Цитопротекторное действие комбинации таурина с цинка диаспартатом у крыс с поражением канальцев нефронов сулемой Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Цитопротекторное действие комбинации таурина с цинка диаспартатом у крыс с поражением канальцев нефронов сулемой

Басалай О.Н.1, Сенчук В.В.2, Кравчук Р.И.1, Бушма М.И.1, Михальчук Е.Ч.1, Зиматкин С.М.1, Бушма К.М.1, Шейбак В.М.1

11родненский государственный медицинский университет, Беларусь 2Белорусско-голландское совместное предприятие ООО«Фармлэнд», Минск

Basalai O.N.1, Sentchouk V.V.2, Kravchuk R.I.1, Bushma M.I.1, Mikhalchuk E.Ch.1,

Zimatkin S.M.1, Bushma K.M.1, Sheybak V.M.1

'Grodno State Medical University, Belarus 2Belarusian-Dutch Joint Venture«Pharmland»LLC, Minsk

Therapeutical action of combination of taurin with zinc diaspartate in rats with defects of tubules of nephrons by sublimate

Резюме. В опытах на 42 беспородных крысах-самцах показано, что внутрибрюшинное введение сулемы в течение 14 дней сопровождается повреждением эпителиоцитов проксимальных извитых канальцев корковых нефронов крыс. Тауцин (комбинация таурина (20 г/моль - 2,5 г) с цинка диаспартатом (1 г/моль - 0,35 г)), вводимый в желудок в дозе 500 мг/кг в день в течение 14 дней, оказывает цитопротекторное действие. Ключевые слова: крысы; сулемовое поражение эпителия проксимальных извитых канальцев корковых нефронов; комбинация таурина с цинка диаспартатом; цитопротекторное действие.

Медицинские новости. — 2015. — №6. — С. 73—75. Summary. In experimnts on 42 outbred male rats it is shown that introperitoneal insertion of sublimate within 14 days is followed by damage of epithelial cells in proximal convoluted tubules of cortical nephrons in rats. Taucin (taurine 20 g/mole; 2.5 g + zinc diaspartate 1 g/mole; 0.35 g) was inserted into the stomach in a dose of 500 mg/kg/day for 14 days. It has cytoprotective action.

Keywords: rats; sublimate damage of epithelim in proximal convoluted tubules of cortical nephrons; combination of taurine with zinc diaspartate; cytoprotective action.

Meditsinskie novosti. - 2015. - N6. - P. 73-75.

Сулема широко применяется в экспериментальной фармакологии для моделирования нефропатии. Преимущественно поражаются структуры, накапливающие яд: эпителиоциты проксимальных извитых канальцев (ПИК) обоих типов нефронов, а также подоциты сосудистых клубочков корковых нефронов (КН) [6]. В механизме нефротоксического действия играет роль связывание сулемы с трансмембранными SH-содержащими ферментами с развитием цитотоксичности [9].

Цель исследования - оценка цито-протекторного действия комбинации таурина с цинка диаспартатом (тауцин) по отношению к пораженным сулемой эпителиоцитам проксимальных извитых канальцев корковых нефронов крыс.

Исследование выполнено в рамках Государственной научно-технической программы Республики Беларусь «Фармацевтические субстанции и лекарственные средства» (подпрограмма «Аминокислоты») по заданию «Разработать цитопротектор и корректор метаболизма эпителиальных тканей «тауцин» и освоить его производство на СП ООО «Фармлэнд» (2011-2019).

Материалы и методы

Выполнено две серии исследований.

Первая серия. Опыты проведены на 24 беспородных крысах-самцах массой 200-250 г в соответствии с Хельсинской

декларацией о гуманном обращении с животными. Сулему (ООО «Аллхим», Украина) вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг в день в течение 14 дней. Комбинацию таурина (20 г/моль - 2,5 г) с цинка диаспартатом (1 г/моль - 0,35 г) (тауцин для доклинических испытаний - производитель СП ООО «Фармлэнд», Республика Беларусь) вводили в желудок в виде взвеси в слизи крахмала в дозе 500 мг/кг в день в течение 14 дней. Через 2 часа после последнего введения животных помещали в обменные клетки для сбора мочи в течение 24 часов. Затем их декапитировали, собирали кровь и получали плазму, извлекали левую почку для гистологических и гистохимических исследований.

