CC BY
33
Изучение активности и токсичности новых антибактериальных агентов на основе производных трииндолилметана в экспериментах in vivo
Е. П. МИРЧИНК', Е. Б. ИСАКОВА', С. Н. ЛАВРЕНОВ', А. Ю. СИМОНОВ', В. А. ГОЛИБРОДО', А. А. ПАНОВ', О. П. БЫЧКОВА', В. В. ТАТАРСКИЙ2, *А. С. ТРЕНИН'
' НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва
2 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина Минздрава России, Москва
Study of the Activity and Toxicity of New Antibacterial Agents Based on Triindolylmethane Derivatives in vivo
E. P. MIRCHINK', E. B. ISAKOVA', S. N. LAVRENOV', A. YU. SIMONOV', V. A. GOLIBRODO', A. A. PANOV', O. P. BYCHKOVA', V. V. TATARSKIY2, A. S. TRENIN'*
' Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
2 N. N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, Moscow
Изучены биологические свойства новых синтетических антибиотиков группы трииндолилметана, в том числе соединений, содержащих в своей структуре малеимидный фрагмент. Показана их высокая антибактериальная активность in vitro, главным образом в отношении грамположительных бактерий, включая штаммы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью. Соединения, проявившие наименьшую токсичность in vitro в отношении донорских фибробластов человека ПФ-hTERT, были подвергнуты дальнейшим испытаниям на животных (мыши). Выявленные при этом значения LD50 и LD10 составили, соответственно, 24,2 и 16,9 мг/кг для соединения LCTA-2701 и 41,8 и 34,1 мг/кг для соединения LCTA-2841. Испытание химерных соединений in vivo показало их высокую эффективность в модели стафилококкового сепсиса мышей и достаточно хорошую переносимость. Значения ED50 составили 1,09 мг/кг для LCTA-2701 и 18,27 мг/кг для LCTA-2841, а их химиотерапевтический индекс, соответственно, 22,2 и 2,23.
Ключевые слова: трииндолилметаны, малеинимиды, химерные (гибридные) антибиотики, антибактериальная и анти-фунгальная активность in vitro и in vivo, цитотоксичность, токсичность in vivo, эффективность в модели стафилококкового сепсиса мышей.
Biological properties of new synthetic triindolylmethylium antibiotics of the triindolylmethane group, including compounds containing a maleimide fragment in the structure, are studied. Their high antibacterial activity in vitro, mainly against gram-positive bacteria, but also against strains with multiple drug resistance, was shown. The compounds, that showed the least in vitro toxicity on human donor fibroblasts PF-hTERT, were subjected to further testing in animals (mice). The LD50 and LD10 values identified were 24.2 and 16.9 mg/kg, respectively, for LCTA-2701 compound and 41.8 and 34.1 mg/kg for LCTA-2841 compound. In vivo testing of chimeric compounds showed their high efficiency in the model of staphylococcal sepsis in mice and a fairly good tolerability. ED50 values were 1.09 mg/kg for LCTA-2701 compound and 18.27 mg/kg for LCTA-2841 compound, and their chemotherapeutic index was, respectively, 22.2 and 2.3.
Keywords: triindolylmethane, maleimide, chimeric (hybrid) antibiotics, antibacterial and antifungal activity in vitro and in vivo, cytotoxicity, in vivo toxicity, efficacy in a model of staphylococcal sepsis in mice.
