CC BY
49
Гарипова Р.Ф.1, Калиев А.Ж.2
1ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»
2ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В МОНИТОРИНГЕ ПОЧВ ПРИ ТЕХНОГЕННОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ МИКРОЭЛЕМЕНТАМИ
Цитогенетический анализ выявил мутагенную опасность сточных вод газоперерабатывающей промышленности как факторов микроэлементного загрязнения почв. Проведен модельный эксперимент, целью которого являлось определение роли N1 и его антагонистов - Си и 2п - в формировании мутагенного фона. В эксперименте учтены предмутационные события, происходящие в растительных клетках.
Ключевые слова: мутагены, микроэлементы, химические загрязнители, металлы, предму-тационные события, время гидролиза.
Введение. В течение 30 лет сточные воды Оренбургского газохимического комплекса (ОГХК) утилизируются на земледельческих полях орошения (ЗПО). В результате многолетнего орошения в почвах ЗПО и в кормах, получаемых с полей орошения, содержание солей N1, 2п, Си и ряда других микроэлементов выше допустимых концентраций. Нами [5] установлена зависимость валового содержания Си, 2п, N1, РЬ, Мп, Мо в кормах от их концентрации в почве, она выражается коэффициентом корреляции - 0,83. Распределение микроэлементов в почвах и растениях при орошении сточными водами ОГХК показано в таблице 1. В отличие от остальных элементов Си и Сг не задерживаются в почвах, а локализуются в растениях. С каждым годом наблюдается динамичное возрастание концентрации металлов в растениях [3]. Таким образом, возникает растительная популяция, толерантная к техногенному воздействию, способная стать опасным звеном трофической связи. Изучение роли отдельных загрязняющих компонентов в формировании реакций растений на токсикацию представляет интерес при разработке систем очистки сточных вод предприятия и технологий рекультивации земель.
Избыток солей металлов в окружающем растворе оказывает повреждающее действие на клеточные структуры. Некоторые агенты способствуют деформации мембраны, ее фрагментации. Неорганические соли металлов оказывают влияние на деления в клетке и ядерный аппарат. Способность ингибировать митоз и вызывать хромосомные аномалии возрастает вместе с увеличением молекулярной массы элементов. Существует также значимая корреляция между дозой солей металлов и цитотокси-ческим действием. Индуцированные в растени-
ях и животных хромосомные аномалии включают в себя изменения в структуре хромосом: фрагментации, инверсии, транслокации; дефекты веретена: разрывы, полиплоидию, К-мито-зы и др. Длительное воздействие солей металлов ведет к резкому изменению клеточной активности, хромосомным аберрациям и снижению митотического индекса [10]. Многие про-фазные клетки могут возвращаться в интерфазное состояние. У них наблюдается наличие разрушенных или раздробленных ядер. Некоторые клетки полностью теряют ядра в результате полной дезинтеграции ядерного материала. Встречаются двуядерные клетки, из-за задержки клеточного цикла, в котором ДНК хромосом реплицирована, но не распределяется обычным образом. Встречаются трех-, четырехполярные клетки из-за нарушения синтеза элементов веретена деления. Разнообразие и степень аномалий в клетках зависят от физико-химических свойств загрязнителя - потенциального мутагена [8].
Целью нашего эксперимента было выявление мутаций и предмутационных эффектов, вызываемых воздействием микроэлементов в отдельности и комплексе. К предмутационным эффектам мы отнесли ингибирование процессов деления и усиление белкового синтеза на основании представлений о стимулирующем и ингибирующем действии химических мутагенов [7]. Выбор солей N1, Си и 7п для модельного эксперимента был основан на том, что они представлены в сточных водах в предельно допустимых концентрациях для вод, предназначенных для орошения, и в почвах наблюдается неблагоприятное для растений соотношение этих элементов: ш1п Си/№=0,19; тах Си/№=0,45. Существуют мнения, что повреждающее дей-
ствие никеля на растения не проявляется, если соотношение Cu/Ni в почвах равно или более 1. Кроме того, учитывалось то, что Zn выступает как критический кофактор на рост клеток, особенно в фазах репродукции и дифференциров-ки. Известна его роль в нуклеиновом обмене, процессах транскрипции, стабилизации нуклеиновых кислот, белков и, особенно, компонентов биологических мембран [1]. Все три компонента являются генетически активными по отношению к штаммам ТА 1535, ТА 1537, ТА 98, ТА 102 в тесте Эймса по данным Wong [14]. Cu и Zn являются антагонистами Ni и ингибируют абсорбцию этого элемента на 25-42%, а в высоких дозах Zn ингибирует передвижение Cu [13].
