CC BY
10L.V.Kravchenko, N.V.Trusov, M.A.Uskova, I.V.Aksyonov, L.I.Avrenyeva, G.V.Guseva, M.A.Vasilyeva,
A.V.Selifanov, V.A.Tutelyan
CHARACTERIZATION OF CARBON TETRACHLORIDE ACUTE TOXICITY AS A MODEL OF OXIDATIVE STRESS
Institute of Nutrition, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
A single intraperitoneal injection of CCl4 to male Wistar rats at doses of 0.05 to 0.5 ml/kg led to a rapid development of oxidative stress characterized by an increased amount of lipid peroxidation products in blood plasma, decreased antioxidant capacity of liver, suppressed activity of antioxidant enzymes, release of organelles-specific enzymes to cytosol and blood, sharp suppression of microsomal membrane-localized enzymes. An increased hemoxygenase activity and SH glutathione level were found to be in inverse correlation with the degree of CCl4-induced toxicity which can be considered as an adaptive response reflecting the ability of a cell to survive under oxidative stress conditions.
УДК 615.9:576.08
Л.Т.Базелюк, С.А.Искакова*
ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГЕПАТОРЕНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ЗАТРАВКЕ
ПАРАМИ ЭЛЕМЕНТНОЙ СЕРЫ
Национальный центр гигиены труда и профзаболеваний Минздрава Республики Казахстан, Караганда
На белых крысах изучали гепаторенальную систему при ингаляционной затравке парами элементной серы в сроки 15 дней, 1, 2 и 4 месяца при концентрациях 1,76 и 12,68 мг/м3. Цитоморфологическими методами обнаружили патологические процессы в гепатоцитах. В светлых гепатоцитах встречались мелкоканальцевая жировая дистрофия, наблюдается снижение количества темных клеток, повышение количества дегенерированных светлых клеток и нейтрофилов. Со стороны почечных канальцев наблюдаются деструктивные изменения в малых и больших светлых канальцевых клетках, у большинства этих клеток встречалась белковая дистрофия, в частности, при ингаляции в течение 1 месяца в концентрации 1,76 мг/м3.
Ключевые слова: пары серы, ингаляция, гепатоциты, светлые канальцевые клетки.
Введение. Развитие нефтегазовой отрасли промышленности Казахстана привело к накоплению на серных картах запасов элементной серы до 9 млн тонн и экологическому дисбалансу в западном регионе. Это связано со сложным составом нефти и газоконденсата в этих регионах. Так, газ Карашыганакского месторождения содержит 3,8 объемных процентов сероводорода, Тенгизского — более 12% [1].
Элементная сера является химически активным веществом и может взаимодействовать со всеми компонентами окружающей среды с образованием более токсичных метаболитов. Кроме этого, элементная сера сравнительно легко под воздействием высокой температуры окружающей среды испаряется с площадок хранения в виде аэрозоля или пара [2, 3].
* фрагмент диссертационной работы
По сравнению с аналогами изучаемый образец серы имеет ряд таких преимуществ как высокая степень чистоты (99,9—99,98%), отсутствие воды (0,2%) и сероводорода и равномерный гранулометрический состав, содержание золы (0,02—0,05%), органических веществ (0,01— 0,06%) [4—8]. При проникновении токсиканта перорально в виде пара или аэрозоля восьмиатомная молекула серы проникает в организм и в первую очередь поражает гепаторенальную систему: печень и почки. При хроническом воздействии нефтепродуктов у рабочих наблюдались нарушения клубочковой фильтрации, азотемия, уменьшение почечного резерва [9].
Целью нашей работы явилось установление на экспериментальных животных действия серы на качественный и количественный состав клеток печени и почек.
Материалы и методы исследования. В данной работе использовали одну из товарных форм се-
ры с месторождения Тенгиз. Сера техническая газовая гранулированная — твердое вещество в виде однородных гранул желто-зеленого цвета размером от одного до пяти миллиметров.
