CC BY
12
CYTOCHROMOXIDASE ACTIVITY OF THE HEATING PARELCHEMA AT DIFFERENT ISCHEMIA TERMS AND OBTURATION JAUNDICE Akhmedov M.D.1, Askarov T.A.2, Fayziev Yо.N.3, Ashurmetov A.M.4, Ismailov КМ.5, Dalo S.F.6 (Republic of Uzbekistan) Email: Akhmedov444@scientifictext.ru
1Ahmedov Mirkhalil Dzhalilovich - Assistant; 2Askarov Takhir Askarovich - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department;
3Fayziev Yokub Nishanovich - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor; 4Ashmadmetov Akhmadzhon Makhamadzhonovich - Candidate of Medical Sciences, Assistant; 5Ismailov Farhad Mirdzhalilovich - Assistant, DEPARTMENT OF GENERAL SURGERY; 6Dalo Salva Faekovna - Student, DIRECTION: MEDICAL BUSINESS, TASHKENT PEDIATRIC MEDICAL INSTITUTE, TASHKENT, REPUBLIC OF UZBEKISTAN
Abstract: this paper discusses the cytochrome oxidase activity of the hepatic parenchyma at various periods of ischemia and obstructive jaundice. Laboratory animals with various models of hepatocellular damage (primer carbon tetrachloride - CCL4, DL-galactosamine, obstructive jaundice, ischemia) developed a test to quantify the state of the liver parenchyma by polarographic studies. The test is based on determining the coefficient of cytochrome oxidase activity obtained as a result of studying the organ in a tissue homogenate in the presence of two substrates: cytochrome C and TMPD (tetramethyl paraphenylenediamine).
Keywords: liver, ischemia, hepatocellular damage, jaundice, animals, carbon tetrachloride.
ЦИТОХРОМОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕЧЁНОЧНОЙ ПАРЕНХИМЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СРОКАХ ИШЕМИИ И ОБТУРАЦИОННОЙ ЖЕЛТУХЕ Ахмедов М.Д.1, Аскаров Т.А.2, Файзиев Ё.Н.3, Ашурметов А.М.4, Исмаилов Ф.М.5, Дало С.Ф.6 (Республика Узбекистан)
1Ахмедов Мирхалил Джалилович - ассистент; 2Аскаров Тахир Аскарович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой; 3Файзиев Ёкуб Нишанович - кандидат медицинских наук, доцент; 4Ашурметов Ахмаджон Махамаджонович - кандидат медицинских наук, ассистент; 5Исмаилов Фархад Мирджалилович - ассистент, кафедра общей хирургии; 6Дало Сальва Фаековна студент, направление: лечебное дело, Ташкентский педиатрический медицинский институт, г. Ташкент, Республика Узбекистан
Аннотация: в данной работе рассматривается цитохромоксидазная активность печёночной паренхимы при различных сроках ишемии и обтурационной желтухе. На лабораторных животных с различными моделями гепатоцеллюлярных повреждений (затравка четыреххлористым углеродом - CCL4, DL-галактозамином, механическая желтуха, ишемия) разработан тест количественной оценки состояния паренхимы печени путем полярографических исследований. Тест основан на определении коэффициента, получаемого в результате изучения в гомогенате ткани органа
активности цитохромоксидазы в присутствии двух субстратов: цитохрома-С и ТМФД (тетраметилпарафенилендиамина).
Ключевые слова: печень, ишемия, гепатоцеллюлярных повреждений, желтуха, животные, четыреххлористый углерод.
В настоящее время известны способы диагностики острых и хронических заболеваний печени, основанные на определении активности различных ферментов в крови и печёночной ткани, скорости поглощения красителей и радиоактивных веществ, по уровню метаболитов, синтезируемых данным органом [1, 2, 3, 5, 7]. Однако ни один из этих тестов диагностики не даёт представления о количестве сохранных и функционально-способных клеток паренхимы печени, а позволяет только составить качественные представления о патологическом процессе в данном органе.
В то же время такой диагностический тест необходим в гепатологии, он позволял бы объективно представлять состояние печёночной паренхимы в каждом конкретном случае, обоснованно подходить к выбору метода лечения и объёма хирургического вмешательства, его патогенетической обоснованности и адекватного течения послеоперационного периода [4].
Для решения поставленной задачи выполнены острые и хронические опыты на 200 крысах-самцах весом 160-180 грамм, 46 собаках различного веса и пола.
