошка массой 10 г помещали в емкость с дистиллированной водой объемом 1000 мл и нагревали суспензию при постоянном перемешивании при 60 °С в течение 60 мин. В результате нагрева суспензии происходит гидролиз и окисление на-ночастиц АШ/А1. После реакции осадок отфильтровывали при помощи мембраны с диаметром пор 0,44 мкм и сушили при 120 °С в течение 2 ч. После сушки порошок разделяли на три части, одну из которых оставляли неизменной, вторую
прокаливали в муфельной печи при 650 °С, третью - при 900 °С.
Морфологию синтезированных образцов нанолистовых структур исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии ПЭМ (JEM-2100, Япония) и сканирующей электронной микроскопии СЭМ (Zeiss Ultra-Plus FEG-SEM, Германия). Метод тепловой десорбции азота использовали для определения площади удельной поверхности и распределения пор по размеру. Измерения дзета-потенциала проводили с использованием анализатора Zetasizer Nano ZSP (Великобритания). Изменение рН водных суспензий наноструктур в зависимости от количества добавленной кислоты изучали с помощью многофункциональной системы автоматического титрования MPT-2 (Великобритания), интегрированной с прибором Zetasizer Nano ZSP. Рентгеноструктур-ный анализ (РФА) проводили на дифрактометре Shimadzu XRD 6000 (Япония), работающем с CoKa-излучением при 40 кВ и 30 мА. Качественный анализ был выполнен с использованием базы данных PDF-2 Release 2014. Свойства поверхности образцов исследовали методом ИК-спектроскопии с помощью спектрометра Nicolet 5700, США. Измерения рН проводили с помощью рН-метра Мультитест ИПЛ-103 (Россия).
Концентрацию кислотных и основных центров на поверхности нанолистовых структур определяли с помощью адсорбции одноосновных красителей (индикаторов Гаммета) спектрофотометрическим методом. Анализ позволяет определить содержание активных центров с данным значением рКа на поверхности исследуемого образца по формуле
где D0 - оптическая плотность исходного водного раствора индикатора заданной концентрации; -оптическая плотность водного или спиртового раствора индикатора, содержащего навеску заданной массы исследуемого вещества после адсорбции в течение 24 ч; D2 - водный или спиртовой раствор содержащего навеску заданной массы исследуемого вещества с добавленным через 24 ч индикатором; С ш - концентрация индикатора в растворе; Ум - объем раствора индикатора, взятый для анализа; т} и т2 - массы соответствующих навесок; знак «±» соответствует разнонаправленному изменению D1 и D2 относительно D0.
Для изучения адсорбции кислотных и основных индикаторов образцы нанолистовых структур массой т1=0,1 ± 0,001 г помещали в сухие емкости, заливали 3 мл раствора индикатора с определенной концентрацией, перемешивали и выдерживали в течение 24 ч. После этого разбавляли 2 мл дистиллированной воды, выдерживали 10 мин и измеряли значение оптической плотности (Ф1) при
Таблица 1/Table 1
Основные характеристики индикаторов гаммета Main characteristics of Gammet indicators
Название/Name Молекулярная масса/ Molecular mass Константа диссоциации (pKa)/ Dissociation constant (pKa) Длина волны в максимуме поглощения (X )/ v max7 The wavelength at the absorption maximum (Xmax)
Метиловый фиолетовый/ Methyl violet 364,91 г/моль 0,3 585 нм
Бриллиантовый зеленый/ Brilliant green 482,64 г/моль 1,3 610 нм
Метилоранж/ Methyl orange 327,33 г/моль 3,5 464 нм
Метиловый красный/ Methyl red 269,3 г/моль 5,2 530 нм
Бромтимоловый синий/ Bromothymol blue 669,97 г/моль 7,3 540 нм
Ализариновый красный/ Alizarin red 240,2 г/моль 10,5 425 нм
Индигокармин/Indigocarmine
422,38 г/моль
12,8
б10 нм
Таблица 2/Table 2
Основные характеристики тестовых клеточных культур Main characteristics of test cell cultures
Название/ Name
Описание/Description
Условия культивирования/Cultivation conditions
HeLa
А549
PyMT
MDA
B16F10
Карцинома шейки матки, морфология клеток эпителиальная/ Cervical carcinoma, epithelial cell morphology
