CC BY
46
Новые биологически активные соединения в ряду производных 3-(индол-1-ил)-, З-^-аминоарил)- и 3-(8-тиоарил)малеимида
С. А. ЛАКАТОШ*, А. С. ТРЕНИН, А. Ю. СИМОНОВ, С. Н. ЛАВРЕНОВ, О. П. БЫЧКОВА, Е. А. ЦВИГУН
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва
New Biologically Active Compounds in the Series of 3-(indol-1-yl)-, 3-(N-aminoaryl)-, and 3-(S-thioaryl)Maleimide Derivatives
S. A. LAKATOSH, A. S. TRENIN, A. YU. SIMONOV, S. N. LAVRENOV, O. P. BYCHKOVA, E. A. TSVIGUN
Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
Путём полного химического синтеза получены новые соединения в ряду 3,4-дизамещённых производных малеимвда, обладающие выраженной антимикробной активностью in vitro в отношении грамположительных бактерий, дрожжей Candida albicans и грибов Aspergillus niger. Одновременно все изученные соединения оказались неактивными в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli, что свидетельствует о специфическом характере их антимикробного действия. Ряд производных проявили себя в тест-системе с бактериальной культурой Halobacterium salinarum, используемой для отбора биологически активных соединений — ингибиторов биосинтеза стеролов и противоопухолевых антибиотиков, что позволяет предполагать наличие у них потенциальных противоопухолевых свойств. Наибольшую биологическую активность проявили 3-бромо-4-тиоа-рильные и 3,4-бистиоарильное производные, относящиеся к новому типу химических соединений, перспективных для дальнейшего изучения и создания на их основе новых антимикробных и противоопухолевых лекарственных средств.
Ключевые слова: малеимиды, индолилмалеимиды, тиоарилмалеимиды, производные трисалкилиндолилметана, антимикробные соединения, противоопухолевые соединения, антибактериальная и антифунгальная активность in vitro, микробная модель Halobacterium salinarum в поиске антибиотиков.
Novel compounds among 3,4-disubstituted maleimlde derivatives that reveal a pronounced antimicrobial activity in vitro against Gram-positive bacteria, yeast Candida albicans, and fungi Aspergillus niger were obtained through total chemical synthesis. All these derivatives were simultaneously inactive against Gram-negative bacteria Escherichia coli, indicating the specific nature of their antimicrobial action. A number of derivatives appeared to be active in Halobacterium salinarum test system, which is used for selecting biologically active compounds among sterol biosynthesis inhibitors and antitumor antibiotics. This data suggests that such derivatives seem to have potential antitumor properties. The most active compounds were 3-bromo-4-thioaryl and 3,4-bisthioaryl maleimides, which are related to a new type of chemical compounds, that are promising for further elaboration and development of new antimicrobial and antitumordrugs on their basis.
Keywords: maleimides, indolylmaleimides, thioarylmaleimides, trisalkylindolylmethan derivatives, antimicrobial and antitumor compounds, antibacterial and antifungal activity in vitro, Halobacterium salinarum microbial model in screening of antibiotics.
Введение
Основными направлениями в разработке новых антибиотиков являются: поиск биологически активных соединений среди продуктов микробного вторичного метаболизма, нередко сопровождаемый химической или биологической трансформацией выделенных соединений с целью улучшения их биологических свойств, и создание новых антибиотиков путём полного химического синтеза [1, 2]. В последнем случае наиболее пристального внимания заслуживают соединения, относящиеся к ранее не изученным классам химических веществ, а также производ-
© Коллектив авторов, 2017
*Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Большая Пироговская, 11. ФГБНУ «НИИНА»; E-mail: lakatosh@inbox.ru
ные, получаемые в ряду уже проявивших себя классов химических соединений.
Одним из классов веществ, перспективных для поиска новых биологически активных соединений, являются производные индолилмалеимида и их аналоги, многие из которых обладают противовирусным [3, 4], противоопухолевым [3, 5], а также, в ряде случаев, антибактериальным действием [3, 5, 6]. Например, противоопухолевые антибиотики: ребеккамицин — ингибитор топоизомеразы I [5, 7], стауроспорин, являющийся мощным, но неселективным ингибитором протеинкиназ [8, 9], или, например, такие синтетические аналоги природных соединений индол-3-ил малеимида, как Б^-УШ, являющийся мощным селективным ингибитором протеинкиназы С альфа [10] (рис. 1).
Наиболее изученным видом активности этой группы соединений является ингибиторная ак-
Рис. 1. Химическая структура стауроспорина, ребеккамицина и В1Б-1Х.
тивность в отношении ферментов протеинкиназ и связанные с этим биологические эффекты, главным образом, способность к подавлению опухолей.
Протеинкиназы, модифицирующие, как известно, другие белки путём фосфорилирования содержащихся в них аминокислот, либо по их ги-дроксильным группам, как у серина, треонина и тирозина, либо по остаткам гистидина, что встречается, в основном, у бактерий, играют важную роль в биологии клетки. Они участвуют в хемотаксисе, осморегуляции бактерий и грибов, в функционировании различных регуляторных систем растений [3, 11, 12]. При этом протеинкиназы, фосфорилирующие спиртовые остатки сери-на, треонина и тирозина, кардинальным образом отличаются по своей структуре и свойствам от протеинкиназ, проводящих фосфорилирование по гистидину, а протеинкиназы бактерий отличаются от протеинкиназ человека [3, 11, 12].
В настоящем исследовании были изучены производные 3-(индол-1-ил)-, З-(М-аминоарил)-и 3-(8-тиоарил)малеимида, полученные в НИ-ИНА им. Г. Ф. Гаузе путём полного химического синтеза. Ряд указанных соединений были синтезированы ранее и продемонстрировали свою способность к подавлению активности протеинки-наз. При этом, одни из них обладали активностью в отношении протеинкиназ человека, а другие — в отношении протеинкиназ бактерий [13, 14]. Вместе с тем, изучения антимикробного действия этих соединений до сих пор не проводилось.
