CC BY
2УДК 636.1.575::576.3:619.612.017
А.В. Ткачёв
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС жЕРЕБЦОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ДОПУСТИМЫХ УРОВНЕЙ МИКОТОКСИНОВ КОРМА
Институт животноводства Национальной академии аграрных наук Украины, Украина, 61026, г. Харьков, ул. 7-й Гвардейской Армии, 3
Введение
Известно, что в последние годы агрессивность окружающей среды возросла. На этом фоне регистрируется увеличение онкологических и аллергических заболеваний, снижение репродуктивной функции как у людей, так и у животных [1-4]. Многие исследователи сходятся во мнении, что в основе этих процессов лежат изменения генетического аппарата под влиянием мутагенных и канцерогенных свойств всевозможных химических веществ и соединений как искусственного, так и естественного происхождения. Накапливаясь в организме животного на протяжении всей его жизни, они могут увеличивать количество хромосомных, генных или геномных мутаций, что может способствовать развитию различных заболеваний и снижению репродуктивной функции [5]. В животноводстве особое внимание уделяется репродуктивной функции, особенно в коневодстве, так как лошадь является одно-плодным животным с большим интервалом между поколениями. В отрасли коневодства Украины выход жеребят на начало 2014 года составлял всего 48%. Естественно, что первоочередной научно-практической задачей является увеличение выхода жеребят. Для решения данной задачи необходимо сначала изучить влияние факторов, которые могут влиять на генетический аппарат. В Украине проводились отдельные цитогенетические исследования лошадей в связи с репродуктивной функцией, но при этом не изучалось влияние микотоксинов на цитогенетический статус [6].
Из природных веществ мутагенными и канцерогенными свойствами обладают микоток-сины, которыми сильно поражены корма для лошадей в Украине и во всем мире [7-8]. Из литературных данных известна способность микотоксинов накапливаться в организме и индуцировать развитие субклинических, хрони-
ческих заболеваний. У лошадей изучены лишь острые микотоксикозы, а хронические остаются практически неизученными как в Украине, так и в мире [9]. Если мутагенные свойства высоких доз микотоксинов не вызывают сомнений, то как будут влиять допустимые концентрации микотоксинов корма на хромосомный аппарат лошадей в Украине, практически неизвестно. Поэтому, определенное значение приобретают исследования влияния максимально допустимых уровней микотоксинов корма на цитогенетический статус лошадей в целом и жеребцов-производителей в частности. Жеребцы-производители оказывают большое влияние на ту или иную популяцию, так как одним жеребцом за случной сезон покрывают в среднем около сорока кобыл и более. Это может способствовать как снижению выхода жеребят от ненаследуемых хромосомных аномалий, которые могут накапливаться на протяжении жизни производителя, так и распространению сбалансированных наследуемых цитогенетических дефектов, особенно если сперму жеребца используют в системе искусственного осеменения.
Ввиду того, что данная проблема требует особого внимания, целью нашей работы является установление влияния максимально допустимых концентраций микотоксинов корма на цитогенетический статус жеребцов-производителей заводских пород Украины.
Материалы и методы
Исследование выполняли в Украине на 7 жеребцах-производителях украинской верховой породы Харьковского конного завода, 6 жеребцах-производителях тракененской породы и 3 жеребцах-производителях арабской породы Чутовского конного завода «Тракен» Полтавской области, на 5 жеребцах-производителях вестфальской породы Петрековского конного
завода Днепропетровской области. Контаминацию кормов микотоксинами определяли на базе лаборатории микотоксикологии Института животноводства Национальной академии аграрных наук Украины (ИЖ НААН) до и после поступления кормов с микотоксинами. До начала опыта жеребцы получали качественные нетоксичные корма без микотоксинов на протяжении 4-6 месяцев, что подтверждалось проведением ежемесячного комплексного исследования грубых и концентрированных кормов, в том числе и проведением токсикологических исследований. Затем в хозяйства были завезены партии концентрированных кормов с максимально допустимыми концентрациями мико-токсинов (до 0,1 мг/кг Т-2 токсина, 0,08-1,0 мг/ кг зеараленона, до 1,0 мг/кг дезоксиниваленола, 0,04 мг/кг афлатоксина), концентрация которых подтверждалась ежемесячными исследованиями. Так как выявленные уровни микотоксинов являются допустимыми для кормления животных в Украине, то владельцы лошадей приняли решение задавать такие корма в тех же количествах, что и свободные от микотоксинов корма. Корма с допустимыми концентрациями микотоксинов задавались лошадям ежедневно на протяжении 8 месяцев. Цитогенетические исследования жеребцов выполняли до и после получения корма с максимально допустимыми уровнями микотоксинов на базе лаборатории генетики ИЖ НААН с помощью анализа метафаз-ных пластинок лимфоцитов крови [10]. Кровь
жеребцов для цитогенетических исследований отбирали до и после получения кормов с микотоксинами один раз в неделю общепринятыми методами из яремной вены с соблюдением правил асептики и антисептики в стерильные пробирки с гепарином. В стерильных условиях лаборатории проводили постановку культуры лимфоцитов с добавлением среды Игла или среды 199, инактивированной сыворотки теленка, фитогемагглютинина и антибиотиков при 37 °С на протяжении 48-72 часов, после чего приготавливались препараты метафазных пластинок лимфоцитов крови; в каждой пробе крови анализировали не менее 50 метафазных пластинок [10]. На рисунке представлен физиологический кариотип и патологические участки метафазных пластинок.
