CC BY
10УДК 611-018+611.31
ИЗМЕНЕНИЕ СПЕКТРА УГЛЕВОДНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ И МЕЗЕНХИМНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПЕРВИЧНОЙ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ У ЧЕЛОВЕКА В ПРЕНАТАЛЬНЫХ ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССАХ
О.А. Каракулькина 1, Ю.Г. Барановский 2, Е.Ю. Шаповалова 3
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского», 295006, Россия, г. Симферополь, бул. Ленина 5/7.
Для корреспонденции: Шаповалова Елена Юрьевна, д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии и эмбриологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского», 295006, Россия, г. Симферополь, бул. Ленина 5/7.
E-mail Shapovalova_L@mail.ru
каракулькина О.А. http:// orcid.org. 0000-0002-0564-6914
2Барановский Ю.Г. http:// orcid.org. 0000-0002-7044-1122
3Шаповалова Е.Ю. http:// orcid.org. 0000-0003-2544-7696
РЕЗЮМЕ
Изучены нормальные эмбрионы человека, которые развивались в матке, в возрасте от 37 суток (9 мм т. - к. длины) до 60 суток (30 мм т. - к. длины). На протяжении этого периода исследовано развитие и дифференцировка эпителиальных и мезенхимных производных первичной ротовой полости и динамика изменения количества и гистотопографии рецепторов лектинов. Лектины были конъюгированы с пероксидазой хрена. В набор лектинов входили лектины арахиса, сои, зародышей пшеницы, бобовника анагиролистного и бузини черной. Гликоген и глико-протеины обнаруживали ШИК - реакцией с ферментативным контролем. Обнаружено перераспределение рецепторов лектинов, обусловливающее морфогенетические и формообразовательные процессы в ходе нормального индивидуального развития организма.
Ключевые слова: лектины, ранний гистогенез человека, ротовая полость.
CHANGESOF CARBOHYDRATE DETERMINANT SPECTRUM IN EPHITHELIAL AND MESENCHYMAL DERIVATIVES OF HUMAN PRIMARY ORAL CAVITY IN PRENATAL
FORMATION PROCESSES
O.A. Karakulkina, Yu.H. Baranovskiy, Ye.Yu.Shapovalova
Medical Academy named by S.I. Georgievskiy of FSAEE HE "CFU named by V.I. Vernadskiy", 295006, Russia, Simferopol, bul. Lenina, 5/7.
SUMMARY
Normal human embryos developed in an uterus at the age from 37 days (9 mm p.c. length) to 60 days (30 mm p.c. length) of emryogenesis have been studed. During this period of development and differentiation localization and change dynamic of lectins receptors in epithelial and mesenchymal derivatives of primary oral cavity have been observed. Lectins were marked by horse-radish peroxidase. The collection consists of lectins: peant, soy-bean, germ of wheat, pulse-anagiroleaf and tider. Glycogen and glycoproteins were revealed by PAS- reaction with enzymatic control. Found out the redistribution of lectin receptors, stipulating morphogenic and formaton processes during normal individual development of organism.
Key words: lectins, human early histogenesis, oral cavity.
Немногочисленные работы отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют, что специфическое взаимодействие эндогенных лектинов с гликоконъюгатами клеток или тканей охватывает все периоды онтогенеза, обеспечивая специфическое взаимодействие клеток [1]. В частности, гисто- и морфогенез зародыша протекает при участии лектин-рецепторных систем в регуляции агрегации и миграции клеток, а также в образовании структурных и функциональных контактов между отдельными группами клеток [2, 3, 4, 5]. При этом синтез и последовательность появления гликоконъюга-
тов на поверхности клетки генетически детерминированы [6, 7], так же как детерминированы синтез и последовательность включения в плазмолемму (или интернализации из нее) эндогенных лектинов.