Аденокарцинома, морфология клеток эпителиальная/ Adenocarcinoma, epithelial cell morphology
Первичные клетки опухоли молочной железы/ Primary breast tumor cells Аденокарцинома, морфология клеток эпителиальная/
Adenocarcinoma, epithelial cell morphology Меланома, клетки веретенообразные и эпителиальные/ Melanoma, fusiform and epithelial cells
Питательная среда MEM с добавлением 10 % фе-тальной бычьей сыворотки, 2мМ L-глутамина и 1 % пенициллин/стрептомицина/ MEM culture medium supplemented with 10 % fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1 % penicillin / streptomycin
Питательная среда DMEM с добавлением 10 % фе-тальной бычьей сыворотки, 2мМ L-глутамина и 1 %
пенициллин/стрептомицина/ DMEM culture medium supplemented with 10 % fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1 % penicillin / streptomycin
длине волны (^та), соответствующей максимуму поглощения каждого индикатора. Параллельно брали навеску структур (т2) помещали в сухую емкость, заливали 2 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение 24 ч. После чего раствор декантировали в другую емкость и приливали 3 мл раствора индикатора, выдерживали 10 мин и измеряли значение оптической плотности (D2). В сухую емкость приливали 3 мл раствора индикатора и приливали 2 мл дистиллированной воды. Выдерживали 10 мин и измеряли значение оптической плотности (D0). Оптическую плотность растворов определяли в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Для исследований применяли ряд красителей Гаммета (табл. 1), которые позволяют регистрировать кислотно-основные центры в диапазоне рКа от 0,3 до 12,8. Кроме того, использованы различные линии опухолевых клеток (табл. 2), полученные
из Американской коллекции типовых культур. Культивирование клеток проводили в 96-луночных планшетах при температуре 37 ± 1 °С и 5 % CO2 в течение 24 ч. Конечная концентрация клеток составила 1х104 клеток/100 мкл в лунке 96-луночного планшета.
Анализ жизнеспособности клеток in vitro проводили при помощи теста PrestoBlue™ Cell Viability Reagent, основанного на использовании ароматического соединения резазурина, который при добавлении к живым клеткам восстанавливается в розовый флуоресцирующий резофурин. Суспензии нанолистовых структур в клеточной среде подготавливали в концентрациях от 0,001 мг/мл до 10 мг/мл. Клетки со структурами инкубировали в 96-луночных микропланшетах при температуре 37 ± 1 °С и 5 % CO2 в течение 24 ч. После инкубирования питательную среду осторожно удаляли при помощи аспиратора и два раза промывали клетки
раствором фосфатного буфера Дульбекко. Для проведения теста в каждую лунку добавляли по 100 мкл питательной среды и по 10 мкл раствора PrestBlue. Проводили инкубацию при 37 ± 1 °С и 5 % CO2 в течение 1 ч, затем определяли флуоресценцию при помощи микропланшетного фотометра Tecan (Австрия). Дополнительно токсичность исследовали при помощи метода CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay. Анализ проводили аналогично, за исключением того, что планшеты использовались непрозрачные. В обоих экспериментах контрольной группой служили клетки без добавления структур.
Количественные данные представлены как средние и стандартные ошибки. Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
а/а
Результаты
В результате окисления водой электровзрывного порошка АШ/А1 был получен образец в фазе бе-мита А100Н, представляющий собой складчатые нанолисты псевдобемита, равномерно собранные в агломераты размером 0,5-2 мкм с морфологией наноцветов (рис. 1а, б). Планарный размер отдельных нанолистов агломератов достигал 200 нм, толщина нанолистов до 5 нм. При дальнейшем прокаливании образца А100Н при 650 °С происходило удаление адсорбированной и кристаллизационной воды и был получен образец у-А1203, морфология нанолистов бемита практически не изменялась (рис. 1в, г). При прокаливании образца А100Н при 1000 °С получали образец 0-А1203. Для данного образца происходило уменьшение планарного размера нанолистов до 100 нм (рис. 1д, е).