Избрав в качестве основного направления работы изучение митохондриальной дыхательной цепи, ответственной за энергетику печёночной клетки и потребляющей 90% кислорода, поступающего в клетку, мы исследовали активность цитохромоксидазы (цитохром а+а3). Последняя изучалась нами в присутствии двух субстратов: цитохром - с природным донором электронов и тетраметил-парафенилендиамином (ТМФД) - искусственным донором электронов. Необходимость такого методического приёма обусловлена тем, что восстановленный цитохром С передаёт электроны цитохром-оксидазному-олигоферментному комплексу, который активирует кислород с образованием OH- через цитохром а3. Восстановленный же ТМФД окисляется через цитохромы а+а3, локализованных на внутренней митохондриальной мембране (JacobE.E.,1960).
Для измерения активности цитохромоксидазы в присутствии ТМФД и цитохрома C забирали кусочек органа и в гомогенизаторе Даунса приготовляли гомогенат в среде, состоящей из 0,25 М сахарозы 2х10 -4 ЭДТА,0,01 М трис- HCL буфера (рн-7,6-7,8). Соотношение ткани печени и среды составляло 1:2 вес/объём. Полярографический анализ на ЛП-7 (ЧССР) проводили со стандартным платиновым электродом Кларка закрытого типа.
В полярографическую кювету объёмом 1,1 мл (t=37 °С) вносили полученный гомогенат в расчёте 1,4 мг белка на данный объём кюветы. После чего записывали скорость потребления кислорода. Аналогичные записи проводили при последовательном добавлении в полярографическую кювету аскорбата натрия-конечная концетрация 2 мМ, ТМФД и цитохром С в конечной концентрации 1 мкМ и 5 мкМ соответственно. Скорость дыхания выражали в нмоль О2/минутмг белка. Высчитывали прогностический коэффициент (ПК) по формуле: ПК=Цитохром С -Аскорбат Na/ТМФД-Аскорбат Na.
Цифровой материал обработан методом вариационной статистики.
Стремясь использовать более чистую модель повреждения паренхимы печени, мы использовали ишемию.
Период исследования Аскорбат-зависимое потребление О2 ТМФД- оксидазная активность Цитохром-С-оксидазная активность Отношение цитохром-С/ТМФД-оксидазных
активностей
Исходные 10,5±0,15 20,0±1,5 27,9±3,0 1,9±0,05
данные N=5 N=5 N=5 N=5
30 минут 10,5±0,26 16,5±0,45 28,6±0,86 3,0
Ишемии N=5 N=5 N=5 N=5
В % к исходным Р 0,05 Р 0,01 Р 0,05 Р 0,01
данным 100,0% 82,5% 102,5% 157,9%
60 минут 12,0±0,8 15,7±0,9 33,8±2,6 5,9±0,06
Ишемии N=5 N=5 N=5 N=5
В % к исходным Р 0,05 Р 0,01 Р 0,05 Р 0,01
данным 114,3% 78,5% 121,0% 310,5%
120 минут 11,2±0,36 15,9±0,9 49,7±6.3 8,1±0,07
Ишемии N=5 N=5 N=5 N=5
В % к исходным Р 0,05 Р 0,01 Р 0,01 Р 0,01
данным 106,7% 79,5% 178,1% 426,4%
Как следует из таблицы 1, лишение печени кислородом в условиях нормотермии почти не приводило к изменению аскорбат-зависимого потребления кислорода. ТМФД-оксидазная активность снижается наиболее существенно к 60 минутам ишемии (на 21,5%) и сохраняется практически такой через 120 минут исследования. Уровень её, начиная с 60 минут возрастает в 1,2 раза и продолжается нарастать к 120 минутам ишемии. Через 180 минут лишения печени кровотока цитохром-С-оксидазная активность возрастает в 2,4 раза (достигает 67,3±2,8 нмоль О2/мин.-1 белка (р0,01, n=5).
Интересные данные были получены нами в группе опытов с обтурационной желтухой. Лигирование общего желчного протока приводило к тому, что через 7 суток возрастала активность цитохромоксидазы при добавлении субстратов: ТМФД и цитохрома-С. Если ТМФД-оксидазная активность увеличивалась только в 1,4 раза, то цитохром-С-оксидазная активность возрастала значительно (в 3,1 раза). Возросший уровень последней сохраняется при продолжительности обтурационной желтухи 14 и 21 сутки. В эти периоды исследования прослеживается и более высокая активность ТМФД-оксидазы. Оно в 2,4 раза больше по сравнению с интактными животными и в 1,7 раза выше крыс, у которых обтурационная желтуха длительностью 7 суток.
В данной группе опытов оказалось, что 7 суток оказались критическим сроком. И действительно имела место иктеричность лап и ушных раковин, сниженная реакция на болевые раздражители, взъерошенная шерсть, выделения сукровицы из носа. При вскрытии животных отмечалось кровоизлияние в брыжейку, плевральную полость. Печень их была лимонно-желтого цвета и мягкой консистенции.