Целью работы было проследить последовательность и характер изменения количества и гистотопографии рецепторов лектинов в процессе развития и дифференцировки эпителиальных и мезенхимных производных первичной ротовой полости у человека.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на нормальных зародышах человека, развивавшихся в матке, в возрасте от 37 суток (9 мм т. -к. длины) до 60 суток (30 мм т. -к. длины). Зародыши фиксировали 10%-ным нейтральным формалином и заливали в парафин. Из них готовили серейные срезы толщиной 8 мкм. Обзорные препараты окрашивали гематоксином и эозином. Гликоген и гликопротеины выявили ШИК-реакцией. Наличие в срезах гликопротеинов устанавливали по окраске, оставшейся после предварительного воздействия альфа-амилазы при температуре 380 в течение одного часа. Количественное определение ШИК - позитивных веществ в срезах проводили с помощью цитоспектрофотометра, собранного на базе ультрафиолетового микроскопа МУФ - 3М и спектрофотометра СФ - 4А. Накопление полисахаридов измеряли при длине волны 575 нм.
Препараты обрабатывали лектинами, меченными пероксидазой хрена [8]. В набор входили следующие лектины: арахиса, специфичный к р-Э-галактозе; сои, специфичный к N -ацетил- D -галактозамину; зародышей пшеницы, специфичный к ^ацетил^-глюкозамину и ^ацетилнейраминовой кислоте; бобовника анагиролистного, специфичный к L-фукозе; бузины черной, специфичный к N -ацетилнейраминовой кислоте и в меньшей степени к р-Э-галактозе и ^ацетил^-галактозамину [9]. Для контроля специфичности реакций из схемы обработки препаратов исключали диаминобензидин. Интенсивность окрашивания срезов различными лектинами оценивалась в баллах двумя исследователями независимо друг от друга. Баллы 0, 1, 2, 3, 4 -соответственно отсутствие, слабая, умеренная, сильная и очень сильная реакции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У зародышей в возрасте 37 суток (9 мм т. -к. длины) вся ротовая полость занята крупным языком. На серийных срезах можно различить боковые валики и непарный бугорок, из слияния которых образуется язык. Они отделены друг от друга нерезко выраженными бороздками. Язык состоит из недифференцированной мезенхимы, образующей мелкопетлистый синцитий. Ядра имеют круглую и овальную форму, богаты хроматином. С поверхности язык покрыт призматическим эпителием со светлыми овальными ядрами, расположенными в два или три ряда, и слабо оксифильной цитоплазмой. Базальная мембрана развита слабо. Нижняя челюсть ротовой полости покрыта также призматическим эпителием, морфологически сходным с эпителием языка, но несколько более низ-ким.В срезах эпителий крыши ротовой полости имеет явные отличия от остального эпителия
ротовой полости. Он однослойный кубический, местами приобретает двухслойное строение за счет появления плоских клеток с вытянутыми ядрами, лежащими параллельно базальной мембране. Мандибулярная дуга с максилляр-ными отростками, формирующая ротовую полость, состоит из недифференцированной мезенхимы, слегка уплотненной под эпителием нижней челюсти ротовой полости.
В возрасте 46 суток (зародыш 17 мм т. -к. длины) язык занимает всю ротовую полостью. Его дорсальная поверхность почти соприкасается с крышей ротовой полости. Покрывающий его эпителий морфологически не проявляет отличий по сравнению с описанным у предыдущих зародышей, так же как и эпителий, выстилающий верхнюю и нижнюю челюсти ротовой полости. Пространство под языком углубилось. В месте прикрепления языка к нижней челюсти эпителий утолщается до 4-5 рядов кубических клеток. Базальная мембрана видна на всем протяжении. Клетки на базальной мембране высокие. Их вытянутые и ориентированные перпер-дикулярно базальной мембране ядра интенсивно базофильны. Мезенхима составляет основу языка и будущей верхней и нижней челюсти. Наибольшее сгущение мезенхимных клеток выявлено в языке и в нижней челюсти.