Рис. 1. Изображения образцов, полученные при помощи ПЭМ (а, в, д) и СЭМ (б, г, е) нанолистовых структур: AlOOH (a, б); Y-Al203 (в, г) Fig. 1. images of samples obtained using ТЕМ (a, c, e) and SEM (b, d, f) of nanosheet structures: AlOOH (a, b);
Y-AI2O3 (c, d)
Рис. 2. ПЭМ-изображения нанолистовых структур: AlOOH (a); Y-Al2O3 (б) и 0-Al2O3 (в) Fig. 2. ТЕМ images of nanosheet structures: AlOOH (a); Y-AI2O3 (b) and 9-AI2O3 (c)
При детальном исследовании морфологии образцов при помощи ПЭМ высокого разрешения (рис. 2) установлено, что в то время как для образцов AlOOH (рис. 2а) и y-Al2O3 (рис. 2б) толщина нанолистов не изменялась и составляла 2-5 нм, в образце 0-Al2O3 тонкие фрагменты нанолистов (2-5 нм) практически полностью исчезали и толщина нанолистов увеличивалась до 20 нм (рис. 2в). При этом на вставках к рис. 2 видно, что форма и размер доменов, из которых состоят нанолисты, не изменялись. Полученные результаты хорошо согласуются с данными, описанными в работе S.V. Tsybulya et al. [26], где показано, что при прокаливании низкотемпературных форм оксида алюминия первичная структура и размер доменов сохраняются.
По данным рентгенофазового анализа синтезированных образцов основные пики на дифрак-тограмме образца AlOOH (рис. 3a) соответствуют кристаллическому бемиту (PDF № 00-05-0190). В результате термической обработки структур AlOOH происходят фазовые переходы, характерные для оксидов и гидроксидов алюминия. На рентгенограмме образца, прокаленного при 650 °С (рис. 3б), появляется новый набор рефлексов, относящийся к фазе Y-Al2O3 (PDF № 00-029-0063). При дальнейшем повышении температуры до 1000 °С происходит переход y-Al2O3 в новое фазовое состояние. На рентгенограмме образца, прокаленного при 1000 °С (рис. 3в), основные рефлексы соответствуют 0-Al2O3 (PDF №2 00-035-0121). Отсутствие кристаллических линий и рефлексов на картине электронной микродифракции AlOOH (рис. 1а) и y-Al2O3 (рис. 1в), а также уширение пиков, на соответствующих рентгенограммах (рис. 3a, б), свидетельствуют об отсутствии дальнего порядка в расположении атомов и аморфной структуре образцов. Для 9-Al2O3 характерна более упорядоченная структура. Однако на картине микродифракции 9-Al2O3 (рис. 1д) наблюдались рефлексы, принадлежащие плоскостям с разной ориентацией, что говорит о сохранении слоистой структуры 9-Al2O3.
Таким образом, в результате прокаливания синтезированных нанолистовых структур сохраняется
Рис. 3. Рентгеноструктурный анализ образцов нанолистовых
структур: AlOOH (a); Y-Al2O3 (б) и 6-Al203 (в) Fig. 3. X-ray structural analysis of samples of nanosheet structures: AlOOH (a); Y-Al2O3 (b) and 9-Al2O3 (c)
морфология образцов, при этом изменяется фазовый состав и увеличивается степень кристалличности. В результате прокаливания также происходит снижение величины удельной поверхности. Удельная поверхность А100Ы, рассчитанная методом БЭТ, составила 284 м2/г, для у-А1203 - 246 м2/г, для 0-А12О3 - 199 м2/г. Кроме того, с увеличением температуры прокаливания происходило уменьшение объема пор и увеличение их среднего размера с 4 до 12 нм. Вероятно, это обусловлено удалением кристаллической воды из межслоевого пространства и спеканием нанолистов.
