CC BY
37
А. Я. Оксман, М. В. Доброгорская, М. С. Климова, Г. А. Сакута, В. И. Морозов
ЦИТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ НЕСТЕРОИДНОГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ГЛЮКУРАЛ (ВОДОРАСТВОРИМЫЙ КОМПЛЕКС ]\-МЕТИЛ-Б-ГЛЮКОЗАМИНА С 6-МЕТИЛУРАЦИЛОМ)
Авторы посвящают эту статью сотрудникам кафедры генетики Санкт-Петербургского Государственного Университета кандидату биологических наук В. В. Савицкому и доктору биологических наук Е. М. Лучниковой, принимавшим участие в выполнении данной работы
Большие усилия, затраченные исследователями в направлении создания нестероидных противовоспалительных препаратов (НСПП), лишенных известных недостатков у широко применявшихся ранее стероидов, привели к созданию ряда веществ, обладающих общим свойством подавлять воспалительные реакции. Глюкурал, хорошо зарекомендовавший себя при лечении острых воспалений почек, является одним из НСПП. Исследования глюкурала, проведенные в США и России, обнаружили ранее не известное свойство глюкурала: его способность защищать клетки от воздействия неблагоприятных факторов среды (цитопротекторное действие) и позволили в определенной мере раскрыть механизм этой защиты [19]. Данные исследования открыли обширные дополнительные возможности практического применения глюкурала в медицине, биотехнологии и пищевой промышленности. Глюкурал (синоним — амиглурацил)—водорастворимый комплекс 2,4-дигидрокси-6-метилпиримидина (6-метилурацил) и М-метил-В-глюкозамина — первоначально был синтезирован для лечения острых воспалений почек [14-16], а недавно появился и фармпрепарат, в состав которого включен глюкурал в качестве соединения, обладающего противовоспалительной активностью. Высокая водо-растворимость (более 40 мг/мл при 37°С), очень низкий уровень токсического действия ^Вбо более 2 г/кг массы для мышей), стабильность препарата делают его весьма удобным для внутривенных инъекций [14, 19]. Препарат прошел испытания на животных, показав высокую эффективность при лечении экспериментальных нефрозов. Были получены и некоторые данные, указывающие, как стало ясно сейчас, на цитопротектор-ное действие препарата, которые, однако, были ошибочно истолкованы авторами как стимуляция клеточного роста [14]. Цель настоящей работы состояла в исследовании 1) способности глюкурала защищать клетки от действия неблагоприятных факторов среды и 2) механизма, лежащего в основе этой защиты. Цитопротекторные свойства глюкурала были изучены на штамме дрожжей, имеющем низкую жизнеспособность, раковых и иммортализованных клетках млекопитающих в культуре, первичных культурах эндотелиальных клеток из вен пуповинного канатика человека и, наконец, на целом организме — мухе дрозофиле.
Условия эксперимента
Штаммы дрож.ж.ей. В экспериментах использовали ряд клеточных культур. Гаплоидный штамм р80-1513-П4 8аосЬагаш1се8 cerevisiae был получен из коллекции
© А. Я. Оксман, М. В. Доброгорская, М. С. Климова, Г. А. Сакута, В. И. Морозов, 2010
дрожжевых штаммов кафедры генетики СПбГУ. В силу низкой жизнеспособности при лиофильном высушивании этого штамма в среде, содержащей 2,5% желатина и 2,5% глюкозы, выживает всего 0,01% клеток. Дрожжи выращивали в среде УРД. В экспериментах с дрозофилами в качестве корма использовали дрожжи из Петергофской коллекции: штамм дикого типа 2-П7 12 и нистатин-резистентный штамм 9-2-П7 12. Насекомые не синтезируют стерины, поэтому состав пищи позволяет менять и состав стеринов. У нистатин-резистентных дрожжей не завершен синтез холестерина (основной стерин клеточной мембраны), что определяет нестабильность клеточных мембран у питающихся ими мух [3].