Проведены исследования на беспородных крысах-самцах (массой 200—230 г), всего 90 животных, содержащихся в виварии при естественном световом режиме на стандартной диете со свободным доступом к воде. Животные были разделены на 9 групп: 1-я группа — контрольная, 11-я группа — подвергалась 15-дневной ингаляционной затравке аэрозолью элементной серы в концентрации 1,76 мг/м3, 111-я группа — подвергалась ингаляционной затравке в концентрации 12,68 мг/м3 в эти же сроки, IV и ^я группа — срок затравки 1 месяц и те же концентрации соответственно, VI и VII-я группа — 2 месяца и те же концентрации соответственно, VIII и К-я группа 4 месяца и те же концентрации соответственно. Ингаляции аэрозолем элементной серы производили в течение 4-х ч по 5 дней в неделю статическим методом в затравочных камерах Б.А.Курляндского, емкостью 200 литров. Пары элементарной серы получали методом песчаной бани по И.В.Саноцкому [10]. ПДК серной пыли в воздухе рабочей зоны установлена на уровне 6 мг/м3 [4], отталкиваясь от этой цифры, была взята концентрация 12,68 мг/м3, как группа сравнения, при которой биохимические сдвиги отражают интоксикацию организма. Концентрация 1,76 мг/м3 ниже уровня действующей ПДК в воздухе рабочей зоны, однако, по мнению Л.П.Бри-линского [2], ПДК в воздухе рабочей зоны долж-
на быть снижена до 2 мг/м3.
По окончании эксперимента животных подвергали эвтаназии методом мгновенной декапи-тации в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Министерством высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.84 [11].
С печени и почек делали мазки-отпечатки, которые высушивали при комнатной температуре. Мазки-отпечатки фиксировали в смеси Никифорова 10 мин, окрашивали гематоксилином и эозином. При микроскопировании считали 300 клеток с каждого препарата. Оценку значимости результатов проводили по критерию Стьюдента при постоянном уровне значимости (р < 0,05).
Результаты и обсуждение. При 15-дневной ингаляции парами элементной серы в концентрации 1,76 мг/м3 у животных П-ой группы в мазках-отпечатках печени отмечено повышение количества купферовских клеток на 75%, в мазках-отпечатках почек наблюдается повышение дегенерированных малых канальцевых клеток (ДМКК) и дегенерированных больших светлых канальцевых клеток (ДБСКК) в 3,9 раза и на 95%, соответственно, наблюдается снижение БСКК на 39% и повышение количества фиб-робластов на 78% по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1 и 2).
При концентрации 12,68 мг/м3 в эти же сроки у Ш-ей группы животных наблюдали снижение количества темных клеток (ТК) на 52%, повы-
Таблица 1
Цитоморфологические показатели печени в (%) клеток у экспериментальных животных при
ингаляционной затравке аэрозолью элементной серы (M±m; n = 90)
Группа животных, концентрация,срок Гепатоциты Нейтрофилы Эозинофилы Купферовские клетки
ТК СК ДСК
I гр. Контроль, п = 12 39,10+3,50 47,70+3,70 6,40+1,10 4,40+0,80 1,20+0,60 1,20+0,20
II гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 15 дней, п = 10 32,0+2,88 54,9+3,42 7,0+1,01 4,00+0,90 0,0+0,00 2,10+0,93*
III гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 15 дней, п = 10 25,69+1,95* 54,04+4,04 9,74+1,73* 7,28+1,37* 0,0+0,00 3,25+0,57*
IV гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 1 месяц, п = 10 21,46+1,87* 55,57+3,65 8,54+1,48* 8,27+1,69* 0,0+0,00 6,16+0,71*
V гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 1 месяц, п = 10 33,07+3,18 47,14+3,13 9,63+1,19* 6,99+1,40* 0,0+0,00 3,17+0,57*
VI гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 2 месяца, п = 10 44,7+4,30 16,5+1,60* 13,5+1,87* 23,6+2,20* 0,0+0,00 1,70+0,70*
VII гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 2 месяца, п = 9 32,6+3,12 20,1+2,66* 15,7+2,41* 25,6+2,48* 1,0+0,32 5,0+0,66*
VIII гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 4 месяца, п = 10 30,0+2,90* 50,1+3,65 6,0+1,6 10,0+1,36* 0,0+0,00 4,0+0,60*
IX гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 4 месяца, п = 9 29,5+2,27* 45,5+2,28 6,0+0,86 13,7+1,76* 0,0+0,00 4,5+0,57*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * — достоверные изменения по сравнению с контрольной группой (р < 0,05)
шение дегенерированных светлых клеток (ДСК) и нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) на 52 и 65%, соответственно и клеток Купфера в 2,7 раза по сравнению с контрольной группой животных. В клетках почек нами отмечено повышение ДМКК и ДБСКК в 2,7 раза и на 27%, соответственно, и повышение количества НЛ на 42%, снижение количества БСКК на 29% (табл. 2).
