CC BY
12УДК 611-018+611.013.7/8+611.24+618.31
ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МЕЗЕНХИМНЫХ ЗАКЛАДОК ТРАХЕИ И ЛЕГКИХ У ЭКТОПИЧЕСКИ ИМПЛАНТИРОВАННОГО ЗАРОДЫША
ЧЕЛОВЕКА
Е. Ю. Шаповалова, И. А. Демьяненко, Т. А. Бойко
Кафедра гистологии и эмбриологии
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: innademianenko@mail.ru
РЕЗЮМЕ
Исследование базируется на изучении 122 зародышей человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития при маточной имплантации и 49 зародышей, развивавшихся при трубной имплантации. Это дало возможность изучить зародыши человека на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода. Наличие рецепторов к лектинам определяли с помощью гистохимических реакций. Использован набор из девяти лектинов. При маточной и трубной имплантации обнаружен эффект постепенного изменения гликоконъюгатов-рецепторов лектинов на клеточных мембранах и внутриклеточно в процессе дифференцировки и органной специализации мезенхимных закладок трахеи и легких. При имплантации эмбрионов в матку наиболее заметные перестройки лектин-рецепторных системы в изученных органах дыхательной системы происходят во второй половине второго месяца пренатального онтогенеза. При имплантации в маточную трубу происходит дезинтеграция биосинтетических процессов, проявляющаяся изменением сроков перестройки лектин-рецепторных систем.
CYTOCHEMICAL SIGNS OF MESENCHIMAL GERM DIFFERENTIATION IN TRACHEA AND LUNGS OF ECTOPIC IMPLANTED HUMAN EMBRYO
I. A. Demyanenko, Ye. Yu. Shapovalova
SUMMARY
The investigation was carried out on 122 human embryos at the age of 21 days to 12 weeks of the intrauterine development at typical implantation and 49 embryos of ectopic tubal implantation. The effect of redistribution of glycoconjugates on the cytolemma and in the cytoplasm of cells in the process of their differentiation and specialization have been revealed. In intrauterine implanted embryos the most important redistribution of lectin binding sites occurs at the second half of the second month of gestation. In intratubal implanted embryos disintegration of biosynthetic process takes place and time of lectin binding sites redistribution is changed.
Ключевые слова: эмбриогенез человека, трубная беременность, дыхательная система, лектины.
Спектр углеводных детерминант гликополи-меров в клетках различен в процессе жизнедеятельности и дифференцировки. Такие молекулы могут отвечать за рецепторную, секреторную, адгезивную и миграционную функции клеток [2] как в постнатальном, так и в пренатальном периоде. По мере развертывания программы развития в пренатальном периоде, что фено-типически проявляется дифференцировкой клеток эмбриональных закладок, изменяется состав гликополимеров в тканях. Универсальным методом выявления таких биомолекул является лектин-рецепторная реакция, где гликополимеры выступают рецепторами лек-тинов [1]. Литературные данные по вопросам изменения гистотопографии рецепторов лек-тинов в развивающихся легких человеческих зародышей имплантированных в матку, особенно в псевдожелезистой стадии, немногочисленны и получены в основном в нашей лаборатории [3, 5, 9]. Сведения о гистотопографии
рецепторов лектинов в развивающихся легких человеческих зародышей имплантированных в маточную трубу нами не обнаружены.