Культуры клеток. Суспензионную культуру клеток эритролейкемии мыши MEL культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки [23]. В этой же среде выращивали культуру иммортализованных моноцитов человека THP-1 [5]. Первичную культуру эндотелиальных клеток человека получали из вен пуповинного канатика. Выделение клеток проводили с помощью трипсина, следуя рекомендациям фирмы Serva. Каждую серию опытов проводили на одном изоляте, поскольку изоляты могут существенно различаться по жизнеспособности. Выращивали эндотелиоциты в чашках Петри в среде М199, дополненной 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 10 нг/мл эпидермального фактора роста [13]. Эксперименты с культурами клеток млекопитающих MEL, THP-1 и эндотелиоцитами выполнены с использованием реактивов и сред фирмы Gibco (США).
Применение глюкурала. При изучении действия глюкурала клетки MEL суспендировали в среде RPMI 1640 (106 клеток в 1 мл), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также 10% ДМСО и глюкурал в различных концентрациях. Дополнительные повреждения клеток вызывали двукратным замораживанием (-135°С) — оттаиванием (37°С) сразу после суспендирования в среде. Далее клетки отмывали от ДМСО и переводили в ростовую среду, в которой они росли в обычных условиях в течение 2 сут. Повреждения моноцитов THP-1 (106 клеток в 1 мл) инициировали, экспонируя культуру 1,5 ч в присутствии 10% ДМСО и глюкурала в различных концентрациях, далее клетки переносили в обычную ростовую среду и выращивали в течение 1 сут. Цитопротекторное действие глюкурала оценивали при выращивании клеток без смены среды в течение 7 сут. (голодание), а также при воздействии на клетки TNF-a. Долю живых клеток в культурах после повреждающих воздействий определяли по исключению красителя трипанового синего. Оптимальные цитопротекторные дозы глю-курала определяли в условиях длительного роста клеток всех типов без смены среды (голодание) в течении 2-7 сут.
Влияние глюкурала на мутагенное действие ионизирующего излучения исследовали в двух экспериментах, выполненных на Drosophila melanogaster, оценивая частоту мутаций, вызванных ионизирующим излучением [3]. В экспериментах создавали различную стабильность клеточных мембран насекомых. В первой серии опытов мухи получали в качестве корма дрожжи дикого типа (штамм 2-П7 12), во второй серии мух кормили нистатин-резистентными дрожжами (штамм 9-2-П7 12) с измененным составом стери-нов, определяющим меньшую стабильность клеточных мембран дрозофилы, чем при питании дрожжами дикого типа.
Глюкурал и полиеновый антибиотик амфотерицин В (дестабилизатор биологических мембран, способный комплексироваться со стеринами мембран и создавать поры для утечки калия из клеток) добавляли в корм насекомых. Мух содержали на определенном корме 5 сут., подвергали облучению в дозе 1000 рентген и сразу скрещивали с самцами из линии анализатора. Частоту мутаций у потомков — потерю Х-хромосомы
(исключительные самцы) — определяли по отношению в потомстве числа исключительных самцов к числу обычных самок.