В ГУ-ой группе при ингаляции парами серы в течение 1 месяца в концентрации 1,76 мг/м3 в ге-патоцитах печени отмечено снижение количества ТК на 82%, что составило (25,69+1,95%), а в контроле (39,10+3,50%), повышение количества ДСК и НЛ на 33 и 88%, соответственно, и куп-феровских клеток в 5,1 раза (табл. 1). В клетках почек отмечено снижение количества МКК на 76%, что составило (18,80+1,73%), а в контроле (33,1+3,10%), повышение количества ДМКК, ДБСКК и ДНЛ на 70, 23% и 2 раза, соответственно, количество фибробластов повышено в 15 раз, что составило (9,14+1,23%), а в контроле (0,60+0,20%). В У-ой группе при затравке в концентрации 12,68 мг/м3, нами отмечено в клетках печени повышение количества ДСК, НЛ и куп-феровских клеток на 50, 59% и в 2,6 раза соответственно. В клетках почек наблюдается сни-
жение количества МКК на 43%, повышается количество ДМКК и фибробластов в 3 и 7,5 раз соответственно по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1 и 2).
При двухмесячной ингаляции парами элементной серы в концентрации 1,76 мг/м3 в УГ-ой группе экспериментальных животных обнаружено в гепатоцитах снижение количества нормальных СК (16,5+1,60%), что меньше в 2,9 раза, чем в контрольной группе животных. Количество ДСК и НЛ было повышено в 2,1 и 5,4 раза, соответственно, купферовские клетки были повышены на 42% по сравнению с контрольной группой. В клетках почек наблюдали при этой же дозе повышение количества МКК на 33%, ДМКК на 83%, ДБСКК на 82%, НЛ в 3,9 раза, ДНЛ в 6,9 раза и фибробластов в 2,7 раза, а количество БСКК было снижено и составило (15,8+1,90%), что в 3,2 раза ниже контрольных величин. При двухмесячной ингаляции в концентрации 12,68 мг/м3 в УГГ-ой группе в клетках печени отмечено снижение количества СК в 2,4 раза и НЛ в 5,8 раза, купферовские клетки также были повышены в 4,2 раза и составили (5,0+0,66%) по сравнению с контрольной группой. В клетках почек при той же концентрации
Таблица 2
Цитоморфологические показатели почек в (%) клеток у экспериментальных животных при ингаляционной затравке аэрозолью элементной серы (M±m; п = 90)
Группа животных, концентрация, срок МКК ДМКК БСКК ДБСКК НЛ ДНЛ Моноциты Фибробла-сты
I гр. Контроль, n = 12 33,1±3,1 3,5+0,90 49,4+4,0 10,5+1,5 1,5+0,20 1,0+0,20 0,40+0,01 0,6+0,20
II гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 15 дней, n = 10 29,41± 11,51+097* 35,52+2,85* 29,51+1,29* 1,55+0,29 0,43+0,07 0,0+0,00 1,07+0,37*
III гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 15 дней, n = 10 37,6+2,05 7,92+0,79* 38,21+2,88* 13,37+2,41 2,13+0,50* 0,34+0,10 0,0+0,00 0,43+0,06
IV гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 1 месяц, n = 10 18,8+1,73* 5,96+1,28* 49,67+2,59 12,96+1,68* 1,46+0,64 2,01+0,60* 0,0+0,00 9,14+1,23*
V гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 1 месяц, n = 10 23,19+2,23* 10,79+1,94* 47,5+2,60 12,03+2,48 0,86+0,32 1,13+0,26 0,0+0,00 4,5+0,79*
VI гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 2 месяца, n = 10 44,0+2,27* 6,4+0,72* 15,8+1,90* 19,07+2,40* 5,8+1,10* 6,9+1,22* 0,43+0,09 1,6+0,40*
VII гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 2 месяца, n = 9 43,2+3,43* 9,5+1,6* 16,3+1,7* 23,4+2,35* 3,5+0,90* 2,2+0,37* 0,80+0,10* 1,10+0,32*
VIII гр. Концентрация 1,76 мг/м3, 4 месяца, n = 10 36,6+2,47 14,8+2,38* 17,7+2,67* 19,0+1,87* 4,4+0,90* 4,7+1,42* 0,20+0,04* 2,6+0,21*
IX гр. Концентрация 12,68 мг/м3, 4 месяца, n = 9 20,8+2,23* 18,4+2,21* 28,6+3,30* 24,3+2,67* 1,8+0,46* 2,1+0,80* 0,30+0,10* 3,7+1,40*
и сроках ингаляции отмечено: повышение МКК на 31%, ДМКК в 2,7 раза, снижение БСКК в 3 раза, повышение ДБСКК в 2,2 раза, НЛ в 2,3 раза, ДНЛ в 2,2 раза, моноцитов в 2 раза, фибро-бластов на 83% (р < 0,05).
При 4-х месячной ингаляции парами серы в концентрации 1,76 мг/м3 в "УШ-ой группе животных в гепатоцитах наблюдается снижение ТК (клеток запаса) на 30%, повышение НЛ в 2,3 раза и клеток Купфера в 3,3 раза. В клетках почек обнаружено повышение ДМКК в 4,2 раза, снижение БСКК в 2,8 раз, повышение ДБСКК на 81%, НЛ в 2,9 раз, ДНЛ в 4,7 раз, фибробла-стов в 4,3 раз и снижение моноцитов в 2 раза по сравнению с контрольной группой. При исследовании ГХ-ой группы животных, подвергшихся ингаляции парами серы в концентрации 12,68 мг/м3, в эти же сроки в клетках печени отмечено снижение количества ТК на 32%, повышение НЛ в 3,1 раза и купферовских клеток в 3,8 раза (р < 0,05).
В клетках почек обнаружено снижение МКК на 59%, повышение ДМКК в 5,3 раза, снижение БСКК на 72%, повышение ДБСКК в 2,3 раза, НЛ на 20%, ДНЛ в 2,1 раза, фибробластов в 6,2 раза и снижение моноцитов на 33% по сравнению с контрольной группой (табл. 1 и 2).
