CC BY
59
медщинсшяи^утлогияо Оригинальные статьи
© 2004, СПб РО РААКИ
ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ И УРОВЕНЬ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА
Нургалиева Г.К., Шуратова С.Г., Закирьянова Г.К.*, Беляев Н.Н.*
НИИ кардиологии и внутренних болезней, Алматы
*Институт молекулярной биологии и биохимии им. МААйтхожина, Алматы, Казахстан
Резюме. Исследовали цитолитическую активность мононуклеарных клеток периферической крови, лишенных прилипающих клеток, по отношению к клеткам К-562 (NK-активность) и Р-815 (CTL-активность) и уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) у больных с острым инфарктом миокарда. Обследовано 35 больных мужского пола в 1-е, 7-е и 21-е сутки после инфаркта миокарда и 16 практически здоровых лиц в качестве контроля. Цитолитическую активность NK-клеток и CTL определяли по индикации выхода ДНК из клеток-мишеней, меченой бромдиоксиуридином, используя коммерческий набор ИФА тест-систем. ЦИК определяли стандартным методом с помощью полиэтиленгликоля. Установлено, что процент больных с отсутствием NK-активности нарастал к 21 -му дню после инфаркта (с 42,9 до 80% больных). Количество ЦИК также увеличивалось к этому моменту. Отмечалась обратная корреляция (г=-0,56) между динамикой функциональной активности NK-клеток и уровнем ЦИК. Активность CTL в динамике клинического течения заболевания повышалась в 4 раза, а процент больных с нулевой CTL-активностью снижался с 71,4% (в первый день после приступа) до 20% (на 21-й день болезни). Изменения цитолитической активности лимфоцитов свидетельствуют о возможном развитии осложнений в постинфарктный период.
Ключевые слова: инфаркт миокарда, естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты.
Nurgalieva G.K., Shuratova S.G., Zakiryanova G.K., Belyaev N.N.
CYTOLYTIC ACTIVITY OF LYMPHOCYTES AND CIRCULATORY IMMUNE COMPLEX LEVEL IN ACUTE MYOCARDIAL INFARCTION
Abstract.Cytolytic activity of periferal blood mononuclear cells, adherent cell depleted, directed to K-562 (NK-activity) and P-815 (CTL-activity) cell lines and circulatory immune complex (CIC) level in patients suffering acute myocardial infarction were studied. 16 practically healthy persons and 35 patients were examined on the 1st, 7th and 21st days after myocardial infarction. Cytolytic activity of NK and CTL cells was estimated by release of DNA labeled with bromodioxyuridine from cell targets using commercial ELISA kit. CIC were determined by standard method using polyethylenglycol. Percent of patients without NK-activity was ascertained to arise from 1st to 21st days (42,9-80%). The level of CIC was increased also to 21st day. There was negative correlation (r=-0,56) between dynamics of NK activity and CIC level. Cytolytic activity of CTL was increased in four times, and the percent of patients without CTL activity decreased during examination (71,4-20%). Changes of cytolytic lymphocyte activity testify to possible development of complication during postinfarction period. (Med.Immunol., 2004, vol.6, № 6, pp 537-540)
Адрес для переписки: Введение
Беляев Николай Николаевич, Институт Считается, что инфаркт миокарда (ИМ) сопро-
молекулярной биологии и биохимии им.МААйтхо— вождается иммунологическими изменениями, кото-жина, ул. Досмухамедова, д. 86, Алматы 480012 рЫе М0ГуТ отражать тяжесть клинического течения
Казахстан. и даже иметь диагностическое и прогностическое
Тел.: (3272)93-70-92. Факс: (3272)92-19-47 значение [6, 7]. При этом антигены, высвободивши-
Е-таИ: belyaev_nikolai@hotmail.com еся из некротического миокарда, вызывают образо-
вание антикардиальных антител и формирование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Показано, что количество ЦИК зависит от массы не-кротизированного миокарда [8]. При изучении у больных ИМ механизмов аутоиммунных реакций были получены данные, указывающие на участие сенсибилизированных Т-лимфоцитов с выраженной цитолитической активностью [5, 7].
Целью работы явилось изучение динамики изменения цитолитической активности лимфоцитов (натуральные киллеры - NK и цитотоксические лимфоциты - CTL) и уровня ЦИК периферической крови, а также их взаимосвязи у больных ИМ.