Таблица 2. Активность ТМФД-и цитохром-С-оксидаз гомогенатов печени животных с
обтурационной желтухой
Период исследования Аскорбат зависимое потребление О2 ТМФД- оксидазная активность Цитохром-С- оксидазная активность Отношение цит.-С/ТМФД-оксидазных
активностей
Исходные данные 10,5±0,15 N=5 20,0±1,5 N=5 27,9±3,0 N=5 1,9±0,05 N=5
7 суток 20,8±0,8 27,8±0,9 87,9±2,5 9,8±0,3
обтурационной N=5 N=5 N=5 N=5
желтухи в % к Р 0,01 Р 0,02 Р 0,01 Р 0,01
исходным данным 198,1% 139,0% 315,0% 515,8%
14 суток 37,7±0,9 47,5±0,8 95,7±0,6 5,9+ 006
обтурационной N=5 N=5 N=5 N=5
желтухи в % к Р 0,01 Р 0,01 Р 0,01 Р 0,01
исходным данным 359,0% 237,5% 343,0% 310,5%
21 суток 22,9±0,7 32,1±1,1 73,8±4,5 5,5±0,05
обтурационной N=5 N=5 N=5 N=5
желтухи в % к Р 0,01 Р 0,01 Р 0,01 Р 0,01
исходным данным 218,1% 160,5% 264,5% 289,5%
Виден интенсивный рост коэффициента в течение первых 7 дней наблюдения. И этот срок оказался критическим, после которого из 37 крыс погибло 22 животных, т.е. 59,4%. Остальные животные выжили и были выведены из опыта через два месяца. У них к 14 и 21 суткам исследования коэффициент составлял соответственно 5,9±0,06 и 5,5±0,05 единиц (таблица 2). При вскрытии этих животных в указанные сроки имела место реканализация протока и восстановление оттока желчи из печени [6]. Выводы:
1. Повреждения печени при различных сроках ишемии и обтурационной желтухе приводят к ингибированию цитохромоксидазы.
2. Соотношение цитохром С/ТМФД-оксидазных активностей является показателем деструкции внутренней митохондриальной мембраны и нарушения биоэнергетики гепатоцитов.
3. Уровню коэффициента соответствует определённое количество повреждённой (или сохранной) паренхимы печени.
4. Использование коэффициента позволяет прогнозировать исход заболевания.
Список литературы / References
1. Дунаевский О.А. Дифференциальная диагностика заболеваний печени. М. Медицина, 1985. 262 с.
2. Подымова С.Д. Болезни печени: Рук. Для врачей. М. Медицина, 1998. 704 с.
3. Масевич Ц.Т., Ермолаева Л.Г. Клинические, биохимические, морфологические особенности хронических гепатитов различной этиологии // Терапевтический архив, 2002. № 2. С. 35-37.
4. Наврузбеков М.С. Оценка функциональных резервов печени и методы прогнозирования печёночной недостаточности при операциях на печени // Автореферат диссертации на соискание кандидата медицинских наук. М., 2009. 34 с.
5. Сахипов С.Ж. Нарушение функционального состояния и микроциркуляции печени при механической желтухе. Дисс. к.м.н. М., 1983. 162 с.
6. Титов В.Н. Биохимические методы диагностики патологии печени. // Терапевтический архив, 1993. № 2. С. 85-89.
7. Хазанов А.И. Функциональная диагностика болезней печени. М., Медицина, 1988. 302 с.
8. Ozawa Kazue. Adaptive response of the liver mitochondrial and its relation to hepatic functional reserve. Evalution by cytochrome a (+ a 3) assay and glucosae intolerance "Asian Med J", 1980. 23. № 7. P. 499-528.
Список литературы на английском языке /References in English
1. Dunaevsky O.A. Differential diagnosis of liver disease. M., Medicine 1985. 262 p.
2. Podymova S.D. Liver Diseases: Hands. For doctors. M. Medicine, 1998. 704 p.
3. Masevich Ts.T., Ermolaeva L.G. Clinical, biochemical, morphological features of chronic hepatitis of various etiology // Therapeutic archive, 2002. № 2. Р. 35-37.
4. Navruzbekov M.S. Estimation of the functional reserves of the liver and methods for predicting liver failure in liver operations // Abstract of dissertation for the candidate of medical sciences. M., 2009. 34 p.
5. Sakhipov S.Zh. Violation of the functional state and microcirculation of the liver with mechanical jaundice. The dissertation of the candidate of medical sciences- M., 1983. -162 p.
6. Titov V.N. Biochemical methods for diagnosing liver pathology. // Therapeutic archive, 1993. № 2. Р.85-89.
7. Khazanov A.I. Functional diagnosis of liver disease. M., Medicine, 1988. 302 p.
8. Ozawa Kazue. Adaptive response of the liver mitochondrial and its relation to hepatic functional reserve. Evalution by cytochrome a (+ a 3) assay and glucosae intolerance "Asian Med J", 1980, 23 № 7. P.499-528.