Методы оценки строения ПИК КН (световая микроскопия). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином [2]. Морфометрические и цитофотометрические исследования проводили с помощью светового микроскопа Axioskop 2 plus (C. Zeiss, Германия) при увеличении 200, цифровой видеокамеры Leica FC 320 (Германия), а также компьютерной программы анализа изображения ImageWarp 2,1 (BitFlow, США).

Методы оценки активности ферментов в эпителиоцитах ПИК КН (световая микроскопия). Одни кусочки почек фиксировали в ацетоне и заключали в парафин. В этих срезах выявляли активность щелочной

фосфатазы (ЩФ) по Гомори. Другие кусочки почек замораживали в жидком азоте и помещали в криостат фирмы «Leica CM 1850» при -15 °С. В них определяли активность сукцинатдегидрогеназы (Сдг) по N. Nachlas et al. [4]. Активность ферментов оценивали по оптической плотности получаемого осадка хромогена с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (C. Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica FC 320 (Германия), программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit. Flow, США).

Методы оценки маркерных показателей нефротоксичности. В плазме и моче определяли содержание мочевины (энзи-матический уреазный метод) и креатинина (метод Илька с пикриновой кислотой), белка (биуретовый метод); рассчитывали клиренс креатинина (проба Реберга) [1]. Измеряли суточный диурез.

Вторая серия. Опыты проведены на 18 беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Препараты вводили как в первой серии. Проводили электронно-микроскопическое исследование эпителиоцитов ПИК КН. С этой целью образцы ткани коркового вещества почек (1 х 1 мм) фиксировали 1% раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллонига. Ультратонкие срезы почек исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-1011 (JEOL, Япония) при увеличениях 4 000-40 000 и ускоряющем

ВЯЯЯЯВЯП Результаты световой и электронной микроскопии морфометрических параметров проксимальных извитых канальцев корковых нефронов крыс, получавших в течение 14 дней сулему (внутрибрюшинно, 0,1 мг/кг в день) отдельно и в комбинации с тауцином (в желудок в виде взвеси в слизи крахмала, 500 мг/кг в день)

Показатель Контроль Сулема Сулема + тауцин, 500 мг/кг

Световая микроскопия ПИК КН

1-й тип канальцев, % 96,0 (94,5; 97,5) 37,5 (32,5; 41,0) 0,0008 93,5 (91,0; 95,5) 0,1 (0,0008)

2-й тип канальцев, % 3,5 (1,5; 5,5) 14,5 (10,5; 15,5) 0,0009 3,5 (2,5; 4,5) 1,0 (0,0008)

3-й тип канальцев, % 0 (0; 0) 21,5 (18,5; 23,5) 0,0008 1,0 (0,5; 1,0) 0,03 (0,0008)

4-й тип канальцев, % 0 (0; 0) 27,5 (25,5; 29,5) 0,0008 1,0 (0,5; 1,0) 0,03 (0,0008)

Канальцы, заполненные Детритом, % 0 (0; 1) 25,5 (21,0; 27,5) 0,0008 9,5 (8,5; 11,5) 0,0008 (0,0008)

Наружный диаметр канальцев, мкм 27,7 (24,0; 33,9) 37,5 (33,6; 41,2) 0,008 29,7 (28,7; 32,1) 0,5 (0,003)

Внутренний диаметр канальцев, мкм 6,9 (5,5; 7,3) 18,2 (17,5; 19,5) 0,0008 9,5 (8,7; 11,1) 0,001 (0,0008)

Высота эпителиоцитов, мкм 10,5 (10,1; 10,8) 9,5 (9,2; 10,0) 0,008 10,4 (10,1; 10,8) 1,0 (0,008)