Для приготовления гомогенатов скелетных мышц были использованы 4-5-месячные самцы белых беспородных крыс весом 250-350 г. Крыс содержали в стандартных условиях вивария. Пищу и воду животные получали ad libidum. В экспериментах были использованы 23 крысы, разделенные на контрольную и опытную группы. Крыс дека-питировали, извлекали мышцы задних конечностей, взвешивали, измельчали ножницами на льду в чашке Петри 10 мин и далее гомогенизировали в 10 объемах (вес : объем) PBS в стеклянном гомогенизаторе Поттера, выполняя 6 тракций тефлонового пестика. Условия гомогенизирования были подобраны таким образом, чтобы сохранить целостность лизосом. Все операции по обработке ткани проводили при температуре 4-6°С. Го-могенаты находились в ледяной бане в течение всего времени работы с ними. Глюкурал растворяли в дистиллированной воде в концентрации 2,5 мг/мл и вносили в аликвоты гомогената для создания конечной концентрации 20, 30, 50 и 100 мкг/мл гомогената. Аликвоты инкубировали 4, 24 и 48 ч при 37°С. По завершении инкубации пробы кипятили 10 мин, охлаждали и центрифугировали. В супернатантах определяли свободные а-аминогруппы с помощью нингидринной реакции. Исходя из стандартного графика, построенного по аминокислоте тирозину, рассчитывали концентрацию свободных аминокислот в пробах. Для учета влияния различий концентрации белка в гомогенатах, рассчитывали отношение (концентрация аминокислот в 1 мл супернатанта) : (концентрация белка в 1 мл гомогената).
Статистическую обработку данных проводили, используя программу Microsoft Excel. Данные представлены как X±S.D. Достоверность различий определяли по критерию Стъюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Глюкурал защищает клетки. Цитопротекторное действие глюкурала первоначально было выявлено при лиофилизации гаплоидного штамма дрожжей Saccharamices cerevisiae р80-1513-П4, обладающего низкой жизнеспособностью. Добавление глюкура-ла (25 мкг/мл) в культуру перед лиофилизацией позволило увеличить выживаемость этого штамма в 50-100 раз.
На культуре клеток мышиной эритролейкемии MEL в максимально жестких условиях (воздействие 10% ДМСО, наряду с 2-кратным замораживанием — оттаиванием), вызывающих гибель 100% клеток, обнаружили, что в присутствии глюкурала (15 и 50 мкг/мл) выживает 5 и 10% клеток соответственно, что свидетельствует о сильном цитопротекторном действии препарата.
Применение глюкурала в концентрации 500 мкг/мл (оптимальная концентрация вещества, обеспечивающая защиту эндотелиальных клеток из вен пуповинного канатика человека в условиях роста без смены среды) обеспечивает снижение гибели этих клеток в 1,5—1,7 раза при переживании в течение 7 сут. (табл. 1).
Жизнеспособность клеток, полученных в двух различных выделениях из разных пуповинных канатиков, существенно отличается. Тем не менее цитопротекторное действие препарата ярко проявляется в обоих случаях. Интересно, что, если без TNF-а в присутствии глюкурала погибших клеток в 1,5—1,7 раза меньше по сравнению с контролем, то в присутствии первичного индуктора апоптоза TNF-а различия еще более выразительны — погибших клеток оказывается в 2,5—2,8 раза меньше сравнительно с контролем без глюкурала. Глюкурал в условиях этого опыта практически полностью
Таблица 1. Влияние глюкурала на выживаемость эндотелиальных клеток из вен пуповинного канатика человека в присутствии TNF-a
Условия опыта TNF-a, нг/мл Глюкурал, мкг/мл Доля погибших клеток в монослое, %
Опыт 1 (экспозиция 6 ч) 0 0 23,9±9,8
0 500 13,8±2,7
40 0 30,3±4,7
40 500 10,9±3,4 **
Опыт 2 (экспозиция 24 ч) 0 0 8,8±0,2
0 500 5,7±0,5 **
10 0 10,3±0,1
10 500 4,1±0,4 ***
20 0 14,9±0,1
20 500 5,4±0,4 ***
Примечание. Опыты 1 и 2 — два различных выделения эндотелиоцитов. Указано время экспозиции с TNF-a и глюкуралом. N = 4 — 5; Р: * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001. Сравнение проведено с соответствующим контролем без глюкурала.
защищал клетки от действия TNF-a. Исходя из этих данных, можно думать, что до определенной степени усиление неблагоприятного воздействия на клетку усиливает и защитное действие глюкурала.
