CC BY-ND
31
Ш №11 (248)
39
g ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ МУТАГЕННОГО ЭФФЕКТА ПРИ АЭРОГЕННОМ Щ ВОЗДЕЙСТВИИ СОЕДИНЕНИЙ МАРГАНЦА, НИКЕЛЯ И ХРОМА НА НАСЕЛЕНИЕ
М.А. Землянова, С.Г. Щербина
2 CYTOGENETIC INDICATION OF MUTAGENIC EFFECTS IN AEROGENIC EXPOSURE
3 TO COMPOUNDS OF MANGANESE, CHROME AND NICKEL ON POPULATION
M.A. Zemlianova, S.G. Sherbina ^^ ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», г. Пермь
S
Установлено, что загрязнение атмосферного воздуха селитебной застройки марганцем, никелем, хромом на уровне 1,2—2,2 ПДКс.с. формирует у детей повышенные относительно референтного уровня концентрации металлов в крови (до 5,0—13,0 раз). Доказано, что развивающийся при этом мутагенный эффект имеет зависимость от уровня концентрации металлов в крови и выражается в повышенной частоте клеток с цитогенетическими аномалиями на фоне усиления пролиферативной активности, окислительных реакций на уровне ДНК клетки, снижения активности процесса апоптоза.
Ключевые слова: марганец, никель, хром, аэрогенное воздействие, мутагенный эффект, цитогенетические нарушения, микроядерный тест.
Found that air pollution is a residential development of manganese, nickel, chromium at 1,2-2,2 of the permissible level children generates relatively higher reference level, the metal concentrations in the blood (up 5,0-13,0 times). Proved that develops with mutagenic effect has a dependency on the concentration of metals in the blood, and is expressed in cells with elevated frequency cytogenetic anomalies gain against proliferative activity, oxidative reactions of cells at the DNA level, reducing the activity of apoptosis.
Keywords: manganese, nickel, chromium, aerogenic exposure, mutagenic effects, cytogenetic abnormalities, the micronucleus test.
Хром, марганец и никель входят в перечень химических веществ, обладающих мутагенной активностью (токсикологические профили Агентства США по регистрации токсичных веществ и заболеваний (ATSDR), 2005, 2008). Эти вещества входят в список загрязняющих атмосферный воздух соединений, рассматриваемых в «Рекомендациях ВОЗ по качеству воздуха в Европе» — 2000 (Европейский центр по охране окружающей среды и здоровья в сотрУдничестве с Международной программой по химической безопасности и Европейской комиссией (ЕС)). Стабильно присутствуют в атмосферном воздухе (в виде пыли и аэрозолей), почве (в ионообменной и непрочно адсорбированной формах), подземных водах и водах открытых водоемов (в виде взвешенных и коллоидных частиц).
Основными источниками поступления данных металлов в атмосферный воздух являются выбросы предприятий металлургического, машиностроительного и топливно-энергетического комплексов, вклад которых в объем промышленного производства России в 2009 г. составил порядка 18—23 %.
Известно, что мутагенный эффект воздействия марганца, никеля и хрома реализуется на клеточном и субклеточном уровне в виде индукции свободно-радикального процесса, подавляющего стабильность синтеза и активирующего оксидативное повреждение ДНК клетки. В результате происходят разрывы ДНК, изменение химических свойств РНК и нуклеопротеидов, активация апоптоза и, как следствие, увеличение уровня модифицированного ну-клеозида — 8-гидрокси-2-деоксигуанозин, являющегося продуктом повреждения ДНК. Мутагенные свойства данных металлов значительно актуализируются в связи с их способностью накапливаться в организме, вмешиваться в метаболические циклы, вступать в химические реакции, выступать в качестве канцерогенов и коканцерогенов [1].