Группа соединений, относящихся к тиоа-рильным производным малеимида, синтезированы впервые. Химические свойства и биологическая активность указанных соединений ранее не изучались.
Все малеимиды, приведённые в настоящем исследовании, обладали существенными отличиями по своей химической структуре от малеими-дов — ингибиторов протеинкиназ, описанных ранее другими авторами, что позволяло надеяться на наличие у них серьёзных отличий в механизме действия и биологической активности от ранее изученных соединений.
Малеимиды, взятые для настоящего исследования, в свою очередь, отличались заметным структурным разнообразием, что повышало вероятность обнаружения биологически активных соединений, способствовало выявлению, так называемых, «соединений — хитов», обладающих повышенной биологической активностью, и при выявлении закономерности «структура — активность» позволяло наметить пути дальнейшей химической модификации с целью создания новых ценных биологически активных препаратов.
Материал и методы
Получение и очистка производных 3-(индол-1-ил)-, 3-(] аминоарил)- и 3-(8-тиоарил)малеимвда, характеристика соединений. Методы получения новых соединений (4, 5, 11—13, 15) (рис. 2) и их физико-химические характеристики представлены ниже. Описание ранее синтезированных соединений и методы их получения подробно приведены в наших ранних публикациях: соединения 1 [10], 2, 3 [14], 6—8 [13], 9,10 [15], 14 [16], 16 [17], 17—19 [18].
Биологическому тестированию подвергали растворы препаратов производных 3-(индол-1-ил)-, 3-(К-аминоарил)-и 3-(8-тиоарил)малеимида в диметилсульфоксиде (ДМСО).
Получение и характеристика новых оригинальных соединений 4, 5, 11—13, 15. Получение 3-(4-(диметиламино)фенилами-но)-4-(3-(пирролидин-1-илметил)-1Н-индол-1-ил)-1Н-пиррол-2,5-диона (4). К раствору индолилмалеимида 20 (100 мг, 30 мМ) в уксусной кислоте (5 мл) добавили 100 мг параформаль-дегида и 50 мкл пирролидина, реакционную смесь оставили при перемешивании на 8 ч при 75°С. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь вылили в смесь
воды (30 мл) и этилацетата (30 мл) и нейтрализовали при перемешивании бикарбонатом натрия до прекращения выделения углекислого газа. Органический слой отделили, промыли насыщенным раствором №С1, высушили (Na2SO4) и упарили в вакууме. Остаток кристаллизовали из изопропанола (5 мл). Получили 4 в виде кристаллов тёмно-коричневого цвета 85 мг, (21 мМ, 70%). Т. пл. 145—147°С (с разложением), ВЭЖХ анализ И =17,37 мин, 95,1%.
Точная масса ESI-HRMS: рассчитано для ^5^7^02 430,2238, найдено 430,2250;
Спектр 1Н ЯМР, Я, м.д. (I, Гц): 1.65 (4Н, шир с, -СН2СН2СН2СН2-), 2,36 (4Н, шир с, — СН2СН2СН2СН2-),), 2,63 (6Н, с, ^СН3)2), 3,62 (2Н, б, СН^), 6,02 (2Н, д, I = 9,0), 6,55 (2Н, д, I = 9,0), 6,81 (1Н, с), 6,96 (1Н, т, I = 7,7), 7,03 (1Н, т, I = 7,4), 7,10 (1Н, д, 1=7,9), 7,53 (1Н, д, I = 7,8), 9,52 (1Н, шир с), 11,56 (1Н, шир с);
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 23,1 (2С, -СН2СН2СН2СН2-), 40.0 (2С, ЩСН3)2), 49,8 (1С, -СН^), 53,2 (2С, -СН2СН2СН2СН2-), 92,6 (ч), 110,8, 111,3 (2С), 113,1 (ч), 118,8, 119,3, 121,6, 121,9 (2С), 126,4 (ч), 127,5 (ч) 128,1, 136,1 (ч), 137,4 (ч) 147,3 (ч), 167,5 (ч, С=0), 169,9 (ч, С=0); здесь и ниже, буква «ч» в скобках означает, что сигнал принадлежит четвертичному атому углерода.
3-(3-((Диметиламино)метил)-1Н-индол-1-ил)-4-(4-мор-фолинофениламино)-1Н-пиррол-2,5-дион (5) получали по методу, аналогичному описанному выше для соединения 4, из производного индолилмалеимида 21 и водного раствора ди-метиламина с выходом 68% в виде кристаллов тёмно-коричневого цвета. Т. пл. 153—155°С (с разложением), ВЭЖХ анализ Rt=15,16 мин, 95,4%.
Точная масса ESI-HRMS: рассчитано для С25^7^03 +Н+ 446,2187, найдено 446,2199.
Спектр Н ЯМР, Я, м.д. (I, Гц): 2,06 (1Н, б), 2,77 (4Н, г, I = 4,7, ^СН2СН20-), 3,41 (2Н, б, -СН^-), 3,60 (4Н, г, I = 4,7, ^СН2СН20-), 6,25 (2Н, а, I = 9,0), 6,57 (2Н, а, I = 9,0), 6,83 (1Н, б), 6,95 (1Н, г, I = 7,8), 6,83 (1Н, б), 7,02 (1Н, г, I = 7,9), 7,08 (1Н, а, I = 8,1), 7,50 (1Н, а, I = 7,7), 9,59 (1Н, Ъг б), 11,61 (1Н, Ъг б).
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 44,7 (2С, ЩСН3)2), 48,5 (2С, ^Н2СН20), 54,0 (1С, СН^), 65,9 (2С, ^Н2СН20), 99,4 (Я), 101,5, 110,8, 113,0 ^,114,2 (2С), 119,0, 1192, 121,7 (2С), 127,6 (я), 128,2, 129,1 (я), 135,8 (я), 137,4 (я), 147,6 (я), 167,5 (я, С=0), 169,8 (я, С=0).