Поверхность образцов была исследована методом ИК-спектроскопии (рис. 4). Для у-А1203 и 0-А12О3 наблюдались изменения в области 37003000 см-1, которая соответствует валентным колебаниям ОН-групп. Для А100Ы, помимо широкой полосы в области 3200-3500 см-1, обусловленной валентными колебаниями ОН-групп в молекулах Ы20, характерны поверхностные ОН-группы, связанные с тремя атомами алюминия (3090 см-1), входящими в состав краевых фрагментов плоскости (201). Для образцов у-А1203 и 9-А1203 полоса
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 4. ИК-спектры образцов
нанолистовых структур Fig. 4. iR spectra of samples of nanosheet structures
Рис. 5. Дзета-потенциал образцов нанолистовых структур Fig. 5. Zeta potential of samples of nanosheet structures
поглощения для ОН-групп, связанных с тремя атомами алюминия, и полоса поглощения в области 1073 см-1, обусловленная деформационными колебаниями ОН-групп, отсутствовали. Снижение интенсивностей полос для у-А1203 и 0-А12О3 может быть связано с частичным удалением поверхностных ОН-групп при прокаливании.
Величина дзета-потенциала наночастиц и наноструктур определяет эффективность их взаимодействия с биологическими объектами. На рис. 5 представлены зависимости дзета-потенциала синтезированных нанолистовых структур от рН среды. Все синтезированные наноструктуры при рН=7,2 и температуре 37 °С имели положительный дзета-потенциал. Дзета-потенциал АЮОН составил 30,8 ± 0,2 мВ, у-А1203 и е-А1203 - 12,5 ± 0,3 мВ. Следует отметить, что дзета-потенциал АЮОН практически не изменялся в широком диапазоне рН (от 3 до 8), в то время как дзета-потенциал у-А12О3 и е-А12О3 уменьшался с увеличением рН в приведенном диапазоне. Синтезированные наноструктуры также характеризуются различным рН изоэлектрического состояния (рНТНЗ). Для псевдобемита рНТНЗ=9,52, для у-А12О3 рНТНЗ=8,61, для е-А12О3 рНТНЗ=8,92. Как видно, дзета-потенциал у-А12О3 и е-А12О3, а также рНТНЗ меньше, чем у АЮОН, что может быть обу-
словлено появлением большего числа основных центров или уменьшением числа кислотных центров на поверхности данных оксидов в результате термообработки.
В экспериментах по исследованию цитоток-сичности in vitro на примере 5 клеточных линий опухолевых клеток было установлено, что все синтезированные нанолистовые структуры подавляли жизнеспособность опухолевых клеток (рис. 6, кривые AlOOH). Следует отметить, что синтезированные структуры имели довольно крупные размеры (0,4-2,5 мкм), не позволяющие им проникать внутрь клетки [27, 28].
Подавление жизнеспособности клеточных линий достигалось при использовании концентрации структур в питательной среде от 1 мг/мл. В меньшей концентрации нанолистовые структуры не оказывали цитотоксического действия и даже стимулировали рост клеток (рис. 6). При исследовании изменения рН клеточной среды в присутствии нанолистовых структур было установлено, что все синтезированные структуры практически в равной степени изменяли рН питательной среды. При концентрации наноструктур 5 мг/мл величина рН питательной среды увеличивается с увеличением времени выдержки по параболическому закону и
Рис. 7. Распределение кислотно-основных центров на поверхности нанолистовых структур Fig. 7. Distribution of acid-base centers on the surface of nano-sheet structures
Рис. 6. Цитотоксичность нанолистовых структур, определенная при помощи тестов PrestoBlue™ Cell Viability
Reagent (а) и CellTiter-Glo (б) Fig. 6. Cytotoxicity of nanosheet structures determined using the Presto-Blue ™ Cell Viability Reagent (a) and CellTiter-Glo (b) tests
выходит на постоянные значения рН через 8 ч экспозиции. Это свидетельствовало о том, что синтезированные структуры в питательной среде проявляли основные свойства. При этом в начальный момент времени (до 40 мин) скорость роста рН была максимальной в присутствии AlOOH и минимальной в присутствии 0-Al2O3. После 40 мин экспозиции скорость роста рН питательной среды становилась максимальной в присутствии y-Al2O3. Через 500 мин экспозиции AlOOH поднимал рН питательной среды до 9,04, y-Al2O3 - до 9,12, 0-Al2O3 - до 9,05. Полученные данные коррелировали с данными адсорбции индикаторов на поверхности синтезированных структур (рис. 7).
Анализ результатов цитологических экспериментов показывает, что наибольшее влияние на жизнеспособность клеточных линий оказали структуры y-Al2O3. Такой эффект может реали-зовываться за счет ряда механизмов или их совокупности и включать повреждение клеточной мембраны, недостаток питательных веществ за счет их адсорбции на пористых структурах, деполяризацию мембраны.
