CC BY
6
Оценка прогнозных значений ПКсам выполненная в
соответствии с изложенными методическими подходами, осуществлена по нижней границе доверительного интервала (табл. 3).
Высокая сопоставимость данных, полученных на основе математического моделирования закономерностей кинетических процессов убыли веществ и растворенного в воде кислорода, с результатами традиционных опытов позволяет расширить возможности прогнозирования при высокой надежности результатов и существенном снижении трудоемкости и длительности экспериментов.
Литература
1. Айзатуллин Т. А., Лебедев Ю. М. // Итоги науки и техники. Общая экология. Биоценология. Гидробиология.— М., 1977.— Т. 4.— С. 8—74.
2. Леонов А. В., Айзатуллин Т. А. // Там же.— С. 75—137.
3. Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов.— М., 1976.
• • • А
|
Поступила 10.03.89
КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990
УДК 615.916.117.5:546.171.5J.074
К. А. Маркосян, Н. А. Пайтян, А. X. Авакян, Р. М. Налбандян
ЦИТОХРОМОКСИДАЗА КАК ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ
ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ ГИДРАЗИНА
Институт биохимии АН Армянской ССР, Ереван
Для разработки методов ускоренного нормирования химических соединений в различных объектах немаловажное значение может иметь использование таких систем in vitro, которые позволяют быстро оценивать и прогнозировать токсические свойства изучаемых соединений. В последние годы в этом направлении проводятся многочисленные исследования с микросомальной системой цитохрома Р-450 из печени [3]. Менее изучен терминальный компонент дыхательной цепи митохондрий — фермент цитохромоксидаза (ЦХО). О возможности использования ЦХО в качестве такой модели свидетельствует тот факт, что в условиях in vitro гидразин ингибирует реакцию восстановления молекулярного кислорода, катализируемую ЦХО [2]. Кроме того, в этих же условиях некоторые производные гидразина, используемые в качестве регуляторов роста растений, также ингибируют ЦХО.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния ряда производных гидразина — регуляторов роста растений — при их пероральном введении крысам на активность ЦХО из митохондрий сердца, определяемую после экстракции фермента.
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200±250 г. Животным опытных групп (в каждой группе по б крыс) пероральным путем в дозах [/ь LD50 однократно вводили гидрел (бис-кислый 2-хлорэтилфосфоново-кислый гидразиний, LD50 2200 мг/кг), дигидрел (бис-кислый 2-хлорэтилфосфоновокислый диметилгидразиний, LD50
3350 мг/кг), ДЯК (N.N-диметилгидразид янтарной кислоты, LD50 10 000 мг/кг), ГМК-Na (натриевая соль гидразида малеи-новой кислоты, LD5o 15 000 мг/кг) и квартазин [хлорид Ы,М-диметил-(р-хлорэтил)гидразиния, LD50 3400 мг/кг]. Кроме того, в 6-месячном хроническом эксперименте животным вводили ДЯК в дозах 1/1000 и 1/10 000 LD50. Контрольная группа также состояла из 6 крыс.
Митохондрии получали из сердца крыс, декапитирован-ных через 4 ч после однократного введения препаратов, по методу [4]. Суспензии митохондрий приводили к одинаковой концентрации белка путем разбавления 0,25 М сахарозой, используемой при получении митохондрий. Затем отбирали равные по объему аликвоты суспензий и из них 2 % холатом в натрийфосфатном буфере (рН 7,4) экстрагировали ЦХО. Мембранные фракции осаждали центрифугированием при 60 000 g в течение 1 ч. Содержание белка в суспензиях митохондрий и надосадочных растворах, полученных после осаждения мембран, оценивали по методу [5]. Цитохром с получали из сердца крупного рогатого скота, как было описано ранее [1]. Концентрацию цитохрома с определяли, исходя из миллимо-
ЛЯрнОГО коэффициента ЭКСТИНКЦИИ Де550(восст.-окисл.)> Рав"
ного 21 [6].