Получение 3-Бромо-4-(3,4-диметоксифенилтио)-1Н-пир-рол-2,5-диона (11). К раствору дибромомалеимида 23 (100 мг, 40 мМ) в тетрагидрофуране (20 мл) при перемешивании добавляли в течение 3 ч раствор 3,4-диметокситиофенола (68 мг, 40 мМ) и триэтиламина (40 мг, 40 мМ) в тетрагидрофура-не (50 мл). Реакционную смесь сконцентрировали в вакууме и растворили в смеси этилацетата (50 мл) и воды (50 мл), органический слой отделили и промыли 5% раствором №НС03 (2x20 мл), высушили (Na2S04) и упарили, остаток суспендировали в диэтиловом эфире (5 мл) осадок отфильтровали, промыли диэтиловым эфиром (1 мл). Получили 3-бромо-4-(3,4-диметоксифенилтио)-1Н-пиррол-2,5-дион 11 в виде кристаллов желтого цвета. Т. пл. 103—105°С, ВЭЖХ анализ Rt=7,24 мин, 95,4%.
Точная масса, ESI-HRMS: рассчитано для Сl2HloBгN04S + Н+ 343,9587, найдено 343,9584.
Спектр 1Н ЯМР, Я, м.д. (I, Гц): 3,76 (3Н, б), 3,79 (3Н, б), 7,00 (1Н, а, I = 9), 7,15 (1Н, а, I = 8,5), 7,16 (1Н, б), 11,48 (1Н, б, NH)
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 56,1, 56,9, 112,0, 116,5, 117,8, 119,1, 127,8, 141,5, 148,0, 151,0, 164,0, 165,7
3-бромо-4-(3,4-диметоксифенилтио)-1-метил-1Н-пиррол-2,5-дион (12) был получен из 1-метил-3,4-дибромалеимида 24 и 3,4-диметокситиофенола по методике, описанной выше для 3-бромо-4-(3,4-диметоксифенилтио)-1Н-пиррол-2,5-дион (11) как кристаллический порошок жёлтого цвета с выходом 75%. Т. пл. 103—105°С, ВЭЖХ анализ Rt=5,33 мин, 95,7%.
Точная масса ESI-HRMS: рассчитано для C13H12BrNO4S + H+ 357,9743 найдено 357,9753.
Спектр Н ЯМР, Я, м.д. (J, Гц): 2,91 (3Н, с), 3,76 (3Н, с), 3,80 (3Н, с), 7,00 (1Н, д, J = 9,0), 7,14 (1H, д, J = 86), 7,15 (1H, с).
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 24,6, 55, 55,7, 1119, 116,1, 117,5, 118,9, 127,4, 141,1, 148,8, 1503, 164,8, 166,1
Получение 3,4-Бис(фенилтио)-1Н-пиррол-2,5-диона (13). К раствору дибромомалеимида 23 (100 мг, 40 мМ) в тетрагидрофуране (20 мл) при перемешивании добавляли в течение 1 ч раствор тиофенола (90 мг, 80 мМ) и триэтиламина (80 мг, 80 мМ) в тетрагидрофуране (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин, сконцентрировали в вакууме и растворили в смеси этилацетата (50 мл) и воды (50 мл), органический слой отделили и промыли 5% раствором NaHCO3 (2x20 мл), высушили (Na2SO4) и упарили, остаток суспендировали в диэтиловом эфире (5 мл), осадок отфильтровали, промыли диэтиловым эфиром (1 мл). Получили 3,4-бис(фенилтио)-Ш-пиррол-2,5-дион 13 в виде порошка жёлтого цвета, 112 мг (35 мМ, 87%). Т.пл. 120—122°С (диэтиловый эфир). ВЭЖХ анализ Rt=6,45 мин, 96,3%.
Точная масса ESI-HRMS рассчитано для C16H11NO2S2 + H+ 314,0304 найдено 314,0314;
Спектр Н ЯМР, Я, м.д. (J, Гц): 7,22—7,33 (10H, m), 11,37 (1H, s).
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 127,9 (2C), 129,0 (4C), 129,4, 130,7 (4C), 136,3 (2С), 167,5 (2С).
Получение 3-(9Н-карбазол-3-иламино)-4-бромо-1Н-пир-рол-2,5-диона (15). К раствору 100 мг дибромомалеимида 23 (40 мМ) в 5 мл ДМФА добавляли триэтиламин (45 мг, 45 мМ) и 3-аминокарбазол (82 мг, 45 мМ). Реакционную смесь перемешивали при нагревании (70°С) в течение 8 ч. Выливали в смесь этилацетата (50 мл) и 1N HCl (20 мл), органический слой отделяли и промывали 1N HCl (2x20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл), сушили (N2SO4) и упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из изопропанола. Получали 3-(9H-карбазол-3-иламино)-4-бромо-1H-пиррол-2,5-ди-он 15 в виде кристаллов коричневого цвета Т. пл. 187—190°С, ВЭЖХ анализ Rt=8,44 мин, 97,2%.
Точная масса ESI-HRMS: рассчитано для C^H^r^O + H+ 356,0029, найдено 356,0038.