Целью данного исследования является изучение динамики биосинтеза и перераспределения углеводных детерминант тканей - рецепторов лектинов - в мезенхимных закладках дыхательной системы у человека в пренаталь-ном онтогенезе при маточной и трубной имплантации при отсутствии явно выраженных повреждающих факторов внешней среды.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Результаты работы базируются на 122 зародышах человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития и 49 зародышей, развивавшихся при трубной беременности. Это дало возможность изучить зародыши человека на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода, что соответствует
уровням развития по Стритеру от Х до XXIII и началу плодного периода и стадиям, принятым сейчас в Институте Карнеги от 9 до 23. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для обработки гистологических препаратов использовали: лектин бузины черной (SNA), специфичный к концевым нереду-цирующим остаткам N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты гликополимеров; лектин арахиса (PNA), специфичный к ß-D-галактозе: лектин клещевины (RCA), специфичный к ß-D-галактозе, экранированной сиаловой кислотой; лектин чечевицы пищевой (LCA), специфичный к a-D-маннозе; лектин сои (SBA) и лектин виноградной улитки (HPA), специфичные к ^ацетил^-галактозамину; лектин клубней картофеля (STA), специфичный к N-ацетил -D-глюкозамину; лектин зародышей пшеницы (WGA), специфичный к N-ацетилнейраминовой кислоте и в меньшей степени - к N-ацетил^-глюкозамину и лектин бобовника анагиролист-ного (LABA), специфичный к a-L-фукозе. Препараты обрабатывали с применением стандартных наборов НПК «Лектинотест» г. Львов в разведении лектина 1:50 по рекомендуемой методике [1]. Визуализацию мест связывания лектина проводили в системе диаминобензидин - перекись водорода. Контроль специфичности реакции осуществляли путем исключения из схемы обработки препаратов диаминобензидина. Специфичность лектинов к терминальным нере-дуцирующим моносахаридным остаткам глико-конъюгатов дана в соответствии с данными [11]. Интенсивность окрашивания срезов различными лектинами оценивалась в баллах двумя исследователями независимо друг от друга. Баллы 0, 1, 2, 3, 4 - соответственно отсутствие, слабая, умеренная, сильная и очень сильная реакции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью набора лектинов c углеводной специфичностью ко всем возможным моносаха-
ридным остаткам, присутствующих в гликопо-лимерах человеческих тканей, нам удалось проследить последовательные этапы морфогенети-ческих преобразований мезенхимных закладок дыхательной системы. Обнаружен эффект постепенного изменения гликоконъюгатов на поверхности и в цитоплазме клеток в процессе их дифференциации и органной специализации, отражающих последовательность включения различных механизмов дифференцировки как при маточной, так и при трубной имплантации.
В клетках периэпителиальной мезенхимы, уплотняющейся вокруг эпителиальных закладок трахеи и бронхов, на ранних стадиях развития при типической имплантации содержится большое количество гликополимеров с концевыми нередуцирующими остатками N-ацетил-Б-глюкозамина и в меньшей степени - N-ацетилнейраминовой кислоты (рецепторы лектина зародышей пшеницы) (рис. 1). Затем, по мере уменьшения количества гликогена и усиления синтеза глико-полимеров, содержание этих биополимеров быстро истощается. Это соответствует данным [5, 13] и расходятся с исследованиями [8], выполненных на эмбрионах цыпленка.
При маточной беременности мезенхима и эмбриональная соединительная ткань (ЭСТ) дыхательной системы в начале развития имеет умеренное количество сиалированных глико-конъюгатов, обнаруживаемых SNA, в цитоплазме клеток. В середине изученного отрезка внутриутробного развития, когда ветвление бронхиального дерева ускоряется, биосинтез таких соединений усиливается и они накапливаются в цитоплазме клеток периэпителиаль-ной мезенхимы дистальных отделов ветвления. Дифференцировка клеток мезенхимы в молодые фибробласты, происходящая прежде всего в уже не ветвящихся проксимальных участках закладок, к 12-ти неделям развития заключается в потере SNA-положительного материала.
Рис. 1. Содержание рецепторов лектинов в цитоплазме клеток периэпителиальной мезенхимы и ЭСТ крупных бронхов в первые 12 недель эмбриогенеза при маточной имплантации.
В мезенхимных закладках дыхательной системы рецепторы лектина клубней картофеля впервые обнаруживаются у зародышей в возрасте 45 суток (16 мм длины) (рис. 1). Клетки мезенхимы интенсивно накапливают продукт лек-тин-рецепторного взаимодействия на цитолем-ме и в меньшей степени - в цитоплазме. Молодые фибробласты, дифференцируясь из клеток мезенхимы, теряют рецепторы этого лектина.
Из литературных источников известно, что по мере созревания эмбриональных тканей отмечается тенденция к уменьшению содержания гликоконъюгатов с концевыми нередуцирую-щими остатками b-D-галактозы (рецепторы лектина арахиса) и увеличению содержания сиалоконъюгатов [6, 12]. В основе этого феномена чаще всего лежит механизм маскирования концевых остатков b-D-галактозы сиало-вой кислотой [2]. Соотношение D-галактоза / сиаловая кислота на поверхности клеток может служить регулятором равновесной системы адгезия-миграция в составе ранних зародышей [7]. Компоненты мезенхимы и ЭСТ дыхательной системы у нормально имплантированных эмбрионов способность к связыванию лектина арахиса проявляют, начиная с возраста 46 суток (17 мм длины), когда в клеточных элементах мезенхимы трахеи и легких вне зависимости от их локализации появляется слабое диффузное прокрашивание бензидино-вой меткой. Конец второго месяца внутриутробной жизни (зародыши 17-57 мм длины) характеризуется прогрессивным медленным усилением синтеза рецепторов лектина арахиса и обогащение ими цитолеммы и в меньшем количестве - цитоплазмы клеток мезенхимы или молодых фибробластов . На третьем месяце эмбриогенеза продолжается дальнейшее усиление интенсивности бензидиновой метки на цитолемме и в цитоплазме клеток ЭСТ.