На поверхности всех полученных структур присутствовали основные бренстедовские центры 3 типов: слабоосновные (близкие к нейтральным) с рК 7,4; основные центры средней силы с рК 10,5 и сильные основные центры с рК 12,8. Количество слабоосновных центров на поверхности было значительно больше у структур AlOOH (7,7*10-6 моль/г). Основные центры средней силы незначительно преобладали на поверхности 9-Al2O3 (18,9*10-6 моль/г) по сравнению с y-Al2O3 (16,01* 10-6 моль/г) и AlOOH (16,7*10-6 моль/г). Сильноосновные центры преобладали на поверхности AlOOH (6,6*10-6 моль/г) по сравнению с y-Al2O3 (5,4*10-6 моль/г) и 9-Al2O3 (3,2*10-6 моль/г). Кислотных центров Бренстеда на поверхности синтезированных структур было значительно меньше, чем основных. Стоит отметить, что на поверхности находились преимущественно слабокислотные центры в концентрациях: 9-Al2O3 -7,09х10-6 моль/г, y-Al2O3 - 0,99х10-6 моль/г и AlOOH -3,05х10-6 моль/г.
синтезированных наноструктур заключалось в том, что отношение суммарного количества основных центров на поверхности структур у-А1203 в 11 раз больше, чем кислотных. Основных центров А100Ы в 6,5 раза больше, чем кислотных, у 0-А12О3 основных центров в 3 раза больше, чем кислотных. Это обстоятельство свидетельствует о том, что разница в противоопухолевом действии синтезированных наноструктур, представленная выше, может быть обусловлена способностью у-А1203 проявлять более выраженные антацидные свойства, т.е. дольше нейтрализовать протоны, выделяемые опухолевыми клетками.
Таким образом, активность в отношении опухолевых клеток синтезированных структур обусловлена не только повышением величины рН микроокружения клеток, но и возможностью дольше поддерживать щелочность микроокружения за счет адсорбции протонов, выделяемых опухолевыми клетками.
Обсуждение
Согласно полученным в исследовании данным, цитотоксический эффект нанолистовых структур прежде всего связан со свойствами их поверхности, такими как заряд, высокая удельная поверхность, адсорбционные и кислотно-основные свойства. Все вышеперечисленные свойства способны нарушить ионный баланс и кислотность микроокружения опухолевых клеток. Главное отличие кислотно-основных характеристик поверхности
Заключение
Проведенные исследования показали, что синтезированные нанолистовые структуры на основе оксидных и гидроксидных фаз алюминия подавляют жизнеспособность опухолевых клеток. Установлено, что наноструктуры у-А1203 обладают наибольшей цитотоксичностью благодаря наибольшему показателю, выражающему отношение суммарного количества основных центров на поверхности структур к кислотным центрам.
^HTEPATyPÄ/REFERENCES
1. Davis M.E., Chen Z.G., Shin D.M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat Rev Drug Discov. 2008 Sep; 7(9): 771-82. doi: 10.1038/nrd2614.
2. Cho Y., Lee J.B., Hong J. Controlled release of an anti-cancer drug from DNA structured nano-films. Sci Rep. 2014 Feb 12; 4: 4078. doi: 10.1038/srep04078.
3. Shu Y., ShuD., HaqueF., GuoP. Fabrication of pRNA nanoparticles to deliver therapeutic RNAs and bioactive compounds into tumor cells. Nat Protoc. 2013 Sep; 8(9): 1635-59. doi: 10.1038/nprot.2013.097.
4. Hauert S., Bhatia S.N. Mechanisms of cooperation in cancer na-nomedicine: towards systems nanotechnology. Trends Biotechnol. 2014 Sep; 32(9): 448-55. doi: 10.1016/j.tibtech.2014.06.010.
5. Mikhaylov G., Klimpel D., Schaschke N., Mikac U., VizovisekM., Fonovic M., Turk V., Turk B., Vasiljeva O. Selective targeting of tumor and stromal cells by a nanocarrier system displaying lipidated cathepsin B inhibitor. Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Sep 15; 53(38): 10077-81. doi: 10.1002/anie.201402305.