Введение
Разработанные в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе методы синтеза позволили получить серию симметричных М-алкилзамещенных солей трииндолил-метилия, обладающих значительной антибактериальной и антифунгальной активностью [1, 2]. Одним из основных достоинств соединений этого типа была их высокая активность в отношении грамположительных бактерий, включая штаммы,
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: 119021 г. Москва, Большая Пироговская, 11. НИИНА им. Г.Ф.Гаузе
обладающие множественной лекарственной устойчивостью [3]. Основным недостатком оказалась довольно высокая цитотоксичность, вымвля-емая в экспериментах in vitro с использованием культур клеток млекопитающих [1,3]. Изучение закономерностей «структура—активность» в этом классе соединений позволило выявить как основные направления повышения активности вновь синтезируемых соединений, так и способы снижения их цитотоксических свойств [3—5]. Одним из наиболее перспективных подходов к снижению токсичности явилось создание «химерных» антибиотиков, содержащих фрагмент трииндо-
лилметилия, а в качестве одного из заместителей при атоме азота индольного цикла — замещённый малеинимидный фрагмент [6]. Создание подобный соединений с малеимидами — соединениями, способными к подавлению активности целого ряда микробных ферментов [7, 8], позволило значительно уменьшить цитотоксичность трииндо-лилметилиев без существенного снижения их биологической активности in vitro [6]. В настоящей работе приведены результаты детального изучения активности в экспериментах in vitro и in vivo двух перспективных соединений класса трииндо-лилметанов, а также результаты изучения их токсических свойств и эффективности в лечении стафилококкового сепсиса у мышей.
Материал и методы
Получение и очистка новых соединений, их физико-химические характеристики, приготовление растворов. Синтез соединений, схема их получения, очистки, а также физико-химические характеристики описаны ранее [6].
Для оценки биологической активности в экспериментах in vitro препараты растворяли в 100% ДМСО в концентрации 2—5 мг/мл с последующим приготовлением в том же растворителе двукратных разведений вплоть до концентрации препаратов 1,3 мкг/мл. При постановке экспериментов происходило дальнейшее разведение препаратов уже в водной среде — конечное содержание ДМСО не превышало 1%, а концентрация препаратов составляла от 32,0 до 0,13 мкг/мл.
Для изучения препаратов in vivo готовили растворы препаратов для внутривенного введения в 5% растворе глюкозы. Стерилизацию растворов проводили фильтрацией через фильтры 0,22 мкм Millipore, США.
Препараты сравнения, материалы и реактивы. Препаратами сравнения служили левофлоксацин, «Белмедпрепараты РУП», Беларусь (в отношении бактерий) и амфотерицин В, Sigma, США (в отношении грибов).
В работе использовали одноразовые стерильные 96-лу-ночные планшеты, Пан-Эко, Россия, пластиковые чашки Петри, пластиковые стерильные пипетки, пробирки, Пан-Эко, Россия, одноканальные и многоканальные дозаторы ВНИИ БП, Россия, фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм Millipore, США.
Для оценки микробныгх культур, имевших разную чувствительность к антибиотикам, использовали препараты антибиотиков отечественных и зарубежных компаний, а также антибиотики, полученные в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе.
Микробные штаммы, питательные среды, условия культивирования. В работе использовали клинические изоляты бактерий, полученные из клиник и из музея штаммов Лаборатории проблем клинической микробиологии и контроля за госпитальными инфекциями ПМГМУ им. И. М. Сеченова, а также коллекционные штаммы грамположительныгх, грамотрицательныгх бактерий и грибов. Использовали клинические изоляты грампо-ложительныгх бактерий: Staphylococcus aureus 5 MRSA, Staphylococcus aureus 10, Staphylococcus aureus 100КС MRSA, Staphylococcus aureus 3798 MRSA, Staphylococcus epidermidis 533, Staphylococcus haemoliticus 585, Enterococcus faecium 569; коллекционные культуры грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus ATCC 700699, Staphylococcus aureus ATCC 21027 (=209 P), Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Bacillus subtilis ATCC 6633; коллекционные культуры грамотрицательныгх бактерий: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Proteus vulgaris ATCC 13315, Salmonella cholerasuis ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; коллекционные культуры дрожжей Candida albicans ATCC 14053 и грибов Aspergillus niger ATCC 16404.