У зародыша в возрасте 60 суток (30 мм т. -к. длины) язык, лежащий в ротовой полости, стал плоским и широким, одновременно увеличиваясь в длину. Из особенностей данного возраста можно отметить увеличение толщины эпителия, особенно в области закладки сосочков. Кроме базального слоя призматических клеток, здесь насчитывается до 3-4 слоев мелких многоугольных клеток со светлой, слабо базофильной цитоплазмой и круглыми, богатыми хроматином ядрами. На границе с подлежащей эмбриональной соединительной тканью хорошо контурируется базальная мембрана.
Дорсальная поверхность ротовой полости, образованная твердым небом, покрыта двухслойным эпителием с оксифильной цитоплазмой и круглыми светлыми ядрами. В этом возрасте присутствуют уже все крупные слюнные железы: околоушная, подчелюстная и подъязычная.
Базальная мембрана эпителия языка, нижней челюсти и утолщенного эпителия закладки зуба у ранних зародышей в возрасте 37 суток (9 мм т. -к. длины) содержит гликополимеры с концевыми нередуцирующими остатками N ацетил^-глюкозамина и сиаловой кислоты (лектин зародышей пшеницы), р^-галактозы (лектин арахиса), ^ацетил ^-галактозамина и сиаловой кислоты (лектин бузины черной) (таблица 1). Созревание базальной мембраны эпителия языка до возраста 60 суток (зародыши 30 мм т.к. длины) сопровождается утратой остатков р^-галактозы, которые, вероятно, маскируются ^ацетил^-галактозамином, превраща-
ясь при этом в рецепторы лектина сои (рис. 1). Сиаглогликаны существенно не изменяются. В базальной мембране эпителия нижней челюсти и языка появление гликополимеров с ^ацетил-D-галактозамином на концах олигосахаридных цепей отмечено в возрасте 46 суток (зародыш 17 мм т.к. длины), там же и по люминальной
поверхности эпителиоцитов накапливаются L-фукогликаны (рецепторы лектина бобовника анагиролистного). Остатки L-фукозы у зародышей в возрасте 60 суток (30 мм т.к. длины) редуцируются в базальной мембране эпителия языка, а сиалогликаны и рецепторы лектина сои сохраняются без изменений.
Таблица 1
Содержание рецепторов лектинов в эпителиальных и мезенхимных производных первич-
Название закладки Лектин сои Лектин бузи- Лектин заро- Лектин бо- Лектин ара-
ны черной дышей пше- бовника ана- хиса
ницы гиролистного
Размеры зародышей в мм (возраст 37, 46 и 60 суток)
9 17 30 9 17 30 9 17 30 9 17 30 9 17 30
Базальная мембрана 0 0 2 2 0 0 2 2 2 0 0 0 2 0 0
эпителия языка
Эпителиоциты базаль- 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1
ного слоя эпителия
языка
Эпителиоциты поверх- 2 3 3 2 2 1 0 0 2 1 3 3 0 2 1
ностного слоя эпителия
языка
Мезенхимные клетки 2 3 3 2 2 2 1 1 2 1 2 2 0 1 1
под базальной мембра-
ной эпителия языка
Мезенхимные клетки 2 1 1 3 2 0 2 2 2 0 2 2 2 0 0
более глубоких слоев
языка
Базальная мембрана 0 2 2 3 2 0 2 2 2 0 2 0 2 0 0
эпителия нижней челю-
сти
Эпителиоциты базаль- 2 1 2 0 0 1 0 0 1 1 1 2 0 1 1
ного слоя нижней челю-
сти
Эпителиоциты поверх- 2 3 3 1 3 2 0 0 1 1 2 3 0 2 2
ностного слоя эпителия
нижней челюсти
Мезенхимные клетки 2 2 3 2 2 3 1 2 2 1 3 3 0 1 0
под базальной мембра-
ной эпителия нижней
челюсти
Мезенхимные клетки 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 0 1 0
более глубоких слоев
нижней челюсти
Базальная мембрана 3 2 0 3 0 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0
крыши ротовой полости
Эпителиоциты крыши 2 2 1 1 3 1 1 1 0 1 3 4 0 1 0
ротовой полости
Мезенхимные клетки 2 3 3 2 2 1 1 1 2 1 3 4 0 0 0
под базальной мембра-
ной крыши рта
Мезенхимные клетки 2 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 2 0 0 1
глубоких слоев верхней
челюсти
*Интенсивность развившейся реакции оценивали в баллах: 0 - отсутствие реакции, 1 балл -очень слабая реакция, 2 балла - слабая реакция, 3 балла - умеренная реакция, 4 балла - сильная реакция.