Ферментативную активность ЦХО определяли по поглощению кислорода на кислородном анализаторе фирмы «Вескшап» (Австрия) модель 0260, снабженном самописцем
Влияние производных гидразина на активность ЦХО in vitro
Производное гидразина
% ингибировання
Гидрел Дигидрел ГМК-Na Квартазин
ДЯК ДЯК
30 30 30 30 10 20
0 0 0 0
25 50
Примечание. Концентрации цитохрома с и ЦХО составляли соответственно 5,4-10~5 и 2,8'.Ю-"7 М.
■ . Ш* • Ш
* р ^ ^ t •• «Omniscrile» («Вескшап»), при помощи электрода Кларка в термостатированной 2-миллиметровой ячейке при 25 °С в 50 мМ натрийфосфатном буфере (рН 7,0) в присутствии 100 мкМ ЭДТА.
Из полученных результатов следует, что однократное введе-4 ние крысам гидрела, дигидрела, ГМК-Na и квартазина не влияет на активность ЦХО. Однако, как видно из рисунка, ДЯК на том же уровне воздействия ингибирует активность фермента примерно на 45 %. В то же время этот препарат
в низких дозах ('/moo и '/юооо LD50) в хроническом эксперименте практически не влияет на цитохромоксидазную реакцию. Полученные данные совпадают с результатами изучения общетоксического действия ДЯК при установлении его гигиенических нормативов.
Приведенные данные острых опытов показывают, что из исследованных производных гидразина лишь ДЯК влияет на терминальный фермент дыхательной цепи митохондрий — ЦХО.
Исследование влияния производных гидразина на кинетику цитохромоксидазной реакции в опытах in vitro позволили установить, что из рассмотренных производных гидразина
Влияние производных гидразина на цитохромоксидазную реакцию.
По оси ординат — относительные величины скоростей поглощения кислорода при окислении восстановленного цитохрома с цитохромокси-дазой (в %) по отношению к контролю. 1 — гидрел; 2 — дигидрел; 3 - ДЯК; 4 — ГМК-№; 5 квартазин.
100
60
20
4-
4-
только в случае ДЯК наблюдается ингибирование активности этого фермента (50 % ингибирование, прослеженное по изменению поглощения кислорода ЦХО, происходит при концентрации ДЯК 20 мМ). Остальные исследованные представители этого класса соединений при концентрации до 10~1 М не оказывали влияния на ферментативную активность ЦХО (см. таб-лицу).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об однонаправленности действия регуляторов роста растений — производных гидразина на ЦХО в условиях воздействия in vitro и in vivo. Следовательно, изучение влияния этих соединений на активность ЦХО в экспериментах, выполненных in vitro на препаратах изолированной ЦХО, позволяет прогнозировать их токсическое действие in vivo. На этом основании ЦХО можно рассматривать как экспериментальную модель для ускоренного прогноза токсических свойств производных гидразина.
Выводы. 1. Показано однонаправленное действие регуляторов роста растений — производных гидразина на мито-хондриальную цитохромоксидазу в условиях воздействия in vitro и in vivo.
2. Изолированная цитохромоксидаза рассматривается как экспериментальная модель для ускоренного прогноза токсических свойств производных гидразина.
Литература
1978.
1. Маркосян К. А., Налбандян Р. М. // Биохимия.— Т. 43, № 7.— С. 1143—1149.
2. Маркосян К. Л., Пайтян Н. А., Налбандян Р. М. // Там же.— 1988.— Т. 53, № 7.— С. 1136—1143.
3. Costa А. К., Ivanetich К. М. // Biochem. Pharmacol.— 1982.— Vol. 31.— P. 2093—2102.
4. Low И., Valliti J. // Biochim. biophys. Acta.— 1963.—
Vol. 69, N 2.— P. 361—374.
ф
5. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. // J. biol. Chem.— 1951.— Vol. 193, N 1.— P. 265—275.
6. Van Gelder В. F., Slater E. С. // Biochim. biophys. Acta.— 1962.— Vol. 58, N 3.— P. 593—595.
Поступила 16.02.89
M. Ю. AHTOMOHOB, 1990
УДК 613-07:519.24
М. Ю. Антомонов
АППРОКСИМАЦИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЬЮДЕНТА
Республиканский научный гигиенический центр Минздрава Украинской ССР, Киев
Значимость биоэффектов в практике медико-биологических исследований чаще всего оценивают по достоверности различий между опытными и контрольными (фоновыми) значениями показателей с помощью одного из наиболее мощных и популярных статистических критериев — критерия Стьюден-та. При этом в подавляющем большинстве случаев используют таблицы квантилей распределения и в зависимости от соотношения полученных и табличных значений делают заключение о достоверности эффекта с вероятностью ошибки, равной выбранному уровню значимости.