Для выращивания микроорганизмов и постановки экспериментов по выявлению биологической активности соединений использовали следующие жидкие и плотные питательные среды: триптиказо-соевый агар, среда Мюллера—Хинтон (Acumedia, Baltimore, США). Для культивирования Staphylococcus spp. и E.coli использовали готовую сухую среду — триптиказо-соевый агар (Trypticase Soy Agar, BBL). Для культивирования Enterococcus spp. и P.aeruginosa использовали готовую сухую среду — колумбийский агар (Columbia Agar Base, BBL). Среды стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 15 мин. Дрожжи C.albicans выращивали на агаре Сабу-ро (пептон — 10 г, глюкоза — 40 г, агар — 20 г, дист. вода — 1 л, pH 6,0), культуру мицелиальных грибов A.niger — на карто-фельно-глюкозном агаре (картофель — 200 г, глюкоза — 20 г, агар — 15 г, дистиллированная вода — 1 л, pH 5,5—6,0).
Для определения антибактериального действия использовали жидкую среду Мюллера—Хинтон, для выяснения действия соединений на грибы использовали среду RPMI 1640 с L-глютамином, без бикарбоната натрия, которую готовили из сухой среды (ICN Biomedicals Inc., Ohio, USA) путём разведения в дистиллированной воде, последующего забуферивания с использованием 0,165 М морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS; ACROS ORGANICS, New Jersey, США) и доведения рН среды до 7,0 добавлением 1 н раствора NaOH. Питательную среду RPMI 1640 стерилизовали фильтрацией под давлением через фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм (Millipore, США).
Определение антимикробной активности тестируемых соединений in vitro. Определение антимикробной активности, проводили путём выявления их минимальной подавляющей концентрации (МПК) методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде с использованием 96-луночных стерильных планшетов. Работу с бактериями проводили в питательной среде Мюллера—Хинтон, с грибами — в среде RPMI 1640 с L-глютамином, без бикарбоната натрия. Определение, подробно описанное ранее [3, 7], проводили в соответствии с требованиями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI/NCCLS) и методическими указаниями по изучению активности фармакологических веществ [9—12].
Определение цитотоксического действия тестируемый соединений в отношении клеточных линий человека. Цитотокси-ческое действие тестируемых соединений определяли с помощью MTT-теста, с использованием ПФ-hTERT (донорские (постнатальные) фибробласты человека, иммортализованные с помощью трансфекции hTERT-гена каталитического компонента теломеразы) по методу, подробно описанному ранее [6]. Клетки ПФЧ культивировали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM), содержащей 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубацию проводили в увлажненной атмосфере 5% СО2 при 37°С. В эксперименте использовали клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Для исследования цитотоксичности соединений в ячейки 96-луночных планшетов вносили по 190 мкл суспензии клеток (~2 тыс. клеток на лунку) и инкубировали 16 ч. В день эксперимента готовили серийные разведения тестируемых соединений в ДМСО (исходный раствор — 10 мМ в 100% ДМСО). В дальнейшем разведения проводили в питательной среде. Конечные концентрации соединений в опыте составляли 50, 17, 5,6, 1,85, 0,61, 0,21, 0,07, 0,02, 0,008, 0,0025 мкМ. Конечная концентрация растворителя (ДМСО) составляла 1%. Каждая концентрация была представлена в 3 повторах. Контролем служили лунки, не содержащие тестируемых препаратов. Инкубацию клеток с тестируемыми соединениями проводили в течение 72 ч. После окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл раствора МТТ в ростовой среде (5 мг/мл). Клетки инкубировали 2 ч до развития фиолетовой окраски, после чего культуральную среду удаляли. В лунки вносили по 100 мкл ДМСО и суспендировали осадок. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Thermo Scientific Multiscan FC при длине волны 570 нм. За 100% выживаемости клеток при-
нимали значения оптической плотности в лунках без добавления тестируемых соединений (контроль). Процент выгживае-мости клеток, инкубированных с тестируемыми соединениями, вычисляли делением оптической плотности в соответствующей лунке (среднее 3 независимых измерений) на значение оптической плотности в контроле. Оценивали концентрацию препаратов, вызывающую гибель 50% клеток (IC50) и выражали её в мкг/мл.