Известно, что наименее дифференцирован- бране. В цитолемме и цитоплазме таких клеток ные клетки в эпителии лежат на базальной мем- содержится, по данным ряда исследователей,
наименьшее количество рецепторов лектинов. Например, дифференциация клеток внутри эпителиального пласта сопровождается повышением содержания в них гликоконъюгатов с конце-
выми остатками D-маннозы, ^ацетил^-галактозамина, L-фукозы (появлением рецепторов конканавалина А, лектинов сои, утесника соответственно) [10, 11, 12, 13].
Ж*. ' V-
Й
-
Рисунок 1. Плодный период. Зародыш в возрасте 10 недель (45 мм длины). Срез нижней челюсти. Обработка конъюгатом лектина сои с пероксидазой хрена. Проявление в системе диаминобен-зидин - Н2О2. Увеличение: ок. 10, об. 40. (Объяснение в тексте).
Нами обнаружена сходная картина и при дифференцировке эпителия, покрывающего язык, нижнюю челюсть и дорсальную поверхность ротовой полости. Так, у зародышей в возрасте 38 суток (9 мм т.к. длины) эпителиоциты языка и нижней челюсти на своей поверхности имеют гликополимеры с нередуцирующими остатками ^ацетилнейраминовой кислоты, р-D-галактозы, ^ацетил^-галактозамина (рецепторы лектина бузины черной) и L-фукозы (рецепторы лектина бобовника анагиролистно-го), а внутрицитоплазматически - ^ацетил-Э-галактозамина (рецепторы лектина сои). У зародышей в возрасте 46 суток (17 мм т.к. длины) и 60 суток (30 мм т.к. длины) в базальном слое выявляются эпителиоциты с диаметрально противоположным распределением гликоконъюга-тов на поверхности при полном морфологическом сходстве. Клетки же поверхностного слоя богаты гликополимерами с концевыми нереду-цирующими остатками ^ацетил-Э-
глюкозамина, ^ацетилнейраминовой кислоты и L-фукозы.
В месте перехода нижней поверхности языка в нижнюю челюсть данная закономерность не обнаружена. Все эпителиоциты синтезируют значительное количество цитоплазматических гликополимеров с концевыми остатками N ацетил^-галактозамина и L-фукозы и содержат мало гликополимеров с нередуцирующими остатками р ^-галактозы, ^ацетилнейраминовой кислоты и ^ацетил^-глюкозамина на цито-лемме. В изученный период эмбриогенеза ме-
зенхимные клетки языка, нижней и верхней челюстей, будущей стромы подъязычной железы не меняют состав рецепторов лектинов. В цитоплазме клеток, лежащих вблизи базальной мембраны соответствующего эпителия, выявлены гликоконъюгаты, реагирующие со всеми изученными лектинами. Их количество с возрастом увеличивается. В клетках более рыхло лежащей, удаленной от эпителия мезенхимы углево-дсодержащие полимеры сосредоточены в небольшом количестве в цитолемме. Здесь же много ареактивных по отношению к лектинам клеток. Рост зародыша не оказывает на них существенного влияния.