В табл. 2, а и 2, б приведены данные опытов, выполненных на иммортализованных моноцитах человека ТНР-1. Опыты 1-2 и 3-4 (табл. 2, а) проведены на двух партиях клеток, различающихся по жизнеспособности. В присутствии 10%-ного ДМСО в ростовой среде в течение 1,5 ч погибло в среднем в 2,9 раза больше клеток THP-1, чем в контроле без ДМСО. Добавление в культуральную среду глюкурала в оптимальной концентрации 25 мкг/мл привело к снижению гибели клеток THP-1 в среднем в 2,8 раза, т. е. препарат обеспечил практически полную защиту клеток от повреждения, позволив добиться уменьшения гибели клеток до контрольного уровня. При этом глюкурал никак не влиял на жизнеспособность клеток в оптимальных условиях — она оставалась на уровне контроля. Как и в случае с эндотелиоцитами можно отметить, что на фоне большего подавления жизнеспособности клеток оказалось более выраженным и цитопротекторное действие глюкурала.
Таблица 2, а. Влияние глюкурала на выживаемость культуры иммортализованных моноцитов человека ТНР-1
Условия опыта Доля погибших клеток в монослое, %
Опыт 1 Опыт 2 Опыт 3 Опыт 4
1. Контроль 3,6±1,3 6,1±2,4 4,6±1,2 3,4±1,4
2. Контроль + глюкурал 3,9±0,7 5,8±3,1 — 3,0±1,0
3. 10 % ДМСО 12,9±6,2* 18,2±5,3** 17,9±9,9* 8,8±5,2
4. 10 % ДМСО + глюкурал 4,1±1,6* 7,7±3,4** 4,6±2,2* 5,0±2,3
Примечание. Концентрация глюкурала 25 мкг/мл (оптимальная для ТНР-1 концентрация, найденная в предварительных опытах). Опыты 1—4 поставлены на различных партиях клеток. Сравнены 3 vs. 1 и 4 vs. 3. В рамках опыта N = 4; Р: * < 0,05; ** < 0,01.
В табл. 2, б представлены данные по защитному действию глюкурала на клетки ТНР-1 в условиях голодания — рост без смены среды в течение 6 сут. Интересно, что и в этом опыте защитное действие препарата ярко проявилось при ухудшении условий существования культуры клеток. Через одни сутки роста культуры, когда условия
жизни клеток достаточно комфортны, не обнаружено существенных различий между контролем и опытом. Однако на 6-е сут. культивирования количество погибших клеток в присутствии глюкурала оказывается в 2,7 и 1,8 раза ниже (опыты 1 и 2), чем в контроле, тогда как количество живых клеток напротив в 1,6—1,7 раза выше. Эти данные свидетельствуют о явном цитопротекторном действии глюкурала при ухудшении состояния среды культивирования.
Таблица 2, б. Рост двух культур моноцитов ТНР-1 в присутствии глюкурала без смены среды
Условия опыта Длительность культивирования, сут
0 1 6
1. Контроль 15,0±1,5а> 1,01±0,21ь) 16,8±1,6 1,21±0,16 58,0±4,0 1,18±0,22
1. Глюкурал (25 мкг/мл) 12,2±2,4 1,00 ±0,29 21,5±3,5*** 1,83±0,27*
2. Контроль 4,0±2,3 1,08±0. 14 5,2±0,9 1,49±0,26 57,0±13,0 1,53 ±0,30
2. Глюкурал (25 мкг/мл) 3,6±1,9 1,42±0,32 31,0±3,0** 2,67±0,57**
Примечание. а) Количество погибших клеток в %. b) Концентрация живых клеток (х106) в мл. Опыты поставлены на различных партиях клеток. В рамках опыта N = 4;
Сравнение проведено с соответствующим контролем без глюкурала. Р: * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.
