Цитогенетичні та біотехнологічні методи оцінки репродуктивного потенціалу кнурів Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 636.4.082.4:575.22

Остаповець Л.1., к.б.н., ([email protected]) © Стародуб Л.Ф., к.с.-г.н. ([email protected]) 1нститутрозведення i генетики тварин, с. Чубинсъке, Бористлъсъкийрайон, Кигвська обл.

ЦИТОГЕНЕТИЧН1 ТА БЮТЕХНОЛОГ1ЧН1МЕТОДИ ОЦ1НКИ РЕПРОДУКТИВНОГО ПОТЕНЦ1АЛУ КНУР1В

У cmammi представленi дат щодо дослгдження заплгднювалъно! 3damnocmi сперматозоШв кнургв великог бшог породи на основi моделювання процесу взаемодп гамет в умовах in vitro та цитогенетичног ощнки хромосомного noлiмopфiзмy соматичних клтин midHUKie

Ключое1 слова: ооцит, сперматозогд, in vitro, samidnenm, ембрюн, Kapiomun, хромосомт аберацп, велика быа порода свиней

Вступ. 1нтенсиф1кащя галуз1 тваринництва значно залежить вщ правильно! системи формування стада, штенсивносп використання маточного погол1в я та плщниюв. Контроль i ощнка вщтворювальних якостей кнур1в загальноприйнятими методами за якктю потомства не дае повних даних про морфофункщональний стан оргашзму, стутнь впливу нестабшьност1 карютипу на вщтворювальну здатшсть плщниюв, формування величини багатоплщност1 у спарованих ними свиноматок, виходу поросят. Загальноприйнят1 методи ощнки ускладнюються ще й тим, що ряд успадкованих хромосомних аномалш фенотипово проявляються лише у дорослих нащадюв, одержаних вщ тварин ¿з генетичними дефектами [2]. Тому для повно! характеристики репродуктивного потенщалу плщника доцщьно проводите генетико-бютехнолопчний мошторинг, складовою частиною якого е анал1з карютипу тварини та перев1рка заплщнювально! здатност1 сперматозовдв за допомогою методу заплщнення яйцекл1тин in vitro.

Проведения попереджувально! д1агностики генетичного потенщалу кнур1в комерцшних порщ i3 застосуванням цитогенетичних метод1в дае можливкть ощнити мутабшьшсть фактор1в зовшшнього середовища, визначити ступ1нь впливу хромосомних аномалш на продуктивш та репродуктивш властивост1 тварин, ix життездатшсть, в1рогщшсть генетичного ризику на основ! облжу частота i спектру хромосомних мутацш у соматичних кл1тинах. Поеднання генетично! оцшки карютипу плщниюв ¿з методом отримання ембрюшв in vitro у систем! репродукцп сшьськогосподарських тварин пщвищуе ефектившсть вщбору плщниюв за заплщнювальною здатшстю сперматозовдв. Згщно з «1нструкщею i3 штучного оЫменшня свиней» заплщнювальну здатшсть сперми кнура слщ перев1ряти не менше шж за п'ятьма еякулятами i оаменшням двадцяти свиноматок [7], що пов'язано з великими витратами кошт1в i часу. Моделювання процеав взаемоди жшочих та чолов1чих гамет в умовах in vitro дозволяе швидко, об'ективно, з меншими

© Остаповець Л.1., Стародуб Л.Ф., 2012

133

витратами оцшити заплщнювальну здатшсть сперматозовдв плщниюв пор1вняно з застосуванням штучного оЫменшня [1, 8]. Так, в одному дослда можна ос!менити до 100 дозрших in vitro ооцит1в сперматозощами вщ одного кнура та через 3-6 дшв мати результати заплщнювально! здатност1 сперматозовдв.

Метою нашо! роботи була оцшка вщтворювальних якостей кнур1в велико1 бшо! породи використовуючи цитогенетичш та бютехнолопчш методи.

Матер1ал i методи. Об'ектом дослщжень були три кнури вшом 2 роки велико1 бшо! породи, яю утримувались у типових умовах СВАТ «Агрокомбшат «Калита» Ки!всько! обл.