Гликоген и гликопротеины, обнаруженные с помощью ШИК-реакции, накапливаются в эпителиальных производных ротовой полости в значительно большем количестве, чем в клетках мезенхимы. Их становится больше параллельно с ростом зародыша. Уплотненая мезенхима под базальной мембраной эпителия более интенсивно накапливает гликополимеры по сравнению с остальными мезенхимными клетками. Однако цитотопография этих соединений одинакова во всех клетках закладки и не дает информации о деталях углеводного обмена.
ВЫВОДЫ
Проведенное нами гистохимическое маркирование клеток эпителиальных и мезенхимных производных первичной ротовой полости обнаружило генетически детерминированное в про-
цессе дифференцировки перераспределение рецепторов лектинов, являющихся биологически активными соединениями, обусловливающими морфогенетические и формообразовательные процессы в ходе нормального индивидуального развития организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kaltner H., Seyrek K., Heck A. Galectin-1 and galectin-3 in fetal development of bovine respiratory and digestive tracts. Comparison of cell type-specific expression profiles and subcellular localization // Cell Tissue Res. 2002. Vol. 307, N 1. P. 35-46.
2. Faury G., Ruszova Е., Molinari J. The alpha-L-Rhamnose recognizing lectin site of human dermal fibroblasts as a signal transducer: modulation of Ca2+ fluxes and gene expression // Biochim Bio-phys Acta. 2008. Vol. 1780, N 12. P. 1388-1394.
3. Liu F.T., Patterson R.J., Wang J.L. Intracellular functions of galectins // Biochem Biophys Acta. 2002. Vol. 1572, N 2-3. P. 263-273.
4. Майструк Н.И., Шаповалова Е. Ю. Влияние эктопической имплантации зародышей человека на особенности межклеточной адгезии клеток эпителиальных и мезенхимных закладок поджелудочной железы // Морфолопя. 2009. Т. 3, № 3. С. 70-74.
5. Волошин Н. А., Григорьева Е. А. Лектины животного и растительного происхождения: роль в процессах морфогенеза // Теоретична медицина. Журн. АМН Украши. 2005. Т. 11, № 2. С. 223-237.
6. Ponder B.A.Y. Lectin histochemistry // Immu-nocytochemistry. Practical applications in pathology and biology (eds. J.M. Polak, S. van Noorden ).-Bristol., 1983. - Р. 129-142.
7. Readler A., Readler E. Jhe use of lectins to study normal differentiation and malignant transformation. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 1985. - vol. 109. - N3. - Р. 254 - 251.
8. Луцик А. Д., Детюк Е. С., Луцик М. Д. Лектины в гистохимии. Львiв: Вища школа, 1989. 139 с.
9. Антонюк В. O. Лектини та ix сировинш дже-рела. Львiв: ПП „Кварт", 2005. с. 412.
10. Бойко Т.А., Жарков С.В., Шаповалова Е. Ю. Маннозоконьюгаты в нормальном эмбриогенезе первичной и окончательной почки // Вшник морфологи. 2007. Т. 13, № 2. С. 319-323. 11.Чайковський Ю. Б., Копшка I. В. Порiвняль-ний лектиногiстоxiмiчний аналiз ендометрш в норм^ при гiперплазiяx та аденокарциномах // Вшник проблем бюлоги i медицини. 2006а. Вип. 2. С. 334-338.
12. Жумыкина О. И., Притуло О. А., Шаповалова Е. Ю. Применение лектиновой гистохимии для определения локализации гликополимеров кожи в разных стадиях псориаза // Таврический медико-биологический вестник. 2007. Т. 10, № 4. С. 19-23.
13. Wengel S., Samtleben R., Schul J. Lektine als Hilfsmittel zur histologischen Darstellung von Glykokonjugaten in oralen Epithelien // Zahn. - , Mund - und Kieferheilk. 1986. Bd. 74, N 6. S. 576-583.