Спектр Н ЯМР, Я, м.д. (J, Гц): 7,16 (1Н, t, J = 7,5 Hz, 7,28 (1H, dd, J = 9,1 Hz, J = 2,2 Hz), 7,39 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7.93 (1H, s), 8,08 (1H, d, J = 8,0), 9.70 (1H, s), 10,91 (1H, s), 11,32 (1H, s);
Спектр 13С ЯМР, Я, м.д.: 77,7, 110,3, 111,1, 117,3, 118,6, 120,4, 121,8, 122,3, 123,9, 125,8, 127,8, 137,9, 140,4, 142,5, 167,2, 168,8
Анализ физико-химических характеристик соединений. Спектры ЯМР регистрировали на приборе «Varian VXR-400» при частоте 400 МГц (ЯМР 1H) и при 100 МГц (ЯМР 13C), используя сигнал растворителя в качестве стандарта. Масс-спектры высокого разрешения ESI регистрировали на приборе «micrOTOF-Q II» («Bruker Daltonics GmbH», Германия). Растворы образцов (0,1 мгХмл-1 в МеОН или MeCN) прямо вводили в ESI#источник с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 3 мклХмин-1. Положительно и отрицательно заряженные ионы анализировали при следующих условиях: напряжение на капилляре -4.5 и +4 кВ соответственно, давление азота в небулайзере (распылителе) 0,4 Бар (5,8 psi), скорость потока осушающего газа 4,0 лХмин-1 и температура источника 180°C. Аналитическое ВЭЖХ проводили с использованием хроматографа «Shimadzu LC10» на колонке Gemini 110А-С18 размером 4,6x250 мм с зернением 5 мкм («Phenomenex», США). Детектирование проводили на спектрофотометре «Shimadzu UV#VIS 10A» при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения. Подвижная фаза состояла из 0,2% НC00NH4 (А) и ацетонитрила (В). Элюция проходила в градиентном режиме, при котором процентное содержание ацетони-трила (В) изменялось от 30 до 90% за 20 мин и сохранялось равным 90% — 10 мин при скорости потока — 1 млХмин-1. Объем петли инжектора — 10 мкл, образцы вводили до концентрации 0,01—0,05 мгХмл-1 в смеси ацетонитрил—вода (1:1).
Препараты сравнения, материалы и реактивы. Препаратами сравнения служили левофлоксацин, «Белмедпрепараты РУП», Беларусь (в отношении бактерий) и амфотерицин В, Sigma, США (в отношении грибов), а также препарат трис(1-пентилалкилиндол-3-ил)метилия хлорида, полученный в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, как описано ранее [19, 20]. В модельной системе Halobacterium salinarum препаратом сравнения служил ловастатин (Merck Sharp & Dohme, США). Применяемый в этой системе препарат лактона D,L-мевалоновой кислоты (Sigma, США) для получения кислотной формы подвергали щелочной обработке, как описано ранее [21].
В работе использовали одноразовые стерильные 96-лу-ночные планшеты, Пан-Эко, Россия, пластиковые чашки Петри, пластиковые стерильные пипетки, пробирки, Пан-Эко, Россия, одноканальные и многоканальные дозаторы ВНИИ БП, Россия, фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм Millipore, США.
Микробные штаммы, питательные среды, условия культивирования. Для определения антимикробной активности препаратов были использованы следующие культуры бактерий: Staphylococcus aureus ATCC 21027 (=209 P), Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli АТСС 25922, Halobacterium salinarum (H.halobium АТСС 29341), дрожжи Candida albicans ATCC 14053 и грибная культура Aspergillus niger ATCC 16404.
Для выращивания микроорганизмов и постановки экспериментов по выявлению биологической активности соединений использовали следующие жидкие и плотные питательные среды: триптиказо-соевый агар, среда Мюллера—Хинтон (Acumedia, Baltimore, США), среда Гаузе 2 следующего состава (г/л): глюкоза — 10, пептон — 5,0, триптон — 5,0, NaCl — 5,0, CaCO3 — 2,5, агар — 20, pH 7,0—7,2. Дрожжи C.albicans выращивали на агаре Сабуро (пептон — 10 г, глюкоза — 40 г, агар — 20 г, дистилированнная вода — 1 л, pH 6,0), культуру мицелиальных грибов Aspergillus niger — на картофельно-глю-козном агаре (картофель — 200 г, глюкоза — 20 г, агар — 15 г, дистилированнная вода — 1 л, pH 5,5—6,0). Культуру H.sali-narum выращивали в питательной среде с повышенным содержанием NaCl следующего состава (в %): NaCl — 18,0; MgSO4x7H2O — 0,1; K2HPO4 — 0,1; дрожжевой экстракт — 1,0; вода — до 100; рН — 7,0—7,2.
Для определения антибактериального действия использовали жидкую среду Мюллер—Хинтон, для выяснения действия соединений на грибы использовали среду RPMI 1640 с L-глю-тамином, без бикарбоната натрия, которую готовили из сухой среды (ICN Biomedicals Inc., Ohio, USA) путём разведения в дистиллированной воде, последующего забуферивания с использованием 0,165 М морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS; ACROS ORGANICS, New Jersey, США) и доведения рН среды до 7,0 добавлением 1 н раствора NaOH. Питательную среду RPMI 1640 стерилизовали фильтрацией под давлением через фильтры Sterivex-GV 0,22 мкм (Millipore, США).
Определение антимикробной активности тестируемых соединений in vitro. Определение антимикробной активности тестируемых соединений in vitro производили путём выявления их минимальной подавляющей концентрации — методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде с использованием 96-луночных стерильных планшетов, в соответствии с требованиями Американского национального комитета клинических лабораторных стандартов [22—25], а также методом диффузии в агар.
Для экспериментов по определению антимикробной активности тестируемых соединений готовили инокулюм бактериальных и грибных тест-культур, для чего использовали чистую суточную культуру бактерий, 2-суточную культуру дрожжей C.albicans и 5-суточную культуру грибов A.niger, выращенных на соответствующих плотных питательных средах при температуре 35°C. Далее в стерильном физиологическом растворе (0,85 % NaCl) готовили взвесь микроорганизмов, доводя её до определённой плотности. Плотность бактериальных суспензий составляла 0,5 по стандарту МакФарланда (1,5x108 КОЕ/мл) и при дальнейшем разведении бульоном
Мюллера—Хинтон в 100 раз концентрация микробных клеток снижалась 5х105 КОЕ/мл.