Методика одержання цитогенетичних препарат1в ¿з л1мфоцит1в перифершно! кров1 передбачала таку послщовшсть етатв: взяття кров1, !! транспортування, пщготовку стерильних флакошв ¿з живильним середовищем, приготування препараив, забарвлення, анал1з метафазних пластинок, фотографування [6]. У процес1 дослщжень визначали вщсоток метафазних пластинок ¿з юльюсними порушеннями (анеупловдя), кл1тини ¿з асинхроншстю розщеплення центром1рних райошв хромосом (АРЦРХ) та структурними порушеннями - розривами хромосом. У кожно! тварини анал1зували 100 метафазних пластинок.

Мжроядерне тестування проводили на цих самих препаратах, пщраховуючи двоядерш л1мфоцити (ДЯ), одноядерш л1мфоцити з мкроядрами (МЯ), м1тотичний ¿ндекс (MI).

Ооцит-кумулюсш комплекси одержували ¿з яечниюв забитих свиней велико! бшо! породи. Ооцити дозр1вали in vitro в середовищ1 ТС 199 з додаванням 20% еструсно! сироватки кров1 Kopie i 3-5х106 кл1тин гранульози/мл (кл1тини гранульози одержували ¿з фол1кул1в д1аметром 3-4 мм без атретичних змш та з морфолопчно нормальним ооцитом). Культивували ооцит-кумулюсш комплекси свиней протягом 45 годин при +38,8°С i 4% С02 у noBnpi. Для заплщнення in vitro використовували еякульоваш сперматозо!ди кнур1в велико! бшо! породи Рухлив1 сперматозо!ди вщбирали методом спливання (swim-up) в середовищ1 TALP без юшв кальцш [9]. Спшьну шкубацш дозрших in vitro ооцит1в та вадбраних методом swim-up сперматозо!д1в проводили протягом 20 годин у модифжованому середовищ1 Т1роде (TALP) з додаванням 10 цг/мл гепарину, 20 цМ пенщиламшу, 10 цМ гшотаурину та 1 цМ етнефрину. Вадмии вщ сперматозо!д1в передбачуваш зиготи культивували in vitro в середовищ1 NCSU-23. Цитогенетичш препарати ооцит1в та ядер ембрюшв готували за модифжованим нами методом A.K. Тарковського [10]. Препарати фарбували з використанням 2%-го розчину барвника Пмза i анал1зували !х пщ cвiтлoвим MiKpocKonoM при збшьшенш ок.10х, об.100.

Вивчення продуктивное^ кнура за вщтворювальною здатшстю зaплiднeниx свиноматок, показники спермопродуктивност1 проводили за матер1алами 300TexHi4H0r0 oблiкy.

Статистичну обробку отриманих даних здiйcнювaли стандартними методами [5] ¿з використанням компьютерно! програми «Microsoft Excel».

Результати дослщження. Кшьюсть i яюсть приплоду значною м1рою залежить вщ племшних якостей кнур1в-плщниюв, яю використовуються для

134

парування або одержання сперми для штучного оаменшня. Тому кнур повинен бути клмчно здоровим, енергшним у статевому вщношенш, мати заводську вгодовашсть, одержувати повноцшний рацюн i користуватися активним моцюном.

За результатами перев1рки заплщнювально1 здатност1 сперматозовдв кнур 1в Раял Турк 801, Наполеон 835, Денш 845 в умовах in vitro встановлена вщсутшсть BiporiflHOÏ р1знищ м1ж заплщнювальною здатшстю гамет кнур1в теля оаменшня дозрших in vitro ооцит1в i даними штучного оаменшня свиноматок (табл.. 1). Зарезультатами морфолопчного анал1зу встановлено, що р1вень формування ембрюшв свиней i3 використанням для оЫменшня дозрших in vitro ооцит1в еякульованих гамет кнура Наполеон 835 був найвищим i становив 66,7% (рис. 1).

Таблиця 1

Кличка, № кнура Штучне оаменшня Заплвднення in vitro

оаменено свиноматок, гол1в опоросилось спарованих свиноматок, гол1в (%) оаменено ооципв, n шльшсть ембрюшв, n (%)

Раял Турк 801 11 6а*( (54,5) 62 32a(51,6)

Наполеон 835 70 51b(72,8) 60 40b(66,7)

Денш 845 128 74c(57,8) 58 34c(58,6)

показники пор1внюються в межах одного рядка

Рис. 1. Сформован! in vitro ембршни свиней на р1зних стад1ях розвитку, об.