Методика. Повреждения митотических хромосом и нарушения митоза исследовали в соответствии с методиками, предложенными Пауше-вой [6]. В качестве объекта использовали лук Allium сера. Корешки лука проращивали в исследуемом растворе до 9-10 мм при комнатной температуре, фиксировали уксусным алкоголем на холоде. Мацерацию проводили 10%-ным раствором соляной кислоты. Для окраски корни помещали в ацетокармин, окрашивание проводили с кипячением в водяной бане в течение 10 мин; затем приготавливали давленые препараты, определяли митотическую активность (МГ), анализировали хромосомные аберрации. Помимо вышеуказанных показателей дополнительно учитывали время, необходимое для мацерации (гидролиза) (HT); число ядрышек в ядре клеток [4]. Пробы отбирались в трех точках: №1 - сточные воды из емкости сезонного регулирования (ЕСР); №2 - сточные воды, поступающие в ЕСР; №3 - сточные воды придонного уровня. В качестве контроля использована дистиллированная вода.
Модельный эксперимент на определение цитогенетических эффектов компонентов сточной воды включал варианты растворов (в мг/л):
1. Медь углекислая - 5*; 0,5; 0,05; 0,005**
2. Никель углекислый - 7*; 0,7; 0,07; 0,007**
3. Двухлористый цинк - 10*;1,0; 0,10; 0,010**
4. Комбинация солей:
- медь углекислая - 5*; 0,5; 0,05; 0,005**
- никель углекислый - 7*; 0,7; 0,07; 0,007**
- двухлористый цинк - 10*;1,0; 0,10; 0,010**
* концентрации металлов в почве
**концентрации металлов в сточной воде
ОГХК.
Таблица 1. Распределение микроэлементов в почвах и растениях при орошении сточными водами ОГХК (по Гариповой, 1998)
Элемент Ba Pb (Me)* Sr Cu (Mn) (N) CO (Ni) Sn Mo Zn (Mn) (Ni) Mn Ni (Mn)
Локализация; впочве* + + + + + + + +
враскниях* + + + + + + - + + +
( )* антагонисты элемента
Таблица 2. Влияние сточных вод ОГХК на цитогенетические показатели в клетках корневой меристемы лука
Митотический индекс, %0 Митотический индекс к контролю, % Число клеток с нарушениями на 1000 клеток
№ точки отбора пробы сточные воды контроль полиплоидных с отставаниями хромосом с фрагментами хромосом
1. 2. 3. 132,7±3,8 192,3±4,2 139,5±6,9 34,5±2,2 97,9±5,6 28,6±4,7 384,4 196,0 487,7 0 2,28±0,06 1,32±0,04 0 4,55±0,02 2,63±0,02 0 0 0
5 ,0 о" II а
Таблица 3. Изменение митотического индекса в зависимости от концентрации микроэлементов в сточных водах
Показатели Образцы сточной воды
1 2 3
Содержание
микроэлементов, мг/л 0,742 1,055 0,647
Сухой остаток, мг/л Сумма микроэлементов 1884 1410 1500
от сухого остатка, % 0,039 0,075 0,043
М1 к контролю, % 196,0 69,1 117,6
М1 в контроле, %о 97,9±5,6 52,8±4,2 78,6±4,6
а = 0,05
Статистическая обработка результатов включала определение средней арифметической и ее стандартной ошибки по трем независимым повторностям. Сравнение средних значений в контроле и вариантах опыта проводили, используя t-критерий Стьюдента с использованием приложения Microsoft Excel. В таблицах указывается среднее значение показателя с доверительным интервалом при уровне значимости 0,05.
Результаты исследований и обсуждение. По результатам тестирования сточные воды ОГХК у растений не вызывали фрагментации хромосом, индуцировали отставания хромосом, а также значительные изменения показателя митогенно-сти (MI) относительно контроля (табл. 2).