6. Mikhaylov G., Mikac U., Magaeva A.A., Itin V.I., Naiden E.P., Psa-khye I., Babes L., Reinheckel T., Peters C., Zeiser R., Bogyo M., Turk V., Psakhye S.G., TurkB., Vasiljeva O. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug-delivery system for targeting tumours and their microenvironment. Nat Nanotechnol. 2011 Aug 7; 6(9): 594-602. doi: 10.1038/nnano.2011.112.
7. Kumar C.S., MohammadF. Magnetic nanomaterials for hyperther-mia-based therapy and controlled drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2011 Aug 14; 63(9): 789-808. doi: 10.1016/j.addr.2011.03.008.
8. Verma A., Stellacci F. Effect of surface properties on nanopar-ticle-cell interactions. Small. 2010 Jan; 6(1): 12-21. doi: 10.1002/ smll.200901158.
9. PatraH.K., Dasgupta A.K. Cancer cell response to nanoparticles: criticality and optimality. Nanomedicine. 2012 Aug; 8(6): 842-52. doi: 10.1016/j.nano.2011.10.009.
10. Petros R.A., DeSimone J.M. Strategies in the design of nanopar-ticles for therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 2010 Aug; 9(8): 615-27. doi: 10.1038/nrd2591.
11. Li Y., Tian Y., Nie G. Antineoplastic activities of Gd@C(OH) nanoparticles: tumor microenvironment regulation. Sci China Life Sci. 2012 Oct; 55(10): 884-90. doi: 10.1007/s11427-012-4387-7.
12. Li M., Ren L., Li L., He P., Lan G., Zhang Y., Yang K. Cytotoxic Effect on Osteosarcoma MG-63 Cells by Degradation of Magnesium. J Materials Scien Technol. 2014; 30(9): 888-93. doi: 10.1016/j. jmst.2014.04.010.
13. Zhang Y., Ren L., Li M., Lin X., Zhao H., Yang K. Preliminary study on cytotoxic effect of biodegradation of magnesium on cancer cells. J Materials Scien Technol. 2012; 28(9): 769-72. doi: 10.1016/S1005-0302(12)60128-5.
14. Sonveaux P., Vegran F., Schroeder T., Wergin M.C., Verrax J., Rabbani Z.N., De Saedeleer C.J., Kennedy K.M., Diepart C., Jordan B.F., Kelley M.J., Gallez B., Wahl M.L., Feron O., Dewhirst M.W. Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice. J Clin Invest. 2008 Dec; 118(12): 3930-42. doi: 10.1172/JCI36843.
15. Gillies R.J., Raghunand N., Garcia-Martin M.L., Gatenby R.A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 2004; 23(5): 57-64. doi: 10.1109/ memb.2004.1360409.
16. De Milito A., Canese R., Marino M.L., Borghi M., Iero M., Villa A., Venturi G., Lozupone F., Iessi E., Logozzi M., Della Mina P., Santinami M., Rodolfo M., Podo F., Rivoltini L., Fais S. pH-dependent antitumor activity of proton pump inhibitors against human melanoma is mediated by inhibition of tumor acidity. Int J Cancer. 2010 Jul 1; 127(1): 207-19. doi: 10.1002/ijc.25009.
17. SpugniniE.P., Buglioni S., CarocciF., FrancescoM., VincenziB., Fanciulli M., Fais S. High dose lansoprazole combined with metronomic chemotherapy: a phase I/II study in companion animals with spontaneously occurring tumors. J Transl Med. 2014 Aug 21; 12: 225. doi: 10.1186/ s12967-014-0225-y.
18. Meng H., Mai W.X., Zhang H., Xue M., Xia T., Lm S., Wang X., Zhao Y., Ji Z., Zink J.I., Nel A.E. Codelivery of an optimal drug/siRNA combination using mesoporous silica nanoparticles to overcome drug resistance in breast cancer in vitro and in vivo. ACS Nano. 2013; 7(2): 994-1005. doi: 10.1021/nn3044066.
19. Khawar I.A., Kim J.H., Kuh H.J. Improving drug delivery to solid tumors: priming the tumor microenvironment. J Control Release. 2015 Mar 10; 201: 78-89. doi: 10.1016/j.jconrel.2014.12.018.