Статистическую обработку результатов проводили как общепринятыми методиками [11], так и с применением специализированной программы SPSS.
Результаты и обсуждение
Наши предыдущие исследования доказали негативное влияние максимально допустимых уровней микотоксинов корма на биотехнологическую пригодность спермы жеребцов, результативность случки и искусственного осеменения, гематологические и биохимические показатели организма жеребцов и кобыл, а также на показатели специфической и неспецифической резистентности лошадей.
Рисунок. Физиологический кариотип (слева) и патологические участки метафазных пластинок после
получения корма с микотоксинами (справа)
Логическим продолженим вышеуказанных исследований является изучение влияния максимально допустимых уровней микотоксинов корма на те цитогенетические показатели, которые имели достоверное влияние на биотехнологическую при-
годность спермы жеребцов в ранее проведенных нами работах. В таблице представлены данные по цитогенетическим показателям производителей под влиянием допустимых концентраций зеараленона, Т-2 токсина, дезоксиниваленола и афлатоксина.
Цитогенетический статус жеребцов обследованных пород до и после получения корма с допустимым уровнем микотоксинов (M±m; п = 35)
Показатель Порода жеребцов
Украинская верховая Тракененская Арабская Вестфальская
До получения корма с допустимым уровнем микотоксинов
Общее количество обследованных метафаз 1918 2015 1834 1914
Среднее количество метафаз на 1 пробу 54,8±0,77 54,5±0,82 52,4±0,75 55,0±0,85
Количество метафаз с аберрациями 3,1±0,34 2,6±0,11 2,5±0,17 2,6±0,10
Относительное количество метафаз с аберрациями, % 5,8±0,63 4,7±0,21 4,8±0,35 4,7±0,19
Всего аберраций 3,2±0,33 2,6±0,11 3,6±0,27 3,8±0,17
Аберраций на 100 клеток 5,9±0,62 4,7±0,21 6,9±0,57 7,0±0,32
Единичные фрагменты 2,2±0,18 1,8±0,11 2,8±0,20 2,7±0,14
Единичные фрагменты, % 76,4±3,65 71,4±3,91 79,8±6,04 73,0±3,91
Парные фрагменты 0,9±0,21 0,7±0,10 0,6±0,21 0,8±0,12
Парные фрагменты,% 21,6±4,62 26,4±4,11 15,7±5,80 18,8±3,19
Кольцевые хромосомы 0,14±0,16 0,1±0,18 0,2±0,30 0,4±0,16
Кольцевые хромосомы, % 2,4±2,74 3,3±5,87 4,5±6,76 8,2±3,75
Пробелы 0,0 0,1±0,18 0,2±0,30 0,2±0,19
Пробелы, % 0,0 3,3±5,87 5,8±8,81 3,2±3,74
После получения корма с допустимым уровнем микотоксинов
Общее количество обследованных метафаз 1920 2012 1831 1917
Среднее количество метафаз на 1 пробу 54,8±0,77 54,5±0,82 52,4±0,75 55,0±0,85
Количество метафаз с аберрациями 4,5±0,41* 3,4±0,12*** 3,2±0,13** 3,2±0,09***
Относительное количество метафаз с аберрациями, % 8,2±0,77* 6,3±0,22*** 6,2±0,31** 5,9±0,17***
Всего аберраций 4,2±0,35* 3,2±0,13*** 5,7±0,26*** 6,12±0,27***
Аберраций на 100 клеток 7,7±0,66 5,9±0,25*** 10,9±0,50*** 11,2±0,50***
Единичные фрагменты 1,5±0,13** 0,7±0,11*** 2,1±0,18* 1,7±0,13***
Единичные фрагменты, % 43,9±3,95*** 22,2±3,49*** 37,1±3,02*** 27,6±1,60***
Парные фрагменты 1,1±0,09 1,0±0,06** 1,5±0,17** 1,9±0,13***
Парные фрагменты, % 28,9±2,83 33,9±2,07 26,1±2,47 31,1±2,11**
Кольцевые хромосомы 0,8±0,21* 0,9±0,07*** 1,1±0,10* 1,6±0,15***
Кольцевые хромосомы, % 14,2±3,08** 30,6±2,54*** 19,3±1,22 26,6±2,16***
Пробелы 0,7±0,23 0,6±0,15* 1,0±0,16* 1,0±0,16**
Пробелы, % 13,0±4,04 18,1±4,25 17,6±2,41 15,3±2,29*