Электронная микроскопия эпителиоцитов ПИК КН: щеточная каемка

Количество ворсинок на 100 мкм 1191,7(1155,5;1245,2) 630,4 (514,7;724,3) 0,004 984,1 (938,4; 1052,4) 0,01 (0,004)

Толщина ворсинок, мкм 0,07 (0,06; 0,07) 0,11 (0,05; 1,11) 0,004 0,08 (0,07; 0,08) 0,08 (0,004)

Длина ворсинок, мкм 2,23 (2,12; 2,29) 1,08 (1,02; 1,11) 0,004 2,04 (1,96; 2,06) 0,02 (0,004)

Митохондрии

Площадь на 100 мкм2, мкм2 38,5 (35,6; 40,7) 29,0 (26,9; 30,6) 0,01 38,2 (34,7; 40,9) 1,0 (0,006)

Количество на 100 мкм2 153,5 (141,4; 174,2) 100,2 (89,6; 106,1) 0,004 130,1 (121,1; 147,2) 0,08 (0,004)

Фактор элонгации 1,8 (1,77; 2,06) 2,2 (2,1; 2,3) 0,016 1,9 (1,7; 2,2) 0,7 (0,1)

Деструктивные и погибшие, % 17,5 (14,0; 23,5) 38,5 (33,0; 45,5) 0,016 12,0 (8,5; 13,0) 0,05 (0,006)

Делящиеся, % 16,5 (8,0; 18,5) 52,0 (40,0; 61,5) 0,004 38,0 (33,5; 48,0) 0,006 (0,08)

П р и м е ч а н и е : Первая строка цифр - значения Ме и 25-75% квартилей (в скобках). Вторая - р: без скобок - в сравнении с контрольными животными, в скобках - с получавшими сулему крысами. Полужирным шрифтом выделены статистически значимые значения р (с учетом поправки Бонферрони).

напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовали комплекс из цифровой камеры Olympus MegaView III (1ермания) и программу обработки изображений iTEM [7].

Количественную оценку результатов, полученных в обеих сериях, про-

водили методом непараметрической статистики Манна - Уитни, применяя поправку Бонферрони с использованием пакета программ «Statistica» 6.0.437.0 для Windows (StatSoft, Inc., США) [5].

МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ

№ 6 • 2015

74

Результаты и обсуждение

Нефротоксическое действие сулемы

По характеру и степени тяжести повреждения эпителия ПИК КН условно можно подразделить на 4 типа: без повреждения эпителия (1-й тип - 37,5%); с деструкцией апикальных отделов (2-й -14,5%) и более 1/2 высоты клеток (3-й -21,5%); полным разрушением эпителия при сохранении базальной мембраны и (или) прослоек соединительной ткани (4-й - 27,5%). Просвет 25,5% канальцев заполнен детритом, образовавшимся фрагментами разрушенного эпителия ПИК КН и его щеточной каемки. В местах его скопления блокируется ток мочи («внутриканальцевый гидронефроз»). Нарастающее гидростатическое давление приводит к увеличению наружного (в 1,4 раза), внутреннего (в 2,6 раз) диаметров канальцев и снижению (на 10%) высоты выстилающих их эпителиоцитов (табл. 1).

Повреждение сулемой эпителия ПИК КН регистрируется и на субклеточном уровне. Их микроворсинки отечны (утолщены в 1,6 раза) и более короткие (высота снижена в 2 раза). Интервалы межу ними неравномерно увеличены, что обусловлено двукратным снижением их количества за счет разрушения микроворсинок.

Площадь, занимаемая митохондриями в цитоплазме эпителиоцитов ПИК КН, снижена на 25%. Количество митохондрий снижено на 35% как следствие их деструкции и гибели. Это подтверждается потерей двуконтурности органелл и их превращением в цитоплазматические тельца (увеличение на 21%). В большинстве эпителиоцитов митохондрии сохраняют удлиненную форму. Это подтверждается увеличением на 22% фактора их элонгации. В части органелл снижено количество крист, сопровождаемое их дезориентацией. Количество делящихся митохондрий увеличено на 36%.