Вышеизложенное обусловливает актуальность исследования цитогенетических изменений у населения, проживающего в условиях загрязнения атмосферного воздуха хромом, марганцем, никелем. Применение научно обоснованных маркеров генетической нестабильности соматических клеток и окислительной активности на уровне ДНК клетки позволит расширить доказательную базу причинения вреда здоровью в связи с воздействием химических факторов с мутагенной активностью при решении задач гигиенической экспертизы и расследований для принятия адекватных управленческих решений [2].
Целью настоящего исследования являлось изучение мутагенного эффекта у населения при хрони-
ческом аэрогенном воздействии хрома, марганца, никеля в зонах влияния выбросов металлургического и машиностроительного производств.
Материалы и методы. Гигиеническая оценка качества атмосферного воздуха, формируемого хромом, марганцем и никелем, выполнена на примере территории с размещением источников металлургического и машиностроительного производств. Использованы результаты мониторинговых наблюдений за период 2010—2012 гг. (данные ГУ Пермского ЦГМС и Роспотребнадзора по Пермскому краю), расчетов рассеивания загрязняющих веществ в атмосферном воздухе от стационарных источников методом пространственно-временного анализа в среде ГИС ARC/View (версия 3.2) и натурных исследований (данные ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения). Оценка содержания загрязняющих веществ в атмосферном воздухе выполнена на основании сравнительного анализа с предельно допустимыми концентрациями (ПДКс.с) и референтными уровнями для хронического ингаляционного воздействия (^СсЬг). Углубленное ци-тогенетическое и химиико-аналитическое обследование выполнено детям в возрасте 4—7 лет, проживающим и посещающим детские организованные учреждения, расположенные на расстоянии от 0,3 до 3,0 км от источника загрязнения атмосферного воздуха селитебной застройки металлами (группа наблюдения) и сравнительно детям, проживаю -щим в условиях отсутствия экспозиции данными металлами (группа сравнения). Исследование содержания хрома, марганца, никеля в крови обследуемых лиц выполнено в соответствии с МУК 4.1.777—99, МУК 4.1.1483—03, МУК 4.1.2106—06. Установленные концентрации металлов в крови оценивали на основании сравнительного анализа с результатами у детей, проживающих в условиях отсутствия аэрогенного воздействия исследуемых металлов (группа сравнения), референтными уровнями содержания марганца, никеля, хрома в крови
(RL) [3].
Цит
щтогенетическое исследование включало кариотипирование и постановку микроядерного теста. Исследование препаратов хромосом (количественный состав и морфологическая структура), полученных стандартной методикой стимулирования лимфоцитов периферической крови фитогемагглютинином с последующей фиксацией клеток в стадии метафазы, выполнено после дифференциального окрашивания (G-метод) под световым микроскопом AXIO Scope.Al (Karl Zeiss)
40
ЗНиСО ноябрь №11 (248)
при увеличении 1125. При метафазном анализе учитывали не менее 11 метафазных пластинок с оценкой результатов в соответствии с правилами Международной системы цитогенетической номенклатуры (КС^ — 2005. Исследование клеточных препаратов эксфолиативных буккальных эпи-телиоцитов выполнено методом микроядерного теста в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетиче-ского статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (2005). Детальная оценка ядерных аномалий проведена по расширенному протоколу показателей: 1) цитогенетических нарушений (клетки с микроядрами, протрузиями); 2) пролиферации (клетки с двумя, тремя и сдвоенными ядрами); 3) деструкции ядра (конденсация хроматина, вакуолизация ядра, клетки с кариорексисом, кариопикнозом, кариолизисом, клетки с апоптоз-ными телами) [3]. Оценка частоты встречаемости хромосомных изменений, распространенности микроядер и ядерных аномалий буккальных эпи-телиоцитов у детей группы наблюдения проведена на основании сравнительного анализа с показателями у детей группы сравнения.
Оценка окислительной активности металлов на уровне ДНК клетки выполнена на основании количественного определения маркера окислительного стресса — 8-гидрокси-