Плотность суспензии дрожжей и грибов контролировали спектрофотометрически, добиваясь 0=0,11 при длине волны 530 нм. Дальнейшее разведение средой ИРМ1 1640 суспензии дрожжевых клеток в 1000 раз и суспензии клеток грибов в 100 раз позволяло получить инокулюм с двукратной, по сравнению с опытом, концентрацией клеток. Конечная концентрация дрожжевых клеток в опыте составляла 1—5х103 клеток/мл. Конечная концентрация спор грибов в опыте составляла 0,4—5х104 клеток/мл. Количество клеток в иноку-ляте проверяли путём высева на плотные питательные среды и подсчёта выросших колоний.
Тестируемые вещества растворяли в ДМСО с начальной концентрацией 5 мМ и в том же растворителе готовили серии двукратных разведений от 5 мМ до 36 мкМ. Затем полученные растворы в ДМСО разводили в 50 раз (сначала в 10, а потом в 5 раз) в стандартной используемой для опыта среде. При постановке опыта (т.е. при смешивании с инокулятом тест-микроорганизмов, приводившему к дальнейшему двукратному разведению) конечная концентрация растворителя снижалась до 1%.
Эксперименты проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных планшетах. В лунки каждого планшета вносили сначала по 100 мкл растворов серийных разведений тестируемых препаратов (содержание ДМСО — 2%), а затем по 100 мкл раствора инокулята тест-культуры. Конечная концентрация препаратов в опыте после внесения микробных инокуля-тов составляла от 50 до 0,15 мМ при концентрации растворителя (ДМСО) 1%. Испытания проводили не менее чем в трёх повторностях. В панель эксперимента в качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.
Планшеты инкубировали при 35°С. Оценку роста культур проводили визуально через 24 ч для бактериальных культур и культуры C.albicans и через 48 ч для A.niger. МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма.
При изучении антимикробного действия соединений методом диффузии в агар в чашках Петри на поверхность органического агара Гаузе 2, с внесёнными в него тестируемыми соединениями в различной концентрации, наносили суспензии соответствующих тест-культур, после чего чашки помещали в термостат и выдерживали при 35°С до полного прорастания тест-культур. МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, предотвращающую рост тест-культуры.
При использовании разновидности метода диффузии в агар в плотной питательной среде Гаузе 2 с внесённой суспензией микробной тест-культуры делали лунки диаметром 9 мм, после чего в них вносили тестируемые соединения в разной концентрации в виде 20% водных растворов ДМСО. Чашки инкубировали при 37°С 16 ч до полного прорастания тест-культуры и появления отчётливых зон подавления роста вокруг лунок, что позволяло проводить количественное определение тестируемых соединений путём измерения диаметра зон.
Тест-система для выявления противоопухолевых соединений. Работу с бактериальной культурой H.salinarum проводили как описано ранее [21, 26]. Выращивание микробной культуры производили в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах с круглым дном, предназначенных для проведения иммунологических реакций («Медполимер», С-Пб.). Объём питательной среды в каждой лунке (пробе) составлял 150 мкл. Инкубирование проводили в термостате при 37°С в течение 5—22 сут. Для предотвращения высыхания проб в термостате создавали условия повышенной влажности.
В качестве посевного материала использовали культуру H.salinarum, выращенную на агаризованных питательных средах в течение 1 нед. Клетки суспендировали в жидкой питательной среде с использованием вибратора «Вортекс ЕЬМЬ> (Латвия) и разводили питательной средой до нужного объёма. Начальная оптическая плотность посевного материала, кон-
Рис. 2. Химическая структура изучаемых соединений.
тролируемая в микрокалориметре МКМФ-1 (Россия), составляла 0,005—0,015 (в 1 см кюветах при 570 нм).
Препарат мевалоновой кислоты вносили в конечной концентрации 3 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования.
Исследуемые препараты растворяли в ДМСО с начальной концентрацией 6,4 мМ, в том же растворителе готовили серии двукратных разведений от 6400 до 12,5 мкМ и вносили в среду культивирования Н^аИпагит. При внесении в каждую ячейку препарата из расчёта 1,5 мкл на 150 мкл среды конечное содержание ДМСО в эксперименте не превышало 1%. Концентрацию препаратов рассчитывали в мкМ.
Каждый препарат в эксперименте присутствовал не менее, чем в трёх повторностях. В панель эксперимента в качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.
Оценку роста проводили фотометрически с помощью ми-кроплейтфотометра вертикального сканирования (ИФКО-2, Россия) после перемешивания содержимого лунок, а также визуально, оценивая рост клеток Н.шИпагит в виде плотного осадка красного цвета на дне лунки [21].
МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма (МПК-1, шкала роста = 0). Для выявления тонких различий
между препаратами в ряде случаев МПК оценивали как минимальную концентрацию, при которой допускался умеренный (50% от уровня контроля) рост тест-организма (МПК-2, шкала роста = 2) [27].
Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Ехсе1, рассчитывая средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием ¿-критерия Стьюдента (р<0,05).
Результаты исследования
Химическая структура всех малеимидов, представленных в настоящем исследовании, приведена на рис. 2.
Ряд соединений (номера: 1—3,6—8,9,10,14, 16, 17—19) были синтезированы нами ранее [13—18], другие соединения (номера: 4, 5, 11—13, 15) были впервые получены в настоящем исследовании.
Представлены схемы синтеза новых оригинальных соединений 4, 5, 11—13, 15. Производные 4 и 5 были получены из описанных ранее ин-
Рис. 3. Схема синтеза соединений 4 и 5.
Рис. 4. Схема синтеза соединений 11-13, 15.
Рис. 5. Соединение 25. Производное турбомицина А -хлорид трис(1-пентилиндол-3-ил)метилия.