Материалы и методы
Обследовано 35 больных мужского пола, перенесших ИМ (средний возраст 48,3+5,5 года) и 16 практически здоровых лиц (контрольная группа), сопоставимых по полу и возрасту. Диагноз ИМ ставили на основании клинических, электрокардиографических и биохимических показателей. В исследование не включали больных, имевших к моменту поступления в стационар такие осложнения, как истинно кардиогенный шок, отек легких, тяжелые нарушения проводимости и ритма (АВ-блокада III степени, пароксизмальная тахикардия).
Первичный острый крупноочаговый ИМ был диагностирован у 84,4% больных, а у 15,6% больных острый ИМ был повторным. По локализации передний ИМ установлен у 69,8% больных, заднедиафрагмальный - у 28,6% пациентов. Встречались осложнения в виде нарушения ритма и проводимости (50%), сердечной недостаточности (42,8%), аневризмы миокарда левого желудочка (28,6%), острой левожелудочковой недостаточности (28,6%), рецидива ИМ (14,2%).
Больные получали стандартную терапию, включающую нитраты, ингибиторы ангиотензинпревра-щающего фермента, антикоагулянты, антиагреганты, ненаркотические и наркотические анальгетики.
Цитолитическую активность NK и CTL периферической крови исследовали в 1-й, 7-й и 21-й дни заболевания. Мононуклеарную фракцию клеток выделяли из цельной гепаринизированной крови стандартным методом, центрифугируя на градиенте плотности фиколл-верографина [4]. Моноциты удаляли двухчасовой адгезией отмытых мононуклеар-ных клеток на стеклянных чашках Петри. Цитолитическую активность неприлипаюших мононуклеар-ных клеток определяли с помощью коммерческого иммуноферментного набора Cellular DNA Fragmentation (Boehringer Mannheim, Германия), используя инструкцию, прилагаемую к набору. Принцип метода заключается в иммуноферментном определении бромдиоксиуридина, включенного в ДНК клеток-мишеней [15]. Клетки мишени, в качестве которых
использовали линию клеток эритролейкемии человека К-562 [4] для тестирования >1К-клеток и мышиную мастоцитому Р-815 [3, 10], не чувствительную к МК, для тестирования СТЬ, метили бромди-оксиуридином и инкубировали совместно с моно-нуклеарами в соотношениях 1:1,1:10 и 1:20. О цитолитической активности лимфоцитов судили по выходу меченой бромдиоксиуридином ДНК из лизи-рованных клеток-мишеней, наличие которой определяли с помощью моноклональных антител к бром-диоксиуридину в иммуноферментном анализе
Индекс цитолитической активности рассчитывали по формуле:
^—^*100%
К
где О - опыт, К- контроль (клетки-мишени без добавления мононуклеаров).
ЦИК определяли по методу [10], используя для преципитации иммунных комплексов полиэтиленг-ликоль-6000 (Мегк, США). Полученные данные обрабатывали на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ БРББ версии 9.
Результаты исследования
Цитолитическая активность N К-клеток и СИ
Оценка цитолитической активности лимфоцитов у больных с ИМ (рис.1) показала различие между ЫК-клетками и СТЬ. В первый день после инфаркта у больных цитолитическая активность МК-клеток составила 6,89 ±2,33%, а ЦТЛ - 7,08+3,63%, не различаясь с донорами. На седьмые сутки после ИМ киллерная активность изучаемых лимфоцитов изменилась несущественно (8,6±3,16%, Р>0,05 и 10,51± ±3,76%, Р>0,05 соответственно).
К концу стационарного этапа лечения (21-е сутки) активность ЫК-клеток достоверно не изменилась (4,93±3,19%, Р>0,05), тогда как активность СТЬ увеличилась почти в 4 раза (27,26±6,97%, Р<0,05). Вместе с тем, у ряда больных цитолитическая активность изучаемых лимфоцитов отсутствовала. Анализ нулевой цитолитической активности (рис.2) показал, что в первый день исследования МК-активность отсутствовала у 42,9% пациентов. У оставшихся больных МК-активность в среднем составила 12,1±2,8%. К моменту выписки из стационара МК-активность отсутствовала уже у 80% больных. У остальных 20% пациентов МК-активность увеличилась в два раза 24,7±4,1%.