Таблица 4. Изменение цитогенетических показателей под влиянием сточных вод ОГХК и солей никеля, меди, цинка
Вариант* Время необходимое для мацерации Митотический индекс, %о Число клеток с ядрышками более двух на 1000 клеток
Контроль 3' 17 ”± О'Об" 111,5±8,8 2,2±0,4
Пробы с точки № 2 4'05"±0'07" 68,4±5,2 25,1±3,0
Пробы с точки № 3 3'12"±0'04" 58,1±6,8 21,80±4,2
Медь углекислая, 5 мг/л* 2'36"±0'06" 78,2±6,3 18,45±2,9
Медь углекислая, 0,5 мг/л 3' 11 ”± 0'08" 98,6±7,2 3,0±1,2
Медь углекислая, 0,05 мг/л 3' 15 ”± 0'07" 117,6±8,1 2,8±0,9
Медь углекислая, 0,005 мг/л 3' 12”± 0'08" 120,3±7,9 1,8±3,0
Цинк двухлористый, 10 мг/л* 3,42"±0,05" 89,1±4,9 30,99±3,2
Цинк двухлористый, 1,0 мг/л 3'26"± 0'07" 102,5±8,2 5,2±2,4
Цинк двухлористый, 0,10 мг/л 3’27"± 0’08" 121,5±4,0 1,6±2,0
Цинк двухлористый, 0,010 мг/л 3'19"± О'Об" 109,4±7,8 1,2±0,4
Никель углекислый, 7 мг/л * 10'47"±0'03" 52,4±6,7 28,57±3,4
Никель углекислый, 0,7 мг/л З'31 ”± 0'08" 121,5±7,3 3,2±0,8
Никель углекислый, 0,07 мг/л 3’16"± 0’07" 108,4±8,0 2,0±0,5
Никель углекислый, 0,007 мг/л 3'18"±0'09" 126,7±6,9 0,9±0,4
Медь углекислая (5 мг/л) + никель углекислый (7 мг/л)+ цинк двухлористый (10 мг/л)* 2,23"±0,06" 38,4±6,2 42,2±4,1
Медь углекислая (0,5 мг/л) + никель углекислый (0,7 мг/л)+ цинк двухлористый (1,0 мг/л) 3'07"± 0'09" 97,3±8,8 5,2±2,3
Медь углекислая (0,05 мг/л) + никель углекислый (0,07 мг/л)+ цинк двухлористый(0,10 мг/л) 3'09”± 0'08" 116,5±7,4 3,2±0,7
Медь углекислая (0,005 мг/л) + никель углекислый (0,007 мг/л)+ цинк двухлористый (0,010 мг/л) 3'11"±0'07" 127,5±9,1 2,8±0,6
а = 0,05
* - Статистически достоверные отличия относительно Нами замечено, что показатель митогенно-сти в различных пробах варьирует в зависимости от общего содержания микроэлементов в сухом остатке (табл. 3). Так, при содержании микроэлементов в концентрации 1 мг/л подавляется митотическая активность ткани на 30,9%, а при концентрации 0,6-0,7 мг/л - стимулируется на 17-96%. Последнее подтверждает значимость суммы минимальных концентраций микроэлементов в формировании биологической активности сточных вод.
В результате модельного эксперимента на корешках лука не выявлены хромосомные и геномные нарушения по исследованным компонентам сточных вод в дозах: медь углекислая - 5 мг/л; никель углекислый - 7 мг/л; цинк двухлористый - 10 мг/л (табл. 4).
В меньших концентрациях не наблюдали статистически достоверных различий относительно контроля, выявляли тенденции к стимулированию или ингибированию митотической активности.
Во всех вариантах наблюдали снижение показателей митотического индекса и увеличе-
контроля
ние числа ядрышек. Корешки, полученные на фоне повышенной концентрации Си, легче подвергались мацерации, а следовательно, корне-образование протекало в условиях измененного режима формирования клеточной оболочки и межклеточного пространства. Это, безусловно, отражается на транспортной функции мембран и функциональности корневой системы. Можно предположить нарушение избирательности поглощения окружающего раствора клеточными мембранами и усиление всасывающей способности корня на фоне токсичных концентраций Си.
Корешки, полученные в условиях воздействия N1, вызывали значительное - более чем в 3 раза относительно контроля - увеличение времени, необходимого для мацерации. Этот свидетельствует о формировании утолщенной клеточной оболочки, уплотнении межклеточного пространства и блокировании всасывающей способности корня. Огрубление тканей корня, повышение их ломкости наблюдали и при изготовлении препаратов.
Корешки, полученные при воздействии 2п, незначительно увеличивали показатель НТ.