долилмалеимидов 20 и 21 [18] по реакции Ман-ниха, в стандартных условиях (рис. 3).
Производные 11—13 и 15 были получены конденсацией дибромомалеимидов 23 и 24 с соответствующими тиофенолами или аминокарба-золом в присутствии основания (триэтиламин). В
зависимости от условий реакции оказалось возможным получение как ди-, так и мо-нотиоарильных производных (13 или 11, 12) (рис. 4).
Использованные в работе соединения относились к производным малеимида, замещённым по положениям 3 и 4, однако принадлежали к различным классам химических соединений. Условно их можно разделить на несколько групп:
1) диалкиламинометиль-ные производные 3-(индол-1-ил)-4-аминоарилмалеими-дов (2—5),
2) производные по малеи-мидному атому азота малеи-мидодиазепина (6—8),
3) метиленоксиалкильные производные (9, 10),
4) арилтиольные производные (11—13),
5) другие (стандартный ингибитор протеин-киназы С альфа (1); 4-замещённые 3-бромалеи-миды (14—16); 3-индоло-4-пирроломалеимид 18 и его циклический аналог 19).
Широкий диапазон взятых в испытание малеи-мидов объясняется необходимостью повысить вероятность обнаружения среди них соединений, обладающих биологической активностью. Кроме того, в связи с чрезвычайно большим разнообразием существующих у бактерий и животных протеин-киназ, на которые малеимиды способны оказывать свое ингибирующее воздействие, значительное разнообразие малеимидов по химической структуре может способствовать обнаружению соединений, обладающих специфичностью в отношении микробных клеток. Широта диапазона полезна также для общей оценки изучаемых групп малеимидов с целью выявления среди них наиболее перспективных классов соединений для проведения дальнейшей химической модификации.
При оценке антимикробного действия в качестве препаратов сравнения были использованы фтор-хинолоновый антибиотик третьего поколения лево-флоксацин (в отношении бактерий), амфотерицин В (в отношении грибов). Активность производных ма-
Таблица 1. МПК производных малеимида, обладающих антимикробной активностью
Соединение МПК, мкМ
B.subtilis S.ureus E.coli C.albicans A.niger
ATCC 6633 ATCC 21027 АТСС 25922 ATCC 14053 ATCC 16404
11 1 1 80 40 12
12 4 2 >128 60 3
13 10 8 >128 20 10
14 12 8 >128 20 12
25 — 1 >128 2 2
Лф 4 1 0,5 >128 >128
Ам В >128 >128 >128 0,5 0,5
Примечание. МПК - минимальная подавляющая концентрация; Лф - левофлоксацин (для бактерий); АмВ - амфо-терицин В (для грибов).
леимида была сопоставлена с активностью нового соединения 25 — с новыш антибиотиком — производным турбомицина А — пентильным производным трис(1-алкилиндол-3-ил)метана, разработанным в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе (рис. 5).
Ряд производных показали выраженную антимикробную активность in vitro в отношении грам-положительных бактерий, дрожжей C.albicans и грибов A.niger (табл. 1). Наиболее активными в отношении грамположительных бактерий оказались вновь синтезированные арилтиольные производные — соединения 11 и 12. Их МПК в отношении S.aureus ATCC 21027 составила, соответственно, 1 и 2 мкМ. Оба соединения были активны в отношении грибов A.niger и практически не активны в отношении дрожжей C.albicans. Особенно высокую активность в отношении грибов A.niger проявило соединение 12 (МПК 3 мкМ).
Тиоарильное производное 13 и 4-замещён-ныш 3-броммалеимид 14 проявляли умеренную активность в отношении грамположительных бактерий S.aureus (МПК 8 мкМ) и грибов A.niger (МПК 10 и 12 мкМ). При этом оба соединения проявили активность в отношении дрожжей C.albicans (МПК 20 мкМ).
По своей активности в отношении грамполо-жительныгх бактерий наиболее активные соединения 11 и 12 практически не уступали левофлок-сацину, взятому в качестве препарата сравнения, а также новому высокоактивному бутильному производному трисинолилметана (25).
Вместе с тем все изученные соединения оказались практически полностью неактивными в отношении грамотрицательных бактерий E.coli что свидетельствует о специфическом характере их антимикробного действия.
Оценка соединений 1—19 и 25 в тест-системе H.salinarum, применяемой нами для отбора ингибиторов биосинтеза стеролов и противоопухолевых антибиотиков, показала, что многие производные малеимида проявляют себя в указанной тест-системе (табл. 2). Наиболее активные тиоа-рильные соединения 11—13 проявили умеренную активность в отношении H.salinarum (МПК 8—16
Таблица 2. МПК производных малеимида, обладающих антимикробной активностью
Соединение МПК, мкМ
МПК-11 МПК-22
1 32 16
2 24 8
3 24 8
4 16 4
5 >64 32
6 16 2
7 >64 64
8 24 3
9 32 8
10 >64 32
11 8 1
12 16 2
13 16 4
14 64 16
15 >64 16
16 >64 >64
17 >64 >64
18 64 16
19 >64 64
25 8 1
Ловастатин 3 0,7
Примечание. 1 - МПК-1 - определена как минимальная концентрация препарата, полностью предотвращающая рост тест-культуры; 2- МПК-2 - определена как минимальная концентрация препарата, при которой происходит подавление роста на 50%.
мкМ), правда, существенно меньшую, чем взятый для сравнения ингибитор биосинтеза стеро-лов ловастатин (МПК 3 мкМ).
Внесение в тест-систему H.salinarum экзогенной мевалоновой кислоты, резко снижало подавляющее действие ловастатина, однако не влияло на активность производных малеимида, что свидетельствует о серьёзных отличиях в механизме действия указанных соединений от ловастатина. Вместе с тем, способность к подавлению H.sali-narum соединениями 11—13, препаратом 25, а также такими соединениями, как 4, 6 и 8, которые не проявили никакой иной антимикробной активности, позволяет предполагать наличие у этих производных потенциальных противоопухолевых свойств.