Иная картина наблюдалась при анализе СТЬ-ак-тивности (рис.2). В первые сутки у 71,4% пациентов активность СТЬ не обнаруживалась, у остальных больных она составляла 24,8±7,3%. На 21-е сутки
2004, Т. 6, № 6
ЫК, СТЬ и ЦИК при инфаркте миокарда
1 сутки
7 сутки
-ЦИК |
21 сутки
Рис. 1. Цитолитическая активность ЫК-клеток и СП и уровень ЦИК в периферической крови больных острым инфарктом миокарда
СП
1 сутки 7 сутки 21 сутки
Рис.2. Процент больных острым инфарктом миокарда, у которых отсутствует цитолитическая активность ЫК-клеток и СП периферической крови
после ИМ отсутствие цитолитической активности у СТЬ отмечалось лишь у 20% больных, в то время как у остальных средняя цитолитическая активность составила 58,6±7,3%.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов
Как видно из рис.1, уже в первый день обследования у больных с ИМ уровень ЦИК (1,60±0,15 г/ л) достоверно превышал (Р<0,05) его значение у практически здоровых лиц (1,13+0,02 г/л). Еще большее увеличение концентрации ЦИК наблюдалось на 7-е сутки после ИМ (2,15±0,18 г/л), оставаясь на высоком уровне к моменту выписки (2,0±0,15 г/л).
Обсуждение
С точки зрения иммунологических процессов острый ИМ представляет собой событие, оказывающее мощное влияние на иммунную систему, по крайней мере в двух аспектах. Во-первых, сильный болевой синдром, а затем продолжительная психоэмоциональная депрессия способны вызвать тотальное угнетение иммунной системы. Во-вторых, некроз кар-диомиоцитов может приводить к появлению аутоантигенов с перспективой развития аутоиммунного процесса. Действительно, угнетение ЫК-активности после острого ИМ в первые сутки после приступа и вплоть до 6 недель наблюдали многие исследователи [2, 13, 14, 16]. Причем, было показано, что степень угнетения цитолитической активности NK-клe-ток в постинфарктный период зависит от степени психоэмоциональной депрессии пациентов и, наоборот, у больных с развитым чувством юмора и экстравертным характером МК-активность сохранялась на высоком уровне [12]. Поскольку количество 1ЧК-клеток в периферической крови при ИМ не изменяется, считают, что дефективная МК-клеточная активность характеризуется как функциональная [13].
В наших исследованиях количество больных с полным отсутствием МК-активности за три недели
после острого ИМ увеличилось почти в два раза, что согласуется с данными литературы. Исследованиями последних лет показано, что ЦИК, кортикостероиды, цАМФ и многие другие агенты, повышение которых характерно для ИМ, подавляют активность МК-клеток [1]. В этой связи мы провели оценку взаимосвязи концентрации ЦИК и цитолитической активности МК-клеток периферической крови больных с ИМ в динамике наблюдений и установили существование умеренной отрицательной корреляции (г= -0,56, Р<0,05) между данными параметрами. Следовательно иммунокомплексный механизм подавления МК-активности при ИМ можно рассматривать как одну из причин отсутствия цитолитической активности МК-клеток, наблюдаемого в наших исследованиях. Увеличение уровня ЦИК на 7-е и 14-е сутки после ИМ наблюдали и другие авторы [7,8]. Очевидно повышение уровня ЦИК при ИМ можно связать с появлением сывороточных антикардиальных антител, уровень которых возрастает в первые две недели после ИМ [И, 17]. Таким образом, прогрессивное нарастание функционального паралича МК-клеток, возможно связано с развитием аутоиммунного процесса. Поскольку МК-клетки являются важнейшим компонентом естественного иммунитета [9], подавление их активности при ИМ следует рассматривать как неблагоприятную иммунологическую ситуацию.
В отличие от МК-клеток активность СТЬ в наших исследованиях нарастала в динамике наблюдения. Одновременно среди больных происходило уменьшение частоты встречаемости нулевой активности СТЬ. Очевидно, это явление можно связать с развитием клеточного аутоиммунного ответа. По литературным данным в остром периоде ИМ увеличивается количество сенсибилизированных лимфоцитов, способных связывать сердечный антиген до 1,4 -4,1 % (в норме 0,8 - 0,9%) от общего числа лимфоцитов [5]. На основании наблюдений увеличения цитолитической активности Т-лимфоцитов при ИМ в 12-13 раз больше, чем при стенокардии, предлагают даже использовать определение цитолитической
функции лимфоцитов для дифференциальной диагностики ИМ и стенокардии [5].
Негативная роль активации CTL при ИМ в развитии дальнейших повреждений сердечной мышцы была подтверждена на экспериментальной модели острого ИМ, где было показано, что CTL, полученные от животных спустя 2-3 недели после ИМ, проявляли высокую цитолитическую активность в условиях in vitro по отношению к кардиомиоцитам интактных животных (18).