20. Kim S.S., Rait A., Kim E., Pirollo K.F., Chang E.H. A tumortargeting p53 nanodelivery system limits chemoresistance to temozolomide
prolonging survival in a mouse model of glioblastoma multiforme. Nano-medicine. 2015 Feb; 11(2): 301-11. doi: 10.1016/j.nano.2014.09.005.
21. KanamalaM., Wilson W.R., YangM., PalmerB.D., Wu Z. Mechanisms and biomaterials in pH-responsive tumour targeted drug delivery: A review. Biomaterials. 2016 Apr; 85: 152-67. doi: 10.1016/j.biomateri-als.2016.01.061.
22. Taylor S., Spugnini E.P., Assaraf Y.G., Azzarito T., Rauch C., Fais S. Microenvironment acidity as a major determinant of tumor chemoresistance: Proton pump inhibitors (PPls) as a novel therapeutic approach. Drug Resist Updat. 2015 Nov; 23: 69-78. doi: 10.1016/j. drup.2015.08.004.
23. Walsh M., Fais S., Spugnini E.P., Harguindey S., Abu Izneid T., Scacco L., Williams P., Allegrucci C., Rauch C., Omran Z. Proton pump inhibitors for the treatment of cancer in companion animals. J Exp Clin Cancer Res. 2015 Sep 4; 34(1): 93. doi: 10.1186/s13046-015-0204-z.
24. Bakina O.V., SvarovskayaN.V., GlazkovaE.A., LozhkomoevA.S. Flower-shaped ALOOH nanostructures synthesized by the reaction of an
AlN/Al composite nanopowder in water. Advanced Powder Technology. 2015; 26(6): 1512-19. doi: 10.1186/s13046-015-0204-z.
25. Lerner M.I., Pervikov A.V., Lozhkomoev A.S., Bakina O.V. Synthesis of Al nanoparticles and Al/AlN composite nanoparticles by electrical explosion of aluminum wires in argon and nitrogen. Advanced Powder Technology. 2016; 295: 307-314. doi: 10.1016/j.powtec.2016.04.005.
26. Tsybulya S.V., Kryukova G.N. Nanocrystalline transition aluminas: Nanostructure and features of x-ray powder diffraction patterns of low-temperature Al2O3 polymorphs. Physical Review B. 2008; 77(2); 024112-024125. doi: 10.1103/PhysRevB.77.024112.
27. Zhang S., Li J., Lykotrafitis G., Bao G., Suresh S. Size-Dependent Endocytosis of Nanoparticles. Adv Mater. 2009; 21: 419-424. doi: 10.1002/ adma.200801393.
28. Jiang W, Kim B.Y., Rutka J.T., Chan W.C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nat Nanotechnol. 2008 Mar; 3(3): 145-50. doi: 10.1038/nnano.2008.30.
Поступила/Received 04.03.2021 Принята в печать/Accepted 18.06.2021
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Ложкомоев Александр Сергеевич, кандидат химических наук, заведующий лабораторией, Институт физики прочности и материаловедения, Сибирское отделение Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: asl@ispms.tsc.ru. Researcher ID (WOS): O-3024-2013. Author ID (Scopus): 26664893000. ORCID: 0000-0002-1564-0858.
Бакина Ольга Владимировна, кандидат химических наук, научный сотрудник, Институт физики прочности и материаловедения, Сибирское отделение Российской академии наук (г. Томск, Россия). SPIN-код: 9002-1344. Researcher ID (WOS): A-3184-2014. Author ID (Scopus): 57200860509.
Казанцев Сергей Олегович, младший научный сотрудник, Институт физики прочности и материаловедения, Сибирское отделение Российской академии наук (г. Томск, Россия). SPIN-код: 25290738. Researcher ID (WOS): A-9259-2019. Author ID (Scopus): 56985661000. ORCID: 0000-0002-1728-7947.
Иванова Людмила Юрьевна, младший научный сотрудник, Институт физики прочности и материаловедения, Сибирское отделение Российской академии наук (г. Томск, Россия). AuthorID (РИНЦ): 745429. Researcher ID (WOS): E-5777-2014. Author ID (Scopus): 55793393700. ORCID: 0000-0003-1953-307X.