На клетках MEL и THP-1 было проверено действие глюкурала в широком диапазоне доз от 20 до 500 мкг/мл в оптимальных для клеток условиях роста и достоверных различий при этом найдено не было. Выраженное цитопротекторное действие препарата, доказательства которого получены в настоящей работе, объясняет ошибочность заключения о стимуляции роста клеток под влиянием глюкурала, сделанного в ранних патентах [15]. Эффективные цитопротекторные дозы препарата по нашим данным могут различаться примерно в 20 раз в зависимости от вида клеток.
Глюкурал обладает радиопротекторными свойствами. Эксперименты, проведенные на дрозофиле, позволили показать не только отсутствие мутагенного эффекта глюкурала, но напротив его антимутагенное действие (табл. 3,а и 3,б). Частота появления исключительных самцов под действием облучения 1000 рентген в выборке мух, получавших рацион в виде дрожжей дикого штамма с добавлением глюкурала, оказалась достоверно ниже, чем в контроле. Причем с увеличением концентрации глю-курала в корме частота появления таких самцов падала до достижения оптимальной концентрации препарата, составившей 5 мкг/самка. В этой концентрации глюкурал обеспечил уменьшение частоты появления исключительных самцов примерно в 2 раза. Добавление в корм дестабилизатора клеточных мембран амфотерицина В вызывало дозозависимое увеличение частоты мутаций примерно в 2,4-2,7 раза (табл. 3,а).
Принципиально те же данные были получены при использовании в качестве корма мух стерин-дефектного штамма дрожжей с той разницей, что уровень мутаций в этом случае был существенно выше (табл. 3, б). На фоне нестабильности клеточных мембран в этом случае действие амфотерицина В оказывается более выраженным, что и определяет возросший уровень мутаций.
Полиеновый антибиотик амфотерицин B вызывает нарушения ионного гомеостаза, связанные в основном с потерей ионов калия [2], что во многом совпадает и с другими
Таблица 3,а. Влияние глюкурала и амфотерицина В на частоту мутаций — потерю Х-хромосомы в поздних ооцитах дрозофилы под действием облучения 1000 рентген на
фоне обычной диеты
Экспериментальная группа Число потомков Частота потерь Х-хромосом
Обычные самки Исключительные самцы
Контроль 2174 34 1,57±0,26
Глюкурал, мкг/самка 1,0 3585 63 1,76±0,21
2,0 2644 30 1,13±0,20*
2,5 2738 26 0,95±0,18**
5,0 3656 27 0,74±0,14***
10,0 3121 39 1,25±0,19*
Амфотерицин В, мкг/самка 1,0 3587 52 1,45±0,19
5,0 4546 98 2,16±0,21*
10,0 2681 100 3,73±0,35**
15,0 2278 97 4,26±0,41***
20,0 1038 45 4,34±0,61***
Примечание. Частота потерь Х-хромосом — отношение (исключительные самцы)/(обычные самки). Сравнение проведено с соответствующим контролем без глюкурала. N = 4 — 5; Р: * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.
Таблица 3,б. Влияние глюкурала и амфотерицина В на частоту мутаций — потерю Х-хромосомы в поздних ооцитах дрозофилы под действием облучения 1000 рентген на фоне обычной и стерин-дефектной диеты
Экспериментальная группа Число потомков Частота потерь Х-хромосом Защитный эффект глюкурала, %
Обычные самки Исключительные самцы
Контроль 3777 69 1,83 ±0,21 —
Глюкурал (5 мкг/самка) 4287 39 0,91±0,14*** 50
Амфотерицин В (15 мкг/самка) 4575 206 4,50 ±0,29 —
Амфотерицин В + глюкурал (15 + 5 мкг/самка) 2553 84 3,29±0,34* 27
Стерин-дефектная диета 2611 155 5,94 ±0,44 —
Стерин-дефектная диета + глюкурал (5 мкг/самка) 3503 150 4,28±0,33** 28
Примечание. Сравнение проведено с соответствующим контролем без глюкурала. N = 4; Р: * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.