10х, ок.10х

Репродуктивний потенщал кнур1в визначаеться кшькютю отриманого вщ них приплоду, який залежить вщ якост1 отримано! сперми та заплщнювально! здатност1 сперматозовдв (табл. 2).

Незважаючи на високу стабшьшсть карютипу, змши хромосомного апарату у свиней вщбуваються у частиш кл1тин, практично у кожно! тварини, внаслщок мутацшного впливу, а також природного та штучного добору. Цитогенетичний контроль у племшнш робот1 дае можливкть ощнити мутабшьшсть фактор1в зовшшнього середовища, визначити асоцшований зв'язок хромосомних аномалш ¿з продуктивними i репродуктивними властивостями тварин, ix життездатшстю.

135

Таблиця 2

Оцшка кнур1в за Тх вщтворною здатшстю та продуктившстю

Показники Одинщ Раял Турк Наполеон Денш

вишру 801 835 845

Вж м1с 24 24 24

Об'ем еякуляту мл 384,2±37,86 189, 0±8,63 225,±4,78

Концентращя сперматозощв млрд/мл 0,20±0,01 0,27±0,01 0,26±0,01

Рухлишсть сперматозощв бали 8 8 8

Заплщнювашсть % 54,5 72,8 57,8

Багатоплщшсть гол. 12,6±1,02 11,1±0,31 11,0±0,18

Потомство без паталогш % 93,6 91,2 91,9

Середня маса гшзда при кг 182,5±10,08 188,9±5,46 192,0±3,86

вщлученш в 2 м1сящ

У карютиш кнур1в, яких дослщжували, виявлено спектр спонтанних хромосомних мутацш геномного \ структурного типу (табл. 3) Геномш порушення хромосом виражеш у вигляд1 анеуплощних кл1тин, частота яких становила 25-27 %, перевищуючи показники дано! м1нливост1, одержан! шшими вченими [4] ¿з статистично нев1рогщною р1зницею середшх величин (рис. 2). Кл1тини ¿з асинхронним розходженням центром1рних райошв хромосом ¿з частотою 5,2-30 %, яю вщображають передумови виникнення числових порушень, вказують на шдивщуальш вщмшност1 кнур1в.

Таблиця 3

Хромосомний пол1морф1зм кнур1в, %,__

Плвдник Анеуплощя АРЦРХ Розриви хромосом МЯ ДЯ М1

Денш 845 27 9 - 1 2 7

Наполеон 835 25 30 6 2 5 6

Раял Турк 801 26 5,2 - 2 1 10

Рис. 2. Анеупло1доя 2п=41, об. 10х, ок.10х

Розриви хромосом ¿з частотою 0,0 = 6,0 % свщчать про порушення !х структури, проте не перевищують р1вня, характерного для свиней дано! породи. Для бшьш повно1 оцшки соматичного мутагенезу, який проявився у кнур1в, використовували мжроядерний тест. Результати дослщжень показали, що

136

середш значения мжроядерного тесту у дослщжених плщниюв не перевищували спонтанний р1вень, який вщповщае 10% [3], тобто тварини не зазнавали прямого токсичного екзогенного впливу.

Для встановлення асоцшованого зв'язку м1ж нестабшьшстю карютипу та вщтворною здатшстю I продуктившстю кнур1в провели кореляцшний анал1з (табл. 4).

Таблиця 4

Кореляцшний зв'язок м1ж нестабшьшстю карштипу та продуктившстю 1

вщтворною здатшстю кнур1в

Корелююч1 ознаки Хромосомн1 порушення

Анеуплощя АРЦРХ Розриви хромосом

Об'ем еякуляту 0,6424 -0,7400 -0,6425

Концентращя сперматозощв -0,1321 0,7165 0,6100

Заплщнювальна здатшеть -0,7690 0,9996 0,9556

Багатоплщшсть -0,0558 -0,5733 -0,5475

Потомство без паталогш 0,2836 -0,8156 -0,7251

Середня маса гшзда у 2 м1сящ 0,3100 0,3341 0,1966

Отримаш результати показали значш вщ'емш кореляцшш зв'язки м1ж асинхронним розходженням центром1рних райошв хромосом та розривами хромосом i об'емом еякуляту, багатоплщшстю та народжуванням потомства i3 патолопею. Проте зв'язки м1ж ознаками, яю вивчаються, статистично недостов1рш. Це означав, що i3 пщвищенням частоти кл1тин ¿з АРЦРХ, розривами хромосом спостеркаеться у плщниюв тенденцш до зменшення об'ему еякуляту, зниження багатоплщност1 та пщвищення народження потомства ¿з патолопею.