Первый месяц и первая половина второго месяца нормального развития (зародыши 3,2-18 мм длины) характеризуются усиленным биосинтезом рецепторов лектина клещевины и обогащение ими цитолеммы и в меньшей степени цитоплазмы клеток мезенхимы. Диф-ференцировка фибробластов ЭСТ из клеток мезенхимы, начавшаяся прежде всего в околоэпителиальных зонах, сопровождается значительной редукцией рецепторов RCA (рис. 1).
По литературным данным в повышении агрегационных характеристик клеток существенна роль гликоконъюгатов с концевыми остатками М-ацетил^-галактозамина (рецепторы лектина SBA). Наши исследования обнаруживают сходство в перераспределении рецепторов лектина RCA и рецепторов лек-
тина 8БА и НРА, причем динамика и характер перераспределения рецепторов лектина сои и виноградной улитки в мезенхимных закладках дыхательной системы полностью совпадают и не имеют существенных отличий.
В мезенхимных закладках дыхательной системы при типической имплантации биосинтез 8БЛ и НРЛ-позитивного материала начинается у зародышей в возрасте 42 суток (13 мм длины). Лектин тропен к цитолемме клеток. В течение 7-й и 8-й недели (зародыши 14-25 мм длины) рецепторы лектина накапливаются в цитоплазме и на цитолем-ме клеток. К концу 12-й недели (зародыши 70 мм длины) фибробласты ЭСТ свободны от М-ацетил-Б-галактозаминоконъюгатов.
Известно, что в эмбриональном периоде маннозосодержащие гликоконъюгаты (рецепторы лектина чечевицы) играют роль в специфическом узнавании клеткой ее мишеней и в повышении межклеточной адгезии [4].
В мезенхимных закладках дыхательной системы в норме а-Б-маннозоконъюгаты присутствуют в небольшом количестве в цитоплазме клеток мезенъхимы вокруг трахе-опульмонального зачатка, начиная с 24 суток пренатального онтогенеза (зародыши 3,2 мм длины), и существенно не изменяются до
45-47 суток развития (зародыши 16-18 мм длины). На 11-й и 12-й неделях (зародыши
46-70 мм длины) в молодых периэпителиаль-ных фибробластах степень связывания ЬСА цитолеммой изменяется в сторону увеличения, а цитоплазмой - в сторону уменьшения.
При типической имплантации в мезенхим-ных закладках дыхательной системы биосинтез а-Ь-фукозоконъюгатов присутствует у самых ранних изученных зародышей (24 суток, 3,2 мм длины) (рис. 1). Рецепторы лектина ЬАБА концентрируются в значительных количествах на цитолемме клеток. На последующих неделях развития (зародыши 5,5-27 мм длины) прослеживается усиленная экспрессия рецепторов лектина в цитоплазме и цитолем-ме клеток мезенхимы и молодых фибробластов ЭСТ. Этот процесс замедляется в течение третьего месяца пренатального онтогенеза.
При атипической имплантации прослеживается общее замедление развития эмбрионов. Размеры зародышей не соответствуют срокам беременности. Происходит дезинтеграция биосинтетических процессов, проявляющаяся изменением сроков перестройки лектин-рецепторных систем и уменьшением количества рецепторов лектинов зародышей пшеницы, бузины черной и клубней картофеля в типичных местах локализации (рис. 2).
Рис. 2. Содержание рецепторов лектинов в цитоплазме клеток периэпителиальной мезенхимы и ЭСТ крупных бронхов при трубной беременности.