Определение острой токсичности и антимикробной активности тестируемых соединений in vivo
Лабораторные животные. Изучение острой токсичности препаратов и определение их эффективности в лечении стафилококкового сепсиса у мышей проводилось на мышах SHK, самках. Для изучения острой токсичности каждого препарата использовали 72 мыши, по 6 животныгх в группе. Изучение эффективности препаратов в лечении стафилококкового сепсиса требовало на каждый препарат использования 175 мышей по 10 животныгх в группе.
Животных получали из филиала «Андреевка» Центрального питомника РАН «Светлые Горы». В начале работы мыши в возрасте 8 нед. имели массу тела 18—20 г и акклиматизировались к новым условиям содержания в течение 14 дней до начала эксперимента. Во время этого периода осуществляли ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В экспериментальные группы отбирались животные без признаков отклонений внешнего вида, случайным образом, так, чтобы индивидуальное значение массы отклонялось от среднего значения не более чем на 10%. Каждому животному быт присвоен индивидуальный номер, помечаемый проколом ушной раковины, и фиксируемый на карточке клетки. Группы мышей сформированы из расчёта по 6 или 10 животныгх в каждой группе.
Исследование выполнялось в соответствии с требованиями действующего Руководства по проведению доклинических исследований лекарственный: средств (2012) [13] и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Национальный стандарт Российской федерации, ГОСТ Р 53434 — 2009) [14] и Европейской Конвенции по гуманному обращению с лабораторными животными [15]. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами Этического Комитета Минздрава России.
Животных содержали в поликарбонатных клетках (по 6 или 10 особей в каждой) на подстиле. В качестве подстила использовали сертифицированные стерилизованные обеспыленные опилки, поставляемые ООО «Лабораторкорм». Стандартный гранулированный корм «Корм для содержания лабораторных грызунов», поставляемый ООО «Лабораторкорм», давали в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Водопроводная вода ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая» давалась ad libitum в стандартных автоклавированныгх питье-выгх бутылочках со стальными крышками-носиками. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды: 18—22°C и относительной влажности 50—65%. Мониторинг температуры и влажности осуществлялся с помощью климатической установки. В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения и 8—10-кратная смена объёма воздуха в час.
Препараты для внутривенного введения. Для приготовления растворов препаратов, пригодных для внутривенного введения, высушенные препараты тестируемым соединений, чистотой не менее 99%, растворяли в 5% растворе глюкозы для внутривенного введения в концентрации 6,4 мг/мл. Стерилизацию растворов проводили фильтрацией через фильтры Sterivex 0,22 мкм (Millipore, США). В дальнейшем готовили стерильные растворы препаратов уменьшенной концентрации, позволяющие при введении 0,1 мл растворов добиться различных доз препаратов. Испытуемые препараты хранились при комнатной температуре не выше 25°С.
Изучение острой токсичности. Изучение острой токсичности каждого препарата проводили на 72 мышах (по 6 мышей в группе), используя раствор испытуемого препарата,
приготовленный в 5% растворе глюкозы. Препарат вводили животным в хвостовую вену с помощью шприца с металлической иглой в диапазоне доз препарата от 1,0 мг/кг до 40 мг/кг.
С первого дня после введения животные находились под непрерывным наблюдением. Ежедневно регистрировали число павших животныгх и срок их гибели, один раз в неделю регистрировали массу тела животных, потребление ими корма, а также ежедневно оценивали клинические признаки здоровья животных. Продолжительность наблюдения за животными составляла не менее 30 дней после последнего случая гибели животного.
Дозы, характеризующие токсичность препаратов, были рассчитаны по методу Литчфилда и Уилкоксона при помощи компьютерной программы StatPlus 2006 AnalystSoft StatPlus — программа статистического анализа, версия 2006. Для всех данных рассчитано среднее значение и стандартное отклонение. Различия определялись как достоверные при р<0,05.