нарушениями физиологического состояния клетки, включающими механизм апоптоза при нарушении ионного гомеостаза. Основной путь активации апоптотического каскада протеаз в клетке при нарушении ионного гомеостаза, а также при действии сигнальных молекул типа TNF-a, связывают с утечкой катепсина Д из лизосом [6-10, 11, 12,
20, 22]. Соответственно стабилизацию и дестабилизацию лизосомальных мембран рассматривают в качестве механизма повышения и снижения жизнеспособности клетки. Описаны положительные результаты попыток использования стабилизаторов мембран лизосом с целью повышения жизнеспособности клеток [9].
Обнаруженные нами радиопротекторные свойства глюкурала указывают на существование прямой зависимости между стабильностью мембран клетки и доступностью ДНК для мутагенного воздействия, открывая интересные новые перспективы для создания радиопротекторов и антимутагенов. Стабилизация мембран с помощью глю-курала является принципиально новым подходом, позволяющим повысить радиорезистентность клеток.
Глюкурал тормозит автопротеолиз. Прямая проверка возможности применения глюкурала в качестве стабилизатора мембран лизосом, снижающего утечку ли-зосомальных протеаз и тормозящего деградацию белков ткани, была проведена нами на гомогенатах скелетных мышц крысы (табл. 4).
Таблица 4- Действие глюкурала на автопротеолиз в гомогенатах скелетных мышц крыс
Система Температура Глюкурал, (a-тирозин, мг/мл)* Пары
инкубации и время мкг/мл (белок гомогената, мг мл Ґ сравнения
инкубации X S.D.
0 0°С, 0 ч — 1,1 0,11 —
1 37° С, 4 ч — 2,17 0,32 1 vs. 0**
2 37° С, 24 ч — 5,32 0,44 2 vs. 1**
3 37° С, 4 ч 20 2,14 0,28 3 vs. 1
4 37° С, 4 ч 30 2,27 0,19 4 vs. 1
5 37° С, 4 ч 50 1,38 0,17 5 vs. 1*
6 37° С, 4 ч 100 1,07 0,12 6 vs. 1**
7 37°С, 24 ч 20 5,31 0,29 7 vs. 2
8 37°С, 24 ч 30 5,48 0,64 8 vs. 2
9 37°С, 24 ч 50 4,22 0,26 9 vs. 2*
10 37°С, 24 ч 100 4,32 0,26 10 vs. 2**
Примечание. а) Отношение концентрации свободных аминокислот, определенное с помощью нингидринной реакции и рассчитанное по a-тирозину, к концентрации белка в гомогенате. Измерения выполнены в 3 параллельных. N = 5; Р: * < 0,05; ** < 0,01.
В этих опытах применение глюкурала в концентрациях 50 и 100 мкг/мл в ходе 4-часовой инкубации гомогенатов при 37° С привело к торможению автопротеолиза до фоновых показателей. Через 24 ч инкубации степень подавления автопротеолиза оказалась не столь выражена, хотя и была достоверно ниже по сравнению с соответствующим контролем, что может быть связано или с разрушением лизосом, или с разрушением самого глюкурала.
Механизм действия глюкурала. Представленные экспериментальные данные, полученные на дрожжевых клетках, эндотелиальных клетках, выделенных из вен пуповинного канатика человека, малигнизированных клетках эритролейкемии мыши MEL, иммортализованных моноцитах человека ТНР-1, Drosophila melanogaster и гомогенатах скелетных мышц доказывают свойство глюкурала защищать клетки от повреждения при различных экстремальных воздействиях. Эта впервые обнаруженная цитопротек-торная способность глюкурала позволяет объяснить результаты ранее проведенных исследований различных аспектов действия этого соединения, и сделать предположения в отношении механизма действия глюкурала и его практического использования.