Таким образом, результаты экспериментальных исследований выявили при действии паров элементной серы формирование такого специфического клеточного механизма, как цитоток-сическое действие. При изучении цитоморфо-логических показателей в клетках печени были обнаружены такие формы темных гепатоцитов (ТГ): полигональные, приближенные к округлой, ядро округлое, относительно цитоплазмы малых размеров, часто расположено эксцентрично. От 10—20% клеток печени имели два ядра, что следует рассматривать как проявление регенерации, свойственной нормальному органу (контрольная группа). При патологических процессах количество двуядерных клеток заметно увеличивается, цитоплазма окрашена неравномерно, чаще всего это связано с дистрофическими процессами. Во всех сроках эксперимента обнаружили повышение количества НЛ, что указывает на наличие воспалительного процесса. Кроме этого, обнаружили снижение количества ТГ, светлых гепатоцитов (СГ) и увеличение дегенерированных светлых гепатоцитов (ДСГ), структура их изменена, контуры нечеткие, расплывчатые, что свидетельствует о нарушениях различных стадий жизнедеятельности клеток. Повышение при всех сроках эксперимента рети-куллярной стромы — клеток Купфера, обладающих фагоцитарной функцией, в основном зрелой формы, крупной генерации с удлиненной
цитоплазмой. Эти клетки отнесены к соединительно-тканым элементам (фибробластам). Полученные в настоящем исследовании данные показывают, что пары элементной серы при всех сроках эксперимента повышают физиологическую регенерацию структур гепатоцитов печени и повышают резистентность организма к повреждающим агентам [12-15]. При начальных проявлениях дегенерации при всех сроках эксперимента, а особенно при месячном сроке в концентрации 1,76 мг/м3, цитоплазма печеночных клеток приобретает гомогенную оксифиль-ную окраску, хроматиновые нити в ядрах становятся более грубыми, между ними отчетливо выступает парахроматин в виде бесцветных участков. При пикнотических изменениях ядра печеночных клеток уменьшаются, теряют структуру, окрашиваются в темный цвет, ядрышки не просматриваются.
В почечных клеточных канальцах нами обнаружено почти во все сроки эксперимента снижение количества МКК, БСКК и повышение ДМК, ДБСКК, а также НЛ, ДНЛ и фибробластов. Это свидетельствует о функциональном истощении секреторной деятельности и расходовании структур клеток — цитоплазма просветляется, цитогранулы исчезают, митохондрии набухают, их кристы редуцируются. Молодые клетки, как и клетки в состоянии физиологической регенерации, представляют собой типичные темные клетки. В процессе дифферен-цировки и перехода клеток к активной жизнедеятельности плотность цитоплазмы снижается, количество цитогранул и органелл уменьшается. С определенного уровня истощения ресурсов клетка может переходить в состояние обновления внутриклеточных структур. Такая попеременная деятельность клеток является составной частью их жизненного цикла. По мере старения и преобладания процессов деструкции клетки теряют свою способность к регенерации ультраструктур. Это проявляется в первую очередь в изменении клеточных мембран, проницаемость которых для гидрофильных соединений резко повышается. Цитоплазма клеток просветляется, митохондрии набухают, что завершается разрушением и отторжением клетки.
Данные экспериментальных исследований при 15-дневных, 1, 2 и 4-х месячных затравках парами элементной серы убедительно доказывают причину возникновения цитотоксическо-го действия — вследствие продолжительного поступления серы в организм животных. В почках обнаружено нарушение секреторной функции почечных канальцев, из-за резкого снижения резистентности ДМКК и БСКК, что является прямым действием паров элементной серы, так
как изменялись механизмы осморегуляции (повышение количества ДМКК).
Выводы. 1. Установлено, что при действии паров элементной серы в течение месяца в концентрации 1,76 мг/м3 наблюдаются наиболее выраженные патологические процессы в печеночных гепатоцитах; в светлых гепатоцитах встречалась мелкокапельная жировая дистрофия, наблюдается снижение ТК (клетки запаса), отмечено повышение ДСК и НЛ, что свидетельствует о нарушении детоксикационных, защитных и барьерных функций печени.
2. Установлено нарушение секреторной функции почечных канальцев уже на ранних сроках ингаляции парами серы в течение месяца при концентрации 1,76 мг/м3, выраженное в деструктивных изменениях в МКК и БСКК, у большинства клеток отмечена белковая дистрофия.