Изучение эффективности препаратов в лечении стафилококкового сепсиса у мышей. В эксперименте использовали штамм S.aureus 10, адаптированный к применению на животных и не имеющий резистентности к лекарственным препаратам. Первоначально определяли 100% летальную дозу (LD100) для этого штамма возбудителя для мышей SHK, т. е. дозу возбудителя, при которой регистрировалась гибель 100% животныгх. Доза стафилококка LD100, вышвленная в эксперименте, составляла 8,0х108 КОЕ/мышь, что позволило использовать её в дальнейшем для заражения животныгх.
Протокол эксперимента. Химиотерапевтическую эффективность производных трииндолилметана определяли на модели стафилококкового сепсиса мышей. Мышей колонии SHK, массой 18—20 г заражали внутривенно летальной дозой стафилококка (по 0,1 мл раствора). Через 1 ч после заражения мышам внутривенно (по 0,1 мл раствора) вводили испытуемые производные трииндолилметана в ранжире доз препарата от 0,1 до 40 мг/кг. Использовали растворы испытуемого препарата, приготовленные в 5% растворе глюкозы. Изучение эффективности каждого препарата проводили на 175 мышах (по 10 мышей в группе).
Продолжительность наблюдения за животными в эксперименте составляла 14 дней. Ежедневно регистрировали число павших животных и срок их гибели, три раза в неделю регистрировали массу тела животных. Следили за потреблением ими корма, а также ежедневно оценивали клинические признаки здоровья животных.
Для определения эффективности испытуемых препаратов использовали показатель 50% эффективной дозы — ED50, который определяли по методу Беренса (метод накопления частот), а также по методу Литчфилда и Уилкоксона при помощи компьютерной программы StatPlus 2006 AnalystSoft StatPlus — программа статистического анализа, версия 2006. Для всех данных рассчитано среднее значение и стандартное отклонение. Различия определялись как достоверные при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Была протестирована антимикробная активность in vitro свыше 100 производных трииндолилметана в отношении 17 штаммов грамполо-жительных, грамотрицательных бактерий и грибов. Большинство полученных производных (74,2%) проявили высокую активность в отношении грамположительных бактерий, в том числе коллекционных культур и клинических изолятов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. МПК активных производных в отношении грамположительных организмов варьировала в пределах от 0,13 до 2,0 мкг/мл. Отдельные производные проявили также высокую ак-
Формулы изученных соединений.
тивность в отношении грибов. Вместе с тем, их активность в отношении грамотрицательных бактерий была, как правило, не очень высока.
По показателям цитотоксического действия in vitro в отношении иммортализованных постна-тальных фибробластов человека ПФЧ-hTERT изученные соединения существенно различались, что позволило отобрать для более подробного изучения два соединения, обладавшие относительно невысокой цитотоксичностью.
Наилучшее соотношение антимикробной активности с приемлемой цитотоксичностью показали соединения, основу которых составляет молекула трииндолилметана, содержащая малеи-мидный фрагмент. На рисунке приведены химические структуры соединений LCTA-2701 и LCTA-2841, проявивших в экспериментах in vitro удовлетворительные показатели цитотоксичнос-ти. Для сравнения приведена также структура их прототипа — соединения LCTA-1319.
Ниже приведены результаты изучения этих соединений в экспериментах т \itro. В качестве препаратов сравнения использованы антибактериальный антибиотик левофлоксацин и противогрибковый антибиотик амфотерицин В (табл. 1).