По-видимому, повышение цитолитической активности Т-лимфоцитов может предопределять возможное развитие осложнений. Механизм активации CTL при ИМ нуждается в дальнейших исследованиях.
Список литературы
1. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия: их роль в дисрегуляторной патологии // Патол. физиол. эксперимент. терапия.-2001.-№4.-С.3-10.
2. Бахов Н.И., Александрова Л.З., Осипов С.Г., Наумов В.Г., Руднев В.И. Антителозависимая и естественная клеточная цитотоксичность у больных с обширной кардиомиопатией // Тер. Арх.-1986,-Т.58.-№10.-С.62-67.
3. Булегенова М.Г. Взаимодействие иммуноком-петентных клеток, участвующих в противоопухолевом иммунитете, при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта. Дисс. докт. мед. наук.-Алматы,1999.
4. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Караулова А.В.-М.: Медицинское информационное агенство, 2002.-650 с.
5. Миррахимов М.М., Китаев М.И., Туребаева Б.Н., Евстропов В.М. Антигенсвязывающие лимфоциты при ОИМ // Кардиология.-1981 .-№ 1 .-С. 12-15.
6. Рысмендиев А.Ж., Имантаева Г.М., Шуратова С.Г., Тукешева С.Г., Тукешева Б.Ш., Сураболдиева Ж.А. Клинико-иммунологическая характеристика комплексного лечения инфаркта миокарда.-Алматы, Айкос, 1999.-196 с.
7. Рысмендиев А.Ж., Шуратова С.Г., Имантаева Г.М. Иммунология ишемической болезни сердца,-Алматы, 2001.-109 с.
8. Шустваль Н.Ф., Киношенко К.Ю. Циркулирующие иммунные комплексы у больных острым ин-
фарктом миокарда //Врачебное дело.-1986.-№10.-С.96-98.
9. Ярилин А.А. Основы иммунологии.-М.: Медицина, 1999.-607 с.
10. Bilsborough J., Van Pel A., Uyttenhove С., Boon Т., Van den Eynde B.J. Identification of a second major tumor-specific antigen recognized by CTLs on mouse mastocytoma P815//J. Immunol.-1999.-Vol.162.-P.3534-3540.
11. Dimitrievic М., Vasilievic Z., Vuckovic-Dekic L„ Spasic S. The involvement of immune reactions in cardiac damage during acute myocardial infarction: role of cell-mediated immune response // Panminerva Med.-1997.-Vol.39.-P.85-94.
12. Ishihara S., Nohara R., Makita S., Imai М., Kubo S., Hashimoto T. Immune function and psychological factors in patients with coronary heart disease // Jpn. Circ. J.-1999.-Vol.63.-N9.-P.704-709.
13. Klarlund K., Pedersen B.K., Theander T.G., Andersen V. Depressed natural killer cell activity in acute myocardial infarction // Clin. Exp. Immunol.-1987.-Vol.70.-Nl.-P.209'216.
14. Kuroki S., Miyahara K., Uematsu T. Immunological aspects in patients with acute myocardial infarction //Jpn. Circ. J.-1993.-Vol.57.-Nl.-P.37-46.
15. Portsmann Т., Ternynck Т., Avrameas S. Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation into DNA: an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response // J.Immunol. Meth.-1985.-Vol.82.-Nl.-P.169-179.
16. Tonnesen E., Brinklov M.M., Schou Olesen A., Christensen N.J. Natural killer cell activity in a patient undergoing open-heart surgery complicated by an acute myocardial infarction // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand.-1985.-Vol.-93.-N5.-P.229-231.
17. Tsuchihashi М., Sakaguchi Y., Nakamura М., Sutani T„ Tsuruta S., Kato S., Uemura S., Nishida Y., Hashimoto Т., Kagoshima T. Two-color flow cytometry analysis of lymphocyte subsets in patients with acute myocardial infarction and post-myocardial infarction syndrome // J. Cardiol. 1995.-Vol.26.-N2.-P.69-79.
18. Varda-Bloom N., Leor J., Ohad D.G., Hasin Y., Amar M„ Fixler R., Battler A., Eldar M„ Hasin D. Cytotoxic T lymphocytes are activated following myocardial infarction and can recognize and kill healthy myocytes in vitro//J. Mol. Cell. Cardiol.-2000.-Vol.32,-P.2141-2149.
поступила в редакцию 04.03.2004 отправлена на доработку 20.03.2004 принята к печати 26.03.2004