* -р < 0,05; ** -р < 0,01; *** -р < 0,001
Из данных таблицы видно, что до получения корма с максимально допустимым уровнем зеараленона, Т-2 токсина, дезоксинивалено-ла и афлатоксина процент метафаз с аберрациями у жеребцов тракененской, арабской и вестфальской пород в среднем находился примерно на одном уровне и не превышал 5%, процент метафаз с аберрациями у жеребцов украинской верховой породы в среднем был выше 5% на 0,76%. Общее количество аберраций в среднем было наибольшим у производителей вестфальской породы, что на 16,7% больше украинской верховой породы, на 33,1% больше (р < 0,001) тракененской породы и на 6,3% больше жеребцов арабской породы. В перерасчете на сто клеток в среднем наименьшее количество аберраций было установлено у тракененской породы, что на 24,2% меньше (р < 0,001) украинской верховой породы, на 47% меньше (р < 0,001) арабской породы и на 48,5% меньше (р < 0,001) вестфальской породы. Среди исследуемых пород на долю единичных фрагментов в среднем приходилось более 70%. Относительное количество парных фрагментов в среднем не превышало 27%, а кольцевых хромосом - не более 9%. Относительное количество пробелов в среднем колебалось от нуля у украинской верховой породы до 5,8% у арабской породы.
После получения корма с максимально допустимым уровнем микотоксинов процент метафаз с аберрациями у исследуемых производителей в среднем увеличился у украинской верховой породы на 2,4% (р < 0,05), тракененской породы - на 1,6% (р < 0,001), арабской породы -на 1,4% (р < 0,01), вестфальской породы - на 1,2% (р < 0,001). Общее количество аберраций у жеребцов вестфальской породы в среднем увеличилось на 37,7% (р < 0,001), у арабской породы - на 36,8% (р < 0,001), у тракененской породы - на 18,8% (р < 0,001), у украинской верховой - на 23,8%. Наблюдалось перераспределение спектра аберраций хромосом. Относительное количество единичных фрагментов у исследуемого поголовья уменьшилось в среднем у украинской верховой породы на 32,5% (р < 0,001), у тракененской породы - на 49,2% (р < 0,001), у арабской породы - на 42,7% (р < 0,001), у вестфальской породы - на 45,4% (р < 0,001). Хотя были жеребцы у которых преобладало увеличение количества единичных фрагментов. Следователь-
но, можно предположить, что под длительным действием максимально допустимых уровней микотоксинов корма хромосомные изменения могут иметь индивидуальный характер. У исследуемых жеребцов увеличилось абсолютное и относительное количество парных и кольцевых фрагментов, а также пробелов. Относительное количество парных фрагментов у исследуемого поголовья увеличилось в среднем у украинской верховой породы на 7,3%, у тракененской породы - на 7,5%, у арабской породы - на 10,4%, у вестфальской породы - на 12,3% (р < 0,01). Относительное количество кольцевых хромосом у исследуемых пород увеличилось в среднем у украинской верховой породы на 11,8% (р < 0,01), у тракененской породы - на 27,3% (р < 0,001), у арабской породы - на 14,8%, у вестфальской породы - на 18,4% (р < 0,001). Увеличился в среднем процент пробелов у украинской верховой породы на 13,0% (р < 0,01), у тракененской породы - на 14,8%, у арабской породы -на 11,8%, у вестфальской породы - на 12,1% (р < 0,05).