Производные ЬСТЛ-2701 и ЬСТЛ-2841 проявили высокую активность не только в отношении штаммов Б.аыгеш ЛТСС 25923 и Б.аыгеш 10, чувствительных к антибиотикам, но также в отношении резистентных штаммов, например, активно подавляли рост Б.аыгеыз 5, резистентного к пеницилли-нам и эритромицину, были активны в отношении полирезистентных штаммов Б.аыгеыз 3798 и Б.аыгеыз 100КС, устойчивых к антибиотикам пенициллино-вого и цефалоспоринового ряда, клиндамицину, эритромицину и фторхинолонам. Высокую активность проявили производные ЬСТЛ-2701 и ЬСТЛ-2841 в отношении штамма S.epidermidis 533, устойчивого к аминогликозидным антибиотикам, однако в действии на полирезистентные штаммы
Таблица 1. Антимикробная активность in vitro соединений в сравнении с левофлоксацином (Лф) и амфоте-рицином В (Ам В)
Микробные штаммы МПК, мкг/мл
Контроль LCTA-2701 LCTA-2841 LCTA-1319
Молекулярная масса 618,0 590,0 522,0
IC50, мкг/мл (ПФ-hTERT) >50 (Лф); 0,7 (Am В) 0.6 2,8 0,07
Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,25 (Лф) 0,13 0,5 1
Staphylococcus aureus 3798 32,0 (Лф) 0,13 0,25 0,13
Staphylococcus aureus 100KC 32,0 (Лф) 0,13 0,5 0,25
Staphylococcus aureus ATCC 700699 16,0 (Лф) 0,13 0,5 0,5
Staphylococcus aureus 10 0,13 (Лф) 0,25 1 0,25
Staphylococcus aureus 5 0,25 (Лф) 0,5 0,25 0,5
Staphylococcus epidermidis 533 0,5 (Лф) 0,5 0,5 0,25
Staphylococcus haemoliticus 585 0,5 (Лф) >64 2 0,5
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 8,0 (Лф) 0,5 >64 —
Enterococcus faecium 569 1,0 (Лф) >64 8 1
Escherichia coli ATCC 25922 0,06 (Лф) 16 >64 >64
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0,25 (Лф) >64 >64 >64
Proteus vulgaris ATCC 13315 4,0 (Лф) >64 16 >64
Salmonella cholerasuis ATCC 14028 0,13 (Лф) >64 >64 >64
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1,0 (Лф) 16 32 >64
Candida albicans ATCC 14053 1,0 (AM В) 2 16 1
Aspergillus niger ATCC 16404 1,0 (AM В) 2 8 2
Таблица 2. Определение эффективности препаратов LCTA-2701 и LCTA-2841 in vivo в модели стафилококкового сепсиса мышей
№ группы Испытуемый препарат Доза препарата, мг/кг Гибель, % Выживаемость, %
1 ЬСТЛ-2701 0,5 70 30
1,0 50 50
1,5 40 60
1,75 10 90
2,0 0 100
2 ЬСТЛ-2841 5,0 80 20
10,0 70 30
15,0 60 40
20,0 40 60
25,0 40 60
30,0 20 80
3 Контроль (заражённые мыши, не получившие лечения) — 100 0
4 Интактные животные (получали раствор 5% глюкозы) — 0 100
S.haemoliticus 585 и E.faecium 569, последний из которых обладал дополнительной резистентностью к доксициклину, а также гликопептидному антибиотику ванкомицину, производное LCTA-2701 оказалось менее активным.
В целом, в сравнении со своим прототипом — соединением ЛХТА 1319, производные LCTA-2701 и LCTA-2841, по-прежнему, обладали высокой антимикробной активностью, в особенности в отношении грамположительных бактерий и грибов. Введение малеимидного фрагмента в их структуру позволило даже несколько повысить антимикробную активность в сравнении с прототипом. Одновременно резко снизилась их цито-токсичность.
Испытание производных в экспериментах in vivo при внутривенном введении мышам позволило выявить следующие показатели токсичности: LD50 = 24,2 (20,2-28,2) мг/кг, LD10 = 16,9 (15,4-17,6) мг/кг для препарата LCTA-2701 и LD50 = 41,8 (37,6-45,9) мг/кг, LD10 = 34,1 (31,0-35,8) мг/кг для препарата LCTA-2841. Испытание производных LCTA-2701 и LCTA-2841 in vivo показало их хорошую переносимость и высокую эффективность в модели стафилококкового сепсиса мышей (табл. 2).