Вместе с тем соединение 14, которое проявило выраженную антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий, дрожжей и грибов (см. табл. 1), в тесте с H.salinarum было практически неактивным (см. табл. 2), что заставляет рассматривать его исключительно в качестве потенциального антимикробного препарата.
Обсуждение результатов
В настоящем исследовании проводилась оценка соединения в ряду производных 3-(индол-1-ил)-, 3-^-аминоарил)- и 3-(8-тиоарил)малеи-мида, полученных в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе путём полного химического синтеза. У ряда соединений выявлена антимикробная активность in vitro в отношении грамположительных бактерий и грибов. Некоторые соединения проявили активность в отношении бактериальной культуры H.salinarum, разработанной нами для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов и хорошо зарекомендовавшей себя в отборе соединений, обладающих противоопухолевым действием [21, 26].
Стандартный ингибитор протеинкиназы С альфа BIS-I (соединение 1) не проявил активности в отношении культур бактерий, дрожжей и грибов в первом тесте и лишь незначительную активность в отношении культуры H.salinarum. Из группы ди-алкиламинометильных прозводных 2—5 ни одно не было активно в отношении культур бактерий, дрожжей и грибов. В тоже время, они обладали слабой и умеренной (в случае соединения 4) активностью в отношении культуры H.salinarum.
Производные по малеимидному атому азота малеимидодиазепина 6—8 также не проявили антимикробной активности в отношении большинства тест-культур. Вместе с тем у диэтиламино-(6) и диметиламинопропильного (8) производных выявлена активность в отношении H.salinarum. В то же время соединение 7, содержащее остаток тиомочевины, оказалось в этом тесте практически неактивным. Производные 9 и 10 были, практически, не активны во всех тестах.
Наибольшую активность как в отношении микробных тест-культур, так и в отношении
H.salinarum проявили впервые синтезированные тиофенольные производные 11—13. 3-Бромо-4-(3,4-диметокситиофенил)малеимид (11) и его ме-тильное производное 12 проявили выраженную активность в отношении B.subtilis ATCC 6633, S.aureus ATCC 21027, а также активность в отношении A.niger ATCC 16404. Следует отметить, что замена малеимидного атома водорода на метил увеличила активность в отношении A.niger в четыре раза, при некотором снижении активности в отношении бактериальных культур.
ЛИТЕРАТУРА
I. Тренин A.C. Методология поиска новых антибиотиков: состояние
и перспективы. Антибиотики и химиотер 2015; 60: 7—8: 34—46. /
В тесте с H.salinarum производное 11 проявило максимальную активность во всей протестированной серии, сравнимую с активностью препарата 25. Введение метильного заместителя по малеимидному атому азота у соединения 11 привело к снижению активности вдвое. Бистиофе-нильное производное 13 проявило умеренную активность в отношении B.subtilis и S.aureus, а также в отношении C.albicans, A.niger. В тесте с H.salinarum соединение 13 проявило умеренную активность.
Карбазольное производное 14, обладавшее спектром и уровнем антимикробной активности, как у производного 13, в тесте с H.salinarum, в отличие от соединения 13, оказалось малоактивным. Продукт конденсации 3,4-дибромомалеи-мида с 3-аминокарбазолом (соединение 15) не проявил никакой биологической активности. Подобные результаты отмечены также для соединений 16—19.
Таким образом, настоящее исследование показало, что производные малеимидов могут обладать выраженной антимикробной активностью как в отношении грамположительных бактерий, так и грибов. Тот факт, что все испытанные соединения в отношении грамотрицательных бактерий E.coli были неактивными, свидетельствует о специфическом характере их антимикробного действия.
Следует отметить, что антимикробная активность соединений в ряду производных 3-(индол-1-ил)-, 3-^-аминоарил)- и 3-(8-тиоарил)малеи-мида выявлена впервые. Дальнейшее изучение подобных соединений с целью получения более активных антибактериальных или антифунгаль-ных средств является весьма перспективным направлением в создании новых лекарственных препаратов.
Заключение
Результаты исследования демонстрируют возможность создания в ряду производных 3-(индол-1-ил)-, 3-^-аминоарил)- и 3-(8-тиоарил)малеи-мида соединений, обладающих антимикробной, антифунгальной и, возможно, противоопухолевой активностью. Антибактериальная и антифунгаль-ная активность у тиофенильных производных ма-леимида обнаружена впервые. Полученные сведения говорят о перспективности соединений подобного типа для разработки на их основе новых антибактериальных, антифунгальных и, возможно, противоопухолевых лекарственных средств.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10300)
Trenin A.S. Metodologija poiska novykh antibiotikov: sostojanie i per-
spektivy. Antibiotiki i khimioter 2015; 60: 7—8: 34—46. [in Russian] 2. Drug discovery: practices, processes, and perspectives / Ed. by Jie Jack Li,
E.J. Corey. ISBN 978-0-470-94235-2, John Wiley & Sons, Inc., 570 p.
3. Cohen P. Protein kinases — the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2002; 1: 4: 309—315.
4. Shugar D. Viral and host-cell protein kinases: enticing antiviral targets and relevance of nucleoside, and viral thymidine, kinases. Pharmacol Ther 1999; 82: 2—3: 315—335.
5. Pindur U, Kim Y.-S, Mehrabani F. Advances in indolo[2,3-a]carbazole chemistry: design and synthesis of protein kinase C and topoisomerase I inhibitors. Curr Med Chem 1999; 6: 1: 29—69.
6. Mahboobi S, Eichhorn E, Popp A. et al. 3-Bromo-4-(1H-3-indolyl)-2,5-dihydro-1H-2,5-pyrroledione derivatives as new lead compounds for antibacterially active substances. Eur J Med Chem 2006; 41: 2: 176—191.