Список литературы
1. Курмангалиев О.М. Эколого-гигиенические аспекты формирования патологии мочеполовой системы в нефтегазоконденсатных регионах Республики Казахстан //Автореф. дисс. д.м.н. — Ал-маты, 2008. — 49 с.
2. Брилинский Л.П. К вопросу оздоровления условий труда рабочих, занятых добычей и переработкой самородной серы//В кн.: Актуальные проблемы эпидемиологии, микробиологии и гигиены. — Львов, 1965. — С. 60-61.
3. Кузиев Р.С., Алексевич Я.И. Состояние здоровья рабочих, занятых добычей серы // Факторы внешней среды и их влияние на здоровье населения. — Киев, 1970. — Вып. 2. — С. 51-55.
4. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. — М., 1988. — 108 с.
5. Сангалов Ю.А., Дмитриев Ю.К., Матали-нов В.И. и др. Газовая сера//Вестник Башкирско-
го университета, 2004. — № 2. — С. 31.
6. Менковский М.А. //В кн.: Природная сера. — М: Химия, 1972. — 240 с.
7. Менковский М.А., Яворский В.Т. //В кн.: Технология серы. — М: Химия, 1985. — 328 с.
8. Грунвальд В.Р. // В кн.: «Технология газовой серы». — М: Химия, 1992. — 272 с.
9. Саркулов М.Н., Курмангалиев О.М.,Кисма-нова Г.Н. Распространенность некоторых заболеваний органов мочевыделительной системы у рабочих нефтегазодобывающих заводов // Актуальные проблемы урологии. — Сборник материалов III конгресса урологов Казахстана. — Алматы, 2000. — С. 54-56.
10. Саноцкий И.В. // В кн.: Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). — М: Медицина, 1970. — С. 84-85.
11. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных. № 742 от 13.11.84. — М.: М-во высш. и ср. образов. СССР, 1984.
12. Никаноров А.А., Смагин Т.Н, Фролов Б.А. и др. Стрессорное повреждение клеток макро-фагальной системы печени и его предупреждение адаптации к периодической гипоксии // Бюлл. экс-пер. биол., 1990. — № 8. — С. 140-141.
13. Секманова С.М., Бекетова Т.П. О функциональном значении темных и светлых клеток // Архив патологии, 1985. — № 4. — С. 57-64.
14. Калашникова М.М., Сээне Т.П., Смирнова О.В. Деструктивные и восстановительные процессы в печени крыс при интенсивной физической нагрузке // Бюлл. экспер. биол., 1989. — № 9. — С. 283-285.
15. Базелюк Л.Т., Мухаметжанова Р.А. Функционально-метаболические изменения клеток печени и почек при воздействии физических факторов (обзор) // Гигиена и санитария, 2003. — № 2. — С. 76-77.
Материал поступил в редакцию 16.06.08.
L.T.Bazelyuk, S.A.Iskakova
CYTOMORPHOLOGIC INDICATORS OF THE HEPATORENAL SYSTEM IN LABORATORY ANIMALS AT
INHALATION POISONING BY ELEMENTAL SULFUR
National Center for Occupational Hygiene and Diseases, Ministry of Health of the Kazakhstan Republic, Karaganda
The hepatorenal system at inhalation poisoning by elemental sulfur was studied in laboratory animals at concentrations of 1.76 and 12.68 mg/m3 during 15 days, 1, 2 and 4 months. Using cytomorphologic investigation methods, the most expressive disturbances in liver and kidneys cells were found out such as: pathologic processes in liver hepacytes; microtubular fatty degeneration encountered in light hepatocytes; were observed a decreased amount of dark cells and an increased amount of degenerated light cells and neutrophils. As to the sectoral function of kidney tubules, destructive changes in small and large light tubular cells were observed; albuminoid degeneration encountered in most of the cells, in particular, at inhalation at a dose of 1.76 mg/m3, within a month.