В контрольной группе мышей, заражённых летальной дозой золотистого стафилококка (8х108 КОЕ/мышь) (группа 3), гибель животных отмечалась, начиная с 4 суток эксперимента. К 10-м суткам эксперимента все животные контрольной группы, не получавшие лечения, погибали. В контрольной группе животных, не заражённых стафилококком (группа 4), гибели не наблюдалось.
В опытных группах у мышей, получивших препарат LCTA-2701, первая гибель наблю-
ЛИТЕРАТУРА
1. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-алки-линдол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений. Известия Академии наук. Серия химическая. — 2010. — Т. 59. — № 12. — С. 2203—2211. / Stepanova E.V., SHtilA.A., Lavrenov S.N. i dr. Soli tris(1-alkilindol-3-il)metiliya — novyi klass protivoopuk-holevykh soedinenii. Izvestiya Akademii nauk. Seriya khimicheskaya 2010; 59: 12: 2203—2211. [in Russian]
далась на 6—7-е сутки эксперимента, а последняя мышь погибала на 12-е сутки. При введении препарата LCTA-2701 в дозе 2 мг/кг была отмечена 100% выживаемость. При введении препарата LCTA-2841 100% выживаемости не наблюдалось ни в одной из подопытных групп. Максимальная выживаемость при введении этого препарата составила 80% и была отмечена в группе животных, получивших препарат в дозе 30 мг/кг (табл. 2).
Динамика изменения массы тела животных в течение срока наблюдения характеризовалась первоначальным резким её снижением и последующим медленным восстановлением по сравнению с контролем — нелечеными животными.
С использованием программы StatPlus 2006 Professional 3.8.0. определены показатели ED50 для обоих препаратов. Значение ED50 для соединения LCTA-2701 составило 1,09 (0,77-1,42) мг/кг, а для соединения LCTA-2841 — 18,27 (11,9-24,95) мг/кг.
Количественной характеристикой широты терапевтического действия является терапевтический индекс, представляющий собой отношение LD50 к ED50 [13]. Терапевтический индекс испытуемого препарата LCTA-2701 составил 22,2 (24,2 мг/кг / 1,09 мг/кг), а для LCTA-2841 — 2,3 (41,8 мг/кг / 18,27 мг/кг). Таким образом, терапевтические показатели новых соединений LCTA-2701 и LCTA-2841 свидетельствуют об их весьма неплохой терапевтической эффективности, в особенности у препарата LCTA-2701, и соответственно, о перспективности дальнейшего изучения этих соединений в целях создания новых высокоэффективных лекарственных средств.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10300)
2. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts: Role of N-alkyl substituents. Bioorgan Med Chem 2010; 18: 6905—6913.
3. Тренин A.C., Лавренов С.Н., Мирчинк Е.П. и др. Разработка препаратов на основе трис(1-алкилиндол-3-ил)метана с целью преодоления лекарственной устойчивости возбудителей. Антибиотики и химиотер. — 2017. — Т. 62. — № 1—2. — С. 3—9. / Trenin A.S., Lavrenov S.N., Mirchink E.P. i dr. Razrabotka preparatov na osnove tris(1-alkilindol-3-il)metana s tselyu preodoleniya lekarstvennoi usto-
ichivosti vozbuditelei. Antibiotiki i khimioter 2017; 62: 1—2: 3—9. [in Russian]
4. Ol'khovich M.V., Sharapova A.V., Lavrenov S.N.. Blokhina S.V., Perlovich G.L. Inclusion complexes of hydroxypropyl-/?-cyclodextrin with novel cytotoxic compounds: Solubility and thermodynamic properties. Fluid Phase Equilibria 2014; 384: 68—72.