Стабилизация глюкуралом мембран изолированных лизосом, выделенных из почек собаки, была продемонстрирована нами ранее [1]. Она была обнаружена по существенному торможению утечки из лизосом маркерного фермента катепсина Д, повышение активности которого в крови считают признаком воспалительных и деградационных процессов. Эти данные позволили предположить, что высокая эффективность глюку-рала как противовоспалительного соединения, отмеченная авторами первых патентов [14, 16], определяется способностью этого соединения стабилизировать мембраны лизо-сом клетки, а, возможно, также мембраны других клеточных органелл и самой клетки.
Полученные нами экспериментальные доказательства цитопротекторного действия глюкурала, наряду с доказательствами стабилизации мембран лизосом в его присутствии [1, 19], а также публикации последних лет, указывающие на важную роль утечки
катепсина Д из лизосом в цитоплазму клетки в механизме запуска апоптозной гибели клеток в экстремальных условиях [6-9, 11, 12, 20, 22], дают основания полагать, что событием, определяющим механизм действия глюкурала, является стабилизация мембран лизосом клетки, что ведет к ограничению утечки катепсина Д. Можно допустить и возможность взаимодействия глюкурала с мембранами митохондрий. Эти органеллы играют важную роль в запуске апоптоза в клетках млекопитающих, вследствие выброса в цитоплазму белков из пространства, ограниченного внешней и внутренней мембранами митохондрий [17, 21]. Результатом взаимодействия глюкурала с митохондриальной мембраной может быть ее стабилизация и подавление утечки белков из митохондрий в цитоплазму, т. е. ингибирование апоптоза.
Для торможения активации клеточных протеаз при апоптозе применяют ингибиторы лизосомальных катепсинов или каспаз — протеаз, завершающих разрушение структурных белков клетки. Использование этих ингибиторов сопряжено с рядом неудобств, а при длительном применении вообще нереально, из-за их токсичности [18, 24]. Поэтому авторы высказывают идею о желательности применения для той же цели эффективных стабилизаторов лизосомальных мембран [9]. Роль такого стабилизатора и может выполнить глюкурал. Применение глюкурала для этой цели in vitro и in vivo значительно удобнее, чем ингибиторов протеаз, учитывая его очень низкое токсическое действие [19] и отсутствие мутагенного эффекта. На этих свойствах глюкурала базируются наши предположения об использовании препарата как в пищевой промышленности, так и в медицине. Нами были проведены успешные промышленные испытания глюкурала для нужд рыбной промышленности [19]. Как фармакологический препарат он может быть использован для защиты эндотелия кровеносных сосудов при диабете, регенерации мышечной ткани сердца после инфаркта, лечении ран и в ряде других ситуаций, положительный исход которых зависит от успешного хода процесса регенерации или защиты тканей от развития воспалительных реакций [14-16, 19].
Литература
1. Кравченко Л. С., Оксман А. Я., Терешин И. М. Ингибирование действия амфотерицина В на изолированные лизосомы почек собаки амиглурацилом // Антибиотики. 1977. Т. 22. С. 10181022.
2. Оксман А. Я., Лисочкин Б. Г., Марихина Б. Л., Еремеева А. А. Изменение некоторых биохимических показателей и ультраструктуры асцитных опухолей при сочетанном действии циклофосфамида и леворина // Эксперим. онкология. 1984. Т. 6. С. 57-61.
3. Савицкий В. В., Инге-Вечтомов С. Г. Влияние метаболизма стеринов в системе дрожжи-дрозофила на частоту радиационно-индуцированной анеуплодии в ооцитах // Генетика. 1985. Т. 21. С. 1155-1142.
4. Савицкий В. В., Лучникова Е. М., Инге-Вечтомов С. Г. Влияние метаболизма стеринов в системе дрожжи-дрозофила на частоту радиационно-индуцированной анеуплоидии в ооцитах Drosophila melanogaster // Генетика. 1985. Т. 21. С. 1135-1142.
5. Akita K., Ohtsuki T., Nukada Y. et al. Involvement of caspase-1 and caspase-3 in the production and processing of mature human interleukin 18 in monocytic THP.1 cells // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 26595-26603.