Корелляционно-дисперсионный анализ показал, что степень влияния породы и индивидуального фактора на процент метафаз с аберрациями среди исследуемого поголовья после хронического микотоксикоза составляет соответственно 10,8% (р < 0,01) и 89,4% (р < 0,001), что подтверждает ранее высказанное нами предположение о роли индивидуального фактора в характере хромосомных изменений.
Мутагенный эффект допустимых уровней микотоксинов корма при кормлении лошадей начинал регистрироваться в зависимости от индивидуальной чувствительности у большинства (57%) обследованных жеребцов через 8-9 недель, а у остальных особей - в интервале от 2 до 7 месяцев непрерывного кормления.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при кормлении лошадей исследуемых пород кормом с максимально допустимыми уровнями микотоксинов мутагенный эффект начинает наблюдаться в интервале от 8-9 недель до 7 месяцев.
Заключение
Впервые в Украине проведены исследования влияния максимально допустимых уровней зеараленона, Т-2 токсина, дезоксинивалено-ла и афлатоксина корма на цитогенетические
показатели жеребцов-производителей украинской верховой, тракененской, арабской и вестфальской пород. После кормления жеребцов кормом с максимально допустимыми уровнями микотоксинов у исследуемого поголовья наблюдалось достоверное увеличение относительного количества метафаз с аберрациями в среднем у украинской верховой породы на 2,4% (р < 0,05), тракененской породы - на 1,6% (р < 0,001), арабской породы -на 1,4% (р < 0,01), вестфальской породы - на 1,2% (р < 0,001). При этом общее количество аберраций у жеребцов вестфальской породы в среднем увеличилось на 37,7% (р < 0,001), у арабской породы - на 36,8% (р < 0,001), у тракененской породы - на 18,8% (р < 0,001), у украинской верховой - на 23,8%. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о необходимости ограничения сроков кормления жеребцов-производителей исследуемых пород кормом с максимально допустимыми уровнями микотоксинов в связи с их мутагенным эффектом.
Список использованных источников
1. Коваленко, М.А. Способы прогнозирования канцерогенных свойств факторов окружающей среды / М.А. Коваленко // Охрана окружающей среды, 2005. - № 4. - С. 30-32.
2. Патогенетические эффекты нестабильности эмбрионального генома в развитии человека / И.Н. Лебедев [и др.] // Вестник ВОГиС, 2006. - Т. 10. - № 6. - С. 520-529.
3. Dean, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer / W. Dean, F. Santos, W. Reik // Seminars in Cell and Developmental Biol, 2003. -Vol. 14. - P. 93-100.
4. Метод ДНК-комет в выявлении геномной нестабильности. Мониторинг состояния генома у работников ОАО «МАЗ» / Н.В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск: Право и экономика, 2008. - С. 108-114.
5. Микотоксины и микотоксикозы / под. ред. Д. Диаза. - Москва: Печатный город, 2006. - 384 с.
6. Шельов, А.В. Цитогенетичш дослщження в твариннищв / А.В. Шельов // Материали юбилейной науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 180-летию со дня рожд. Л.С. Ценковского, г. Одесса, 28 марга-1 апреля 2003 г. - Одесса, 2003. - С. 192.
7. Брезвин, О. Контроль м^отоксишв у кормах i 1х знешкодження / О. Брезвин,
B. Отчич, I. Коцюмбас // Вюник Львiвського ушверситету. - Львiв, 2013. - Випуск 62. -
C. 242 - 249.
8. Цвшховський, В.1. Стан i безпека кор-мiв та кормово! сировини за показниками забрудненосп мшотоксинами в тваринницьких господарствах Украши / В.1. Цвшховський, О.А. Лапоша, А.В. Белоцька // Бюлопя тва-рин. - Львiв, 2010. - Т. 12. - № 1. - С. 145-150.
9. Dose-response effects of estrogenic myco-toxins (zearalenone, alpha- and beta-zearalenol) on motility, hyperactivation and the acrosome reaction of stallion sperm / A. Filannino [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology, 2011. - Vol. 9. - Р. 134-140.
10. Исследование хромосом сельскохозяйственных животных: методические рекомендации / под. ред. А.Ф. Яковлева. - Ленинград. -1976. - 65 с.
11. Плохинский, Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников / Н.А. Плохинский. -М.: Колос, 1969. - 256 с.
Дата поступления статьи 23 марта 2015 г.