7. Moreau P., Anizon F, Sancelme M. et al. Syntheses and biological evaluation of indolocarbazoles, analogues of rebeccamycin, modified at the imide heterocycle. J Med Chem 1998; 41: 10: 1631—1640.
8. Omura S, Iwai Y, Nakayawa A. et al. A new alkaloid AM-2282 OF Streptomyces origin. Taxonomy, fermentation, isolation and preliminary characterization. J Antibiot (Tokyo), 1977; 30: 4: 275—282.
9. Ruegg U.T., Burgess G.M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Science 1989; 10: 6: 218-220.
10. Davies S.P., Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J 2000; 351 (Pt 1): 95—105.
11. Danilenko V.N., Osolodkin D.I., Lakatosh S.A., Preobrazhenskaya M.N., Shtil A.A. Bacterial Eukaryotic Type Serine-Threonine Protein Kinases: From Structural Biology to Targeted Anti-Infective Drug. Curr Top Med Chem 2011; 11: 1352—1369.
12. Santos J.L., Shiozaki K. Fungal Histidine Kinases. Science's STKE 2001; 2001: Issue 98: pp. re1.
13. Simonov A.Y., Lakatosh S.A., Printsevskaya S.S. et al. Search for Inhibitors of Bacterial and Human Protein Kinases among Derivatives of Diazepines[1,4] Annelated with Maleimide and Indole Cycles. J Med Chem 2008; 51: 24: 7731—7736.
14. Simonov A.Yu, Lakatosh S.A., Luzikov Yu.N. et al. Synthesis of 4-substi-tuted 3-[3-(dialkylaminomethyl)indol-1-yl]maleimides and study of their ability to inhibit protein kinase Ca, prevent development of multiple drug resistance of tumor cells and cytotoxicity. Russian Chemical Bulletin, International Edition. 2008; 57: 9: 2011-2020.
15. Simonov A.Yu., Lakatosh S.A., Luzikov Yu.N., Reznikova M.I., Preobrazhenskaya M.N. Nucleophilic substitution and cyclization reactions involving quaternized 3dimethylaminomethyl derivatives of 3,4bis(indol1yl)maleimide and 3-(indol-1-yl)-4-(indolin-1-yl)maleimide. Russian Chemical Bulletin, International Edition. 2010; 59: 7: 1442—1450.
16. Lakatosh S.A., Luzikov Y.N., Preobrazhenskaya M.N. Synthesis of 6H-pyrrolo[3',4':2,3][1,4]diazepino[6,7,1-hi]indole-8,10(7H,9H)-diones using 3-bromo-4-(indol-1-yl)maleimide scaffold. Organ Biomolec Chem 2003; 1: 826—833.
17. Simonov A.Y., Lakatosh S.A., Luzikov Yu.N. et al. Macrolactones built from the bis-3,4(indol-1-yl)maleimide scaffold Tetrahedron 2014; 70: 625—630.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Лакатош Сергей Александрович — к. х. н., Старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИ по изысканию новыгх антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва Тренин Алексей Сергеевич — д. б. н., Заведующий лабораторией Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва Симонов Александр Юрьевич — к. х. н., Научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА», Москва
18. Lakatosh S.A., Bykov E.E., Preobrazhenskaya M.N. Synthesis of 2-het-aryl-3-(indol-1-yl)-and -(3-pyrrol-1-yl)maleimides and study of their conversions under the action of protic acids. Chem Heterocyclic Comp 2011; 46: 1224—1232.
19. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts: role of N-alkyl substituents. Bioorg Med Chem 2010; 18: 18: 6905—6913.
20. Степанова E.B., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-алки-линдол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений. Известия Академии наук. Сер химическая. 2010; 12: 1—9. / Stepanova E.V., Shtil'A.A., Lavrenov S.N. i dr. Soli tris(1-alkilindol-3-il)metilija — novyj klass protivoopukholevykh soedinenij. Izvestija Akademii nauk. Ser khimicheskaja. 2010; 12: 1—9. [in Russian]
21. Тренин А.С. Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 5—6: 3—10. / Trenin A.S. Mikrobnaja model' Halobacterium sali-narum dlja poiska ingibitorov biosinteza sterolov. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 5—6: 3—10. [in Russian]
22. Рекомендации Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов США (NCCLS), [NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA 2000]. / Rekomendacii Nacional'nogo Komiteta Klinicheskikh Laboratornykh Standartov SShA (NCCLS), [NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antibacterial Susceptibility Testing, USA 2000]. [in Russian]
23. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012; 944. / Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskikh issle-dovanij lekarstvennykh sredstv. Chast' 1. / Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K, 2012; 944. [in Russian]
24. Clinical and laboratory standards institute: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. In Third International Supplement CLSI M27-S3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania. 2013.
25. Clinical and laboratory standards institute: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. In approved standart. 2nd ed CLSI M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Pensylvania. 2008.
26. Тренин А.С., Цвигун E.A., Бычкова О.П., Лавренов С.Н. Микробная модель Halobacterium salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина А, обладающих противоопухолевым действием. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 9—10: 3—7. / Trenin A.S., Cvigun E.A., Bychkova O.P., Lavrenov S.N. Mikrobnaja model' Halobacterium salinarum v otbore sinteticheskikh analogov antibiotika turbomicina A, obladajushhikh protivoopukholevym dejstviem. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 9—10: 3—7. [in Russian]
27. Wayne P.A. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; Approved Standard. NCCLS Document M38-A. NCCLS. 2002. ISBN 1-56238-470-8.
Лавренов Сергей Николаевич — к. х. н., Старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА», Москва Бычкова Ольга Петровна — к. б. н., Старший научный сотрудник лаборатории Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА», Москва Цвигун Елена Анатольевна — научный сотрудник лаборатории Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА»