6. Berchem G., Glondu M., Gleizes M. et al. Cathepsin D affects multiple tumor progression steps in vitro: proliferation, angiogenesis and apoptosis // Oncogene. 2002. Vol. 21. P. 5951-5955.
7. Brunk U., Dalen H., Roberg K., Hellquist H. Photooxidative disruption of lysosomal membranes causes apoptosis of cultured human fibroblasts // Free Radical. Biol. Med. 1997. Vol. 23. P. 616-626.
8. Castino R., Pace D., Demoz M. et al. Lysosomal proteases as potential targets for the induction of apoptotic cell death in human neuroblastomas // Int. J. Cancer. 2002. Vol. 97. P. 775-779.
9. Choi S.-H., Choi D.-H., Lee J.-J. et al. Imidazoline drugs stabilize lysosomes and inhibit oxidative cytotoxicity in astrocytes. // Free Radical Biol. Med. 2002. Vol. 32. P. 394-404.
10. De Zentella P.M., Vázquez-Meza H., Piña-Zentella G. et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit epinephrine- and cAMP-mediated lipolysis in isolated rat adipocytes // J. Pharm. Pharmacol. 2002. Vol. 54. P. 577-582.
11. Kagedal K., Johansson U., Ollinger K. The lysosomal protease cathepsin D mediates apoptosis induced by oxidative stress // FASEB J. 2001. Vol. 15. Р. 1592-1594.
12. Kaufmann S., Hengartner M. Programmed cell death: alive and well in the new millennium // Trends in Cell Biology 2001. Vol. 11. P. 526-534.
13. Kitakaze M., Fong M., Yoshitake M. et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit epinephrine- and cAMP-mediated lipolysis in isolated rat adipocytes // J. Mol. Cell Cardiol. 1997. Vol. 29. P. 3413-3417.
14. Kul’bakh V., Popova I. N-methyl-a-glucosamine complex of 6-methyluracil // Chemical Abstracts. 1975а. Vol. 83. P. 434 (120846r).
15. Kul’bakh V., Popova I. Animal cell growth-stimulating N-methyl-d-glucosamine complex // Chemical Abstracts. 1975b. Vol. 83. P. 909 (10719u).
16. Kul’bakh V., Popova I. N-methyl-D-glucosamine complex of 6-methyluracil // Chemical Abstracts. 1976. Vol. 84. P. 552 (44605q).
17. Kuwana T., Newmeyer D. D. Bcl-2-family proteins and the role of mitochondria in apoptosis // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol. 15. P. 691-699.
18. Maeda S., Lin K. H., Inagaki H., Saito T. Induction of apoptosis in primer cell culture of
rat hepatocytes by protease inhibitors // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. Vol. 39. P. 447-445.
19. Oksman A., Kenworthy M. A method of prevention of lysosomal leakage in eukariotic cells
by using 6-methyluracil based water-soluble compounds and method of producing thereof // 2003. Provisional Application N 60/358,962; Disclosure Document N 499774 (Patent of USA).
20. Qiao Y., Prabhakar S., Coccia E. M. et al. Host Defense Responses to Infection by Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 22377-22385.
21. Smith D. J, Ng H., Kluck R. M., Nagley P. The mitochondrial gateway to cell death //
IUBMB Life. 2008. Vol. 60. P. 383-389.
22. Turk B., Turk D., Turk V. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477. P. 98-111.
23. Volloch V., Housman D. Terminal differentiation of murine erythroleukemia cells: physical stabilization of end-stage cells // J. Cell Biol. 1982. Vol. 93. P. 390-394.
24. Zhu D., Ucun F. Cathepsin inhibition induces apoptotic death in human leukemia and lymphoma cells // Leuk. Lymphoma. 2000. Vol. 39. P. 343-353.
Статья поступила в редакцию 15 октября 2009 г.