При трубной беременности в мезенхимных закладках трахеи и легких рецепторы лектинов сои и виноградной улитки появляются на 8-й неделе развития на цитолемме и в цитоплазме клеток и не редуцируются до конца изученного периода эмбриогенеза. Биосинтез гликополиме-ров с концевыми нередуцирующими остатками р^-галактозы, экранированных сиаловой кислотой (рецепторы лектина клещевины), в мезенхимных закладках дыхательной системы существенно не меняется при тех же размерах эмбрионов, что и при типической имплантации. Галактозаминоконъюгаты, выявляемые лекти-ном арахиса, у самого старшего из изученных зародышей при трубной беременности в возрасте 60 суток (25 мм длиной) в мезенхимных закладках трахеи и легких отсутствуют, что свидетельствует о нарушении процессов адгезии и дезинтеграции равновесной системы адгезия-миграция. Биосинтез гликополимеров с концевыми нередуцирующими остатками а^-маннозы (рецепторы лектина чечевицы) в эпителиальных и мезенхимных закладках дыхательной системы существенно меняется в сторону уменьшения при тех же размерах эмбрионов, что и при типической имплантации. У самого старшего из изученных зародышей при трубной беременности в возрасте 60 суток (25 мм длиной) в эпителиальных закладках трахеи и легких рецепторы лектина чечевицы присутствуют в небольших количествах только на апикальной поверхности эпителия и в цитоплазме периэпителиальных мезенхимоцитов, что свидетельствует о нарушении процессов адгезии.
Биосинтез гликополимеров с концевыми нередуцирующими остатками а^-фукозы (рецепторы лектина бобовника анагиролист-ного) в мезенхимных закладках дыхательной системы при трубной беременности также существенно меняется. У ранних зародышей незначительное количество бензидиновой
метки присутствует в типичных местах локализации. У более старших изученных зародышей рецепторы лектина бобовника анаги-ролистного активно накапливаются до высоких показателей в цитоплазме и на цитолемме мезенхимоцитов и молодых фибробластов.
ВЫВОДЫ
1. При маточной и трубной имплантации обнаружен эффект постепенного изменения гликоконъюгатов на поверхности и в цитоплазме клеток в процесс их дифференциации и органной специализации.
2. При маточной имплантации эмбрионов наиболее заметные перестройки лек-тин-рецепторных системы во всех изученных органах происходят во второй половине второго месяца пренатального онтогенеза.
3. При трубной имплантации происходит дезинтеграция биосинтетических процессов, проявляющаяся изменением сроков перестройки лектин-рецепторных систем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Луцик А. Д., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. - Львов.: Вища школа, 1989. - 139 с.
2. Луцик А.Д., Ященко А.М., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Рецепторы лектинов в слюнных железах крыс в процессе постнатального развития //Архив анат. - 1986. - Т.91, №8. - С.27-35.
3. Шаповалова Е. Ю., Луцик А. Д. Изменение углеводного состава тканей в процессе раннего эмбрионального гистогенеза дыхательной системы у человека// Таврический медико-биологический вестник. - 2000. - № 1 - 2. - С. 175 - 178.
4. Brysk M.M., Rajaraman S., Penn P. Endogenous lectin from terminally differentiated epidermal cells // Differentiation. - 1986. - Vol.32, N3. - P.230-237.
5. Castells M., Ballesta J., Madrid M., Martinez-Menargues J. Characterization of glycoconjugates in developing rat respiratory system by means of conventional
and lectin histochemistry.// Histochemistry. - 1991. - V. 95. -P. 419 - 426.
6. Coapman R., Cooper H. Peanut lectin binding sites in human fetal colon //Arch. Pathol. Lab. Med. - 1986. - Vol.110, N2. - P. 124-127.
7. De Simone D.W., Spiegel M. Concanavalin A and wheat germ agglutinin binding to sea urchin embryo basal laminae //Rouxs Arch. Dev. Biol. - 1986. - Vol.195, N7. -P. 433-444.
8. Gallagher B.C. Basal laminar thinning is branching morphogenesis of the chick lung as demonstrated by lectin probes // J. Embryol. & Exp. Morphol. - 1986. - Vol.94. -P. 173-188.
9. Honda T., Schulte B. A., Spicer S. S. Comparison of glycoconjugates at the surface of developing type II pneumonocyte and Clara cells. // Histochem. J. - 1989. -V. 21. - P. 241 - 247.
10. Katsuyama T., Spicer S.S. The surface characteristics of the plasma membrane of the exocrine pancreas //Am. J. Anat. - 1977. - Vol.148, N4. - P.535-554.
11. Lectin biology, biochemistry, clinical biochemistry (eds. T.C. Bog-Hansen & G.A. Spengler) //Proc. V lectin meeting. - Berlin, 1983. - Vol.3. - P.87-415.
12. Momoi T., Momoi M.Y., Kurata T. Peanut agglutinin receptor is a marker of myelin in rat brain. Developmental changes in its distribution //J. Neurichem. - 1986. - Vol.46, N1. - P.229-234.
13. Sharma R., Schumacher U. Histochemical characterization of carbohydrate residues during the morphogenesis of gastrointestinal and respiratory system of Caretta Caretta //Acta Histochemica. - 1992. - Vol.93, N 2. - P.411-432.