Зеркальным отражением патологических изменений в эпителиоцитах ПИК КН (световая, электронная микроскопия) является угнетение в них процессов метаболизма. Активность маркерных ферментов щеточной каемки (ЩФ) и митохондрий (СДГ) снижена на 35 и 58% (табл. 2).

Следствием повреждения и гибели эпите-лиоцитов и их компонентов (щеточная каемка, митохондрии), ингибирования в них активности ЩФ и СДГ является ухудшение функции почек. Содержание в плазме мочевины и креатинина увеличивается (на 38 и 57%) в результате снижения их экскреции (на 57 и 32%). Клиренс креатинина снижается (на 25%). Регистрируются протеинурия и полиурия (увеличение соответственно в 2,8 и 2,4 раза) (табл. 2).

ВЯЗИШИИ Активность ферментов в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев корковых нефронов, маркерные показатели нефротоксичности в плазме и моче крыс, получавших в течение 14 дней сулему (внутрибрюшинно, 0,1 мг/кг в день) отдельно и в комбинации с тауцином (в желудок в виде взвеси в слизи крахмала, 500 мг/кг в день)

Показатель Контроль Сулема Сулема +тауцин, 500 мг/кг

Активность ферментов в эпителиоцитах ПИК КН

Щелочная фосфатаза, ЕД ОП 0,42 (0,42; 0,44) 0,28 (0,25; 0,32) 0,0008 0,40 (0,36; 0,43) 0,1 (0,005)

Сукцинат-дегидрогеназа, ЕД ОП 0,47 (0,43; 0,48) 0,19 (0,18; 0,22) 0,008 0,43 (0,40; 0,46) 0,1 (0,0008)

Маркерные биохимические показатели нефротоксичности в плазме

Мочевина, ммоль/л 3,9 (3,6;4,3) 5,4 (4,7; 6,0) 0,004 4,3 (3,9; 4,7) 0,2 (0,002)

Креатинин, ммоль/л 54,0(47,1; 62,5) 85,2 (76,1; 94,3) 0,0008 55,5 (49,5; 61,5) 0,9 (0,0008)

Клиренс креатинина, мл/ч 9,42 (8,76; 9,78) 7,08 (6,42; 8,22) 0,0008 11,08 (10,30; 12,72) 0,002 (0,0008)

Маркерные показатели нефротоксичности в моче

Мочевина, моль/мл 0,26 (0,24; 0,26) 0,16 (0,15; 0,17) 0,0008 0,22(0,20; 0,25) 0,09 (0,0008)

Креатинин, моль/мл 0,26 (0,25; 0,27) 0,19 (0,17; 0,18) 0,0008 0,25 (0,23; 0,26) 0,09 (0,0008)

Белок, г/л 0,04 (0,03;0,04) 0,11 (0,10; 0,13) 0,0008 0,10 (0,09; 0,11) 0,0008 (0,04)

Суточный диурез, мл/100 г крысы в сутки 2,2(1,9; 2,4) 5,2 (4,9; 6,1) 0,0008 4,2 (3,8; 4,6) 0,0008 (0,002)

П р и м е ч а н и е : Первая строка цифр - значения Ме и 25-75% квартилей (в скобках). Вторая - р: без скобок - в сравнении с контрольными животными, в скобках - с получавшими сулему крысами. Полужирным шрифтом выделены статистически значимые значения р (с учетом поправки Бонферрони).

Нефрозащитное действие тауцина Сравнительный анализ двух групп крыс с сулемовой нефропатией, получавших и не получавших тауцин, свидетельствует о нефрозащитном действии тауцина.

Количество ПИК КН 1 типа превышает значения таковых у нелеченых крыс в 2,5 раза за счет снижения количества канальцев 2, 3 и 4 типов соответственно на 76, 95 и 96%. Количество канальцев, заполненных клеточным детритом, снижается на 63%. Наружный и внутренний диаметры ПИК также снижаются (на 29 и 48% соответственно). Высота эпителиоцитов увеличивается на 9%.