5. Durandin N.A., Tsvetkov V.B., Bykov E.E. et al. Quantitative parameters of complexes of tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts with serum albumin: relevance for the design of drug candidates. J Photochem Photobiol B: Biology 2016; 162: 570—576
6. Лавренов C.H., Симонов А.Ю., Панов A.A. и др. Новые антимикробные вещества — гибридные производные малеимидов и трииндо-лилметанов: синтез и биологическая активность. Антибиотики и химиотер. — 2018. — Т. 63. — № 7—8. — С. 3—9. / Lavrenov S.N., SimonovA.YU., PanovA.A. idr. Novye antimikrobnye veshchestva — gib-ridnye proizvodnye maleimidov i triindolilmetanov: sintez i biologich-eskaya aktivnost. Antibiotiki i khimioter 2018; 63: 7—8: 3—9. [in Russian]
7. Лакатош C.A., Тренин A.C., Симонов А. Ю. и др. Новые биологически активные соединения в ряду производных 3-(индол-1-ил)-, 3-(N-аминоарил)- и 3-^-тиоарил)малеимида. Антибиотики и химиотер. — 2017. — Т. 62. — № 5—6. — С. 3—11. / Lakatosh S.A., Trenin A.S., Simonov A. Yu. i dr. Novye biologicheski aktivnye soedi-neniya v ryadu proizvodnykh 3-(indol-1-il)-, 3-(N-aminoaril)- i 3-(S-tioaril)maleimida. Antibiotiki i khimioter 2017; 62: 5—6: 3—11. [in Russian]
8. Panov A.A., Simonov A. Yu., Lavrenov S.N., Lakatosh S.A., Trenin A.S. 3,4-Disubstituted maleimides: synthesis and biological activity. Chem Heterocycl Comp 2018; 54: 2: 103—113.
9. Рекомендации Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов США (NCCLS), 2000 [NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA, 2000].
10. CLSI M38-A2. Ed. 2. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved standart. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania, 2008.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Мирчинк Елена Павловна — д. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
Исакова Елена Борисовна — научный сотрудник лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
Лавренов Сергей Николаевич — к. х. н., старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва Симонов Александр Юрьевич — к. х. н., научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва Голибродо Василиса Антоновна — к. б. н., научный сотрудник лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
11. CLSI M27-S3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania, 2013.
12. Кубанова A.A., Степанова Ж.В., Гуськова Т.А. и др. Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. Под ред. А. Н. Миронова. М.: Гриф и К., 2012. — С. 578—586. / KubanovaA.A., StepanovaZh.V., Guskova T.A. i dr. Metodicheskie ukazaniya po izucheniyu protivo-gribkovoi aktivnosti farmakologicheskikh veshchestv. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstvennykh sredstv. Chast 1. Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K., 2012; 578—586. [in Russian]
13. Арзамасцев Е.В., Березовская И.В., Верстакова О.Л. и др. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К., 2012. — С.13—24. / Arzamastsev E.V., BerezovskayaI.V., Verstakova O.L. idr. Metodicheskie rekomendatsii po izucheniyu obshchetoksicheskogo deistviya lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstven-nykh sredstv. CHast 1. Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K., 2012; 13—24. [in Russian]
14. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». / Prikaz Ministerstva zdravookhraneniya i sotsialnogo razvitiya Rossiiskoi Federatsii ot 23 avgusta 2010 goda № 708n «Ob utverzhdenii Pravil laboratornoi praktiki». [in Russian]
15. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes (Council of Europe, 1986, ETS No. 123).
Панов Алексей Александрович — инженер лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
Бычкова Ольга Петровна — к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «»НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
Татарский Виктор Вячеславович — к. б. н., научный сотрудник лаборатории Механизмы гибели опухолевых клеток ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России, Москва
ТренинАлексей Сергеевич — д. б. н., заведующий лабораторией Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