В присутствии Cu эффекты уплотнения тканей, вызываемые никелем и цинком, исключались. При этом относительно контроля увеличилось число клеток с ядрышками более двух в 19 раз и сопровождалось подавлением показателя митотической активности ткани - в 2,9 раза. Таким образом, можно предполагать, что разряжение ткани способствовало проникновению Ni и Zn в активную зону корешка, где наблюдались максимальное угнетение митотического деления и мобилизация синтетических процессов. Усиление метаболизма в индуцированных токсикантами тканях мы связываем с синтезом стрессовых белков, мобилизацией метал-лотионеинов.
В пользу сказанного, по исследованиям Nishizoho Hiromi с соавт. [12], изучавших распределение Cu и Zn в растениях двух загрязненных местностей и незагрязненной, более 90% тяжелых металлов в корнях было локализовано во фракции клеточных стенок, величина объемной емкости клеточных стенок для Cu была выше, чем для Zn. Таким образом, ионы Cu обладали более высоким сродством к клеточной стенке, чем ионы Zn.
В исследованиях Kennedy C.D. и Gonsalves F.A. [11] введение микроэлектродов в клетки
эпидермиса корня определило, что Си и 7п являются деполяризаторами транскорневого потенциала и ингибируют Н+-отток, при этом максимальная скорость ингибирования Н+-от-тока у меди выше, чем у 7п.
Таким образом, ни один из компонентов модельного эксперимента, взятых в токсичных дозах, не индуцировал генетические нарушения на корешках лука. Но в отдельности, и особенно при совместном влиянии на ткань корневой системы, соли N1, Си и 7п ингибировали митотическое деление, усиливали белковый синтез в клетках. Исходя из эмпирического и теоретического источников, можно предположить, что усиленное поглощение Си из субстрата корневой системой и локализация ее в растениях объясняется повышенной биогенной активностью элемента. N1 и 7п накапливаются в почвах по причине меньшей проникающей способности в сравнении с солями меди. С этим связано неблагоприятное соотношение Си/№ и накопление 2п в исследуемых почвах. Концентрация меди способна нарушить барьерный потенциал корневой системы и способствовать кумуляции прочих токсикантов в тканях и, следовательно, являться проводником и индуктором предмутационных процессов в растительных тканях.
Список использованной литературы:
1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С., 1991. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология. - М.: Медицина, 496 с.
2. Гарипова Р.Ф.,1998. Токсикогенетическая оценка сточных вод газоперерабатывающей промышленности: Автореф. канд. дис. Оренбург, изд-во ОГУ, 20 с.
3. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж., 2004. Динамика микроэлементного состава почв и растений, подверженных воздействию сбросных вод газоперерабатывающей промышленности. // Вестник ОГУ. 2004. №10. С. 110-112.
4. Гарипова Р.Ф., 2008. // Патент на изобретение RU №2322669 от 02.07.2007. Способ комплексного биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ в фитотестах. Бюл. №11. от 20.04. 2008. 6 с.
5. Калиев А.Ж.,1995. Экологическая оценка влияния газоперерабатывающего комплекса на окружающую среду: Автореф. докт. дис. Курск, 29 с.
6. Паушева З.П., 1988. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос, 120 с.
7. Раппопорт И.А.,1984. Действие генетически активных веществ на фенотип и чистота генетического состояния //Химический мутагенез в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений. - М.: Наука, С. 85-97.
8. Физиология растительных организмов и роль металлов, 1989. /Под ред. Н.М. Чернавской. - М.: Изд-во МГУ, 156 с.
9. Ченцов Ю.С., 1984. Общая цитология. - М.: МГУ, 352 с.
10. Heck J.D., Costa M., 1982. // Biol. Trace Element Res. Vol. 4. №3. P. 319-330.
11. Kennedy C.D., Gonsalves F.A.N., 1987. The action of divalent zinc, cadmium, mercury, copper and lead on the trans-root potential and H+ efflux of excised roots //J.Exp.Bot. Vol. 38. №190. P. 800-817.
12. Nishizono H., Kubota K., Suzuki S., Jshii T,. 1989. Accumulation of heavy metals in cell walls of Polygonum cuspidatum roots from metalliferous habitats //Plant and cell Physiol. Vol. 30, №4. P. 595-598.
13. Ruano A. Barcelo J., Poschenrieder Ch., 1987. Zinc toxicityinduced variation of mineral element composition in hudroponically growh buch bean plants //J.Plant Nutz. Vol. 10, №4. P. 373-384.
14. Wong P.K., 1988. Mutagenicity of heavy metals //Bull. Environ. Contam. And Toxicol. Vol. 40, №4. P. 597-603.