Вызываемые тауцином положительные изменения со стороны эпителиоцитов, выстилающих просвет ПИК КН, регистрируются и на субклеточном уровне. Минимизируются деструктивные изменения щеточной каемки, вплоть до ее полной нормализации у некоторых крыс. Длина микроворсинок увеличивается (на 89%), а толщина - снижается (на 27%). Плотность их расположения (количество) возрастает (на 56%). Количество митохондрий возрастает

(на 30%), преимущественно за счет снижения процента деструктивных и погибших (на 69%). Площадь, занимаемая ими в цитоплазме эпителиоцитов, возрастает на 32% (см. табл. 1).

Вызываемые тауцином положительные морфологические изменения в эпителио-цитах сопровождаются ускорением в них процессов метаболизма. Активность ЩФ и СДГ повышается на 43 и 126% соответственно, достигая значений контрольных крыс.

Регистрируемые под влиянием тауцина положительные изменения в строении и протекании процессов метаболизма в эпителиоцитах ПИК КН отражаются на функции органа. Увеличивается экскреция мочевины и креатинина (на 38 и 32%), клиренс креатинина (на 56%); ослабляются проявления полиурии (на 19%) (табл. 2).

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что тауцин (таурин (20 г/моль - 2,5 г) + цинка диаспартат (1 г/моль - 0,35 г)), вводимый в желудок, 500 мг/кг в день, 14 доз в значительной степени ослабляет цитотоксическое

действие сулемы по отношению к эпите-лиоцитам, выстилающим просвет ПИК КН. Это выражается в снижении процента погибших клеток и степени выраженности их деструкции, ослаблении проявлений «вну-триканальцевого» гидронефроза, улучшении щеточной каемки (увеличение ее плотности и метаболической активности, судя по активности ЩФ) и митохондрий (снижение процента погибших; метаболической активности, судя по активности СДГ). Следствием вышеперечисленных положительных изменений является улучшение функции почек (увеличение экскреции мочевины и креатинина, клиренса креатинина; ослабление полиурии).

В механизме цитопротекторного действия тауцина по отношению к эпителиоцитам ПИК КН у крыс с сулемовой нефропатией играет роль способность таурина хелати-ровать сулему, способствуя ее экскреции. Кроме того, благодаря наличию в молекуле сульфогруппы таурин обладает антиоксидант-ными свойствами [3]. Цинк в качестве кофактора входит в состав более 200 ферментов внутриклеточного метаболизма, в том числе супероксиддисмутазы, обезвреживающей цитотоксичный супероксид-анион [8].

Таким образом, тауцин, представляющий собой комбинацию таурина (20 г/моль, 2,5 г) и цинка диаспартата (1 г/моль, 0,35 г), вводимый в желудок в дозе 500 мг/кг в день, 14 доз, обладает цитопротекторным действием по отношению к эпителиоцитам ПИК КН крыс. При этом снижается процент погибших клеток, улучшается строение их щеточной каемки и митохондрий, активизируются ингибированные ЩФ и СДГ, улучшается функция органа, судя по экскреции мочевины и креатинина.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Камышников В.С. Справочник по клинико-био-химической лабораторной диагностике: в 2 т. - 2-е изд. - Мн.: Беларусь, 2000. - Т.1. - 495 с.

2. Можейко Л.А. // Методы исследования в гистологии / под. ред. С.М.Зиматкина. - Гродно: ГрГМУ 2010. - С.23-34.

3. Нефедов Л.И. Таурин: биохимия, фармакология, медицинское применение. - Гродно, 1999. - 145 с.

4. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М.: Иностранная литература, 1962. - 962 с.

5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

6. Lawrence H.L. [et al.] // J. Pharmacol. - 1999. -Vol. 5. - Р.492-502.

7. Millonig G.A. // J. Appl. Physics. - 1961. - Vol.32. -P.1637-1643.

8. Truong-Tran A.Q. // Biometals. - 2001. - Vol.14. -P.315-330.

9. ZaUups R.K. // Pharmacol. Reviews. - 2000. -Vol.5. - P.113-144.

Поступила 22.04.2015г. Статья размещена на сайте www.mednovosti.by (Архив МН) и может быть скопирована в формате Word.