Анал1зуючи показники вщтворно! здатност1 та продуктивное^ з хромосомною мшливютю у кнура Наполеона 835, встановили, що для нього характерний найвищий р1вень заплщнювально! здатност1 (72,8%) та частота кл1тин ¿з АРЦРХ (30 %) пор1вняно з шшими тваринами, яких дослщжували. Структурш порушення у вигляд1 розрив1в хромосом були теж характерш лише для ще! тварини. За результатами продуктивное^ кнура за вщтворювальною здатшстю заплщнених свиноматок встановили, що найбшьша кшьюсть нежиттездатних поросят була одержана саме вщ кнура Наполеона 835. Це дае змогу припускати, що пщвищений р1вень кл1тин ¿з АРЦРХ та наявшеть хромосомних розрив1в може бути причиною появи потомства 3i зниженою життездатшетю.

Висновки. Отже, впровадження у практику тваринництва комплексного пщходу, який грунтуеться на проведенш попереджувально! цитогенетично! д1агностики плщниюв комерцшних порщ та перев1рки заплщнювально! здатност! сперматозовдв за допомогою методу заплщнення яйцекл1тин in vitro, дасть можливкть у короткий термш провести об'ективну оцшку репродуктивного потенщалу тварин.

137

Л1тература

1. Буркат В. П. Биотехнологические методы оценки и прогнозирования оплодотворяющей способности сперматозоидов быков / В. П. Буркат, В. Е. Кузнецов, И. Б. Елизарова // Вкник аграрно! науки. - 1992. - № 11. - С. 22-26.

2. Гусев Д. И. Оценка воспроизводительных качеств свиней в зависимости от уровня кариотипической изменчивости : автореф. дис. на соискание степени канд. биол. наук : спец. 06.02.01 - разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных / Д. И. Гусев. -М., 2009. - 21 с.

3. Ильинских Н. Н. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет / Ильинских Н. Н. , Ильинских И. Н., Бочаров Б. Ф. - Новосибирск : Наука, 1984. - 256 с.

4. Кобидзе И. Г. Цитогенетическое обследование племенных хрячков пород крупная белая и ландрас / И. Г. Кобидзе // Вопросы производства свиней. Бюллетень научных работ ВИЖа. - 1989. - Вып. 93. - С. 56-58.

5. Меркурьева Е. К. Генетика с основами биометрии / Е. К. Меркурьева, Г. Н. Шангин-Березовский. - М. : Колос. - 1983. - 400 с.

6. Шельов А. В. Методика приготування метафазних хромосом л1мфоцит1в перифершно! кров1 тварин / А. В. Шельов, В. .В. Дзщюк // Методики наукових дослщжень ¿з селекци, генетики та бютехнологи у тваринництвг - К., Аграрна наука. - 2005. - С. 210-213.

7. 1нструкщя ¿з штучного оЫменшня свиней / вщп. за вип. Ю. Ф. Мельник. - К. : Аграрна наука, 2003. - 56 с.

8. Ковтун С. I. Одержання зародив свиней in vitro: стан та перспективи використання / С. I. Ковтун // Вкник аграрно! науки. - 2004. - № 5. - С. 52-54.

9. Katska L. Instrukcja wdrozeniowa nr 2/93. Produkcja zarodkow bydlecych metodami in vitro / L. Katska, Z. Smorag, B. Rynska. - Krakow, 1993. - 18 s.

10. Tarkowski A. K. An air-drying method for chromosome preparation from mouse eggs / A. K. Tarkowski // Cytogenetics. - 1966. - Vol. 5, № 3. - P. 394400.

Summary Ostapovetz L.I., Starodub L.F.

CYTOGENETIC AND BIOTECHNOLOGICAL METHODS OF BOAR ASSESSMENT REPRODUCTIVE POTENTIAL

Data fertilization ability Large White boar sperm at the base of gamete interaction process modeling under in vitro conditions and cytogenetic assessment of chromosomal polymorphism of sire somatic cells are represented in the article

Рецензент - д.с.-г..н., професор Швторак Я.1.

138