Наряду с простотой такого подхода очевидны и его недостатки: искусственная и ничем иным, кроме традиции, необъяснимая привязка к трем фиксированным уровням значимости (а=0,05, 0,01 и 0,001); альтернативность заключения «достоверно — недостоверно», отнесение к одному уровню значимости эффектов с достоверностями, которые хотя и лежат внутри одного интервала, но существенно различаются (например, если п—10, ¿1=2,3 и /2= 3,0, то оба эффекта будут отнесены к одному уровню значимости а<0,05, тогда как фактически вероятности ошибки различаются в несколько раз: «1 = 0,052, а2=0,013); заключение о принципиальном различии эффектов, достоверность которых хотя и близка, но лежит по различные стороны границы (при /2=10 и /1 = 2,22, /г=2,24 первый эффект будет считаться достоверным, второй — нет, хотя ошибки практически не различаются: о^ 2=0,05). В связи с указанным выше исследователи, имея в виду ограниченность традиционного подхода при описании эффектов, говорят о «тенденции», «явной тенденции» или достоверностях «выше третьего уровня значимости» и т. д.
Очевидно, что для повышения надежности выводов и заключений медико-биологических исследований и увеличения информативности результатов было бы полезным оценивать достоверность эффектов непосредственно по самой величине вероятности ошибки (а). Расчет значений по экспериментальным данным необходим еще и по той причине, что в последнее время значения критериев (например, критерия Стьюдента) и соответствующих им показателей достоверности Р (или а= 1—Р) используют в качестве выходной функции эксперимента, позволяющей сравнивать между собой разнообразные разноименные эффекты, формировать интегральные оценки и более просто осуществлять математическое моделирование зависимостей, связанных с реакциями биосистем (доза — вероятность эффекта) [2, 6].
Непосредственный расчет значений Р (/, п) по функциям распределения Стьюдента возможен только с помощью вычислительной техники. Существующие таблицы распределения Р (/, п) [3] малодоступны и сложны для практического использования. Поэтому наиболее приемлемым представляется применение упрощенных аппроксимационных функций, достаточно хорошо соответствующих исходной. Однако существующие подходы часто предусматривают последовательный расчет функции нормального распределения с последующей коррекцией, что также создает трудности для практического использования [1]. Достаточно простые функции предлагаются для расчета критических значений распределения при заданных значениях ошибок. Возможны разложение функции Р (/, п) в ряд и расчет по нему аппроксимации Р (/, я), однако и этот способ достаточно громоздок и реализуем только на средствах вычислительной техники [4]. Надежных аппроксимаций распределения Стьюдента, приемлемых для практической работы, в доступной нам литературе обнаружить не удалось. Поэтому нами была предпринята попытка разработать такую аппрокси-мационную функцию распределения Стьюдента, которая отвечала следующим требованиям: выполнение расчета значений вероятностей, а следовательно, и ошибок, с высокой точностью; наличие достаточно простого вида, позволяющего выполнить расчеты на простейших средствах вычислительной техники, доступных всем исследователям.
В качестве массива исходных данных нами была использована таблица распределения Стьюдента, табулированная для числа степеней свободы (п) от 1 до 20 и для значений критерия (/) от 0 до 5 с шагом 0,1—0,2 [3]. Табличные значения Ятабл преобразовывались по формуле
р_р .о_i
г г табл ^ 1
(П
для перехода к двустороннему критерию, более часто применяемому в практике медико-биологических исследований и при использовании значений распределения Стьюдента в интервале (0—1). Таким образом, исходный массив состоял из 20X49 значений вероятностей (Р) с точностью до.5-го знака после запятой. После графоаналитической обработки массива на ЭВМ СМ-1/1634 в качестве аппроксимационных вначале были выбраны следующие экспоненциальные функции изменения Р от I при фиксированных п\
«
%
/>„= l-exp [a(n)t+b(n)t2].
(2)