Августинович Александра Владимировна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). SPIN-код: 2952-6119. Researcher ID (WOS): D-6062-2012. Author ID (Scopus): 56392965300. ORCID: 0000-0001-7301-7581.
Афанасьев Сергей Геннадьевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением абдоминальной онкологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: afanasievsg@oncology.tomsk.ru. SPIN-код: 9206-3037. Researcher ID (WOS): D-2084-2012. Author ID (Scopus): 21333316900. ORCID: 0000-0002-4701-0375.
Спирина Людмила Викторовна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г Томск, Россия). SPIN-код: 1336-8363. Researcher ID (WOS): A-7760-2012. Author ID (Scopus): 36960462500. ORCID: 0000-0002-5269-736X. Добродеев Алексей Юрьевич, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения абдоминальной онкологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). SPIN-код: 5510-4043. AuthorID (РИНЦ): 312703. ORCID: 0000-0002-2748-0644. Researcher ID (WOS): B-5644-2017. Author ID (Scopus): 24832974200.
вклад авторов
Ложкомоев Александр Сергеевич: литературный обзор, анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Бакина Ольга Владимировна: разработка концепции статьи, статистическая обработка, составление черновика рукописи. Казанцев Сергей Олегович: сбор и обработка данных. Иванова Людмила Юрьевна: сбор и обработка данных.
Августинович Александра Владимировна: разработка концепции научной работы, составление черновика рукописи. Афанасьев Сергей Геннадьевич: анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Спирина Людмила Викторовна: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Добродеев Алексей Юрьевич: анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов. Финансирование
Работа выполнена в рамках государственного задания ИФПМ СО РАН, тема номер FWRW-2019-0033.
about the authors
Aleksandr S. Lozhkomoev, PhD, Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: asl@ispms.tsc.ru. Researcher ID (WOS): 0-3024-2013. Author ID (Scopus): 26664893000. ORCID: 0000-0002-1564-0858.
Olga V. Bakina, DSc, Researcher, Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): A-3184-2014. Author ID (Scopus): 57200860509.
Sergey O. Kazantsev, Junior Researcher, Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): A-9259-2019. Author ID (Scopus): 56985661000. ORCID: 0000-0002-1728-7947. Lyudmila Yu. Ivanova, Junior Researcher, Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): E-5777-2014. Author ID (Scopus): 55793393700. ORCID: 0000-0003-1953-307X. Aleksandra V. Avgustinovich, MD, PhD, Senior Researcher, Department of Abdominal Oncology, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): D-6062-2012. Author ID (Scopus): 56392965300. ORCID: 0000-0001-7301-7581.
Sergey G. Afanasyev, MD, DSc, Professor, Head of the Department of Abdominal Oncology, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID: D-2084-2012. Author ID (Scopus): 21333316900. ORCID: 0000-0002-4701-0375.
Lyudmila V. Spirina, DSc, Senior Researcher, Laboratory of Tumor Biochemistry, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): A-7760-2012. Author ID (Scopus): 36960462500.
Alexey Yu. Dobrodeev, MD, DSc, Leading Researcher, Department of Abdominal Oncology, Oncology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: dobrodeev@oncology.tomsk.ru. ORCID: 0000-0002-2748-0644. Researcher ID (WOS): B-5644-2017. Author ID (Scopus): 24832974200.
author contribution
Aleksandr S. Lozhkomoev: literature review, study analysis, critical revision of manuscript for important intellectual content. Olga V. Bakina: study conception, statistical analysis, drafting of the manuscript. Sergey O. Kazantsev: data collection and analysis. Lyudmila Y. Ivanova: data collection and analysis.
Aleksandra V. Avgustinovich: study conception, drafting of the manuscript.
Sergey G. Afanasyev: study analysis, critical revision of manuscript for important intellectual content. Lyudmila V. Spirina: data collection and analysis, critical revision of manuscript for important intellectual content. Alexey Yu. Dobrodeev: study analysis, critical revision of manuscript for important intellectual content.
Funding
The work was carried out within the framework of the state assignment of the ISPMS SB RAS (FWRW-2019- 0033).
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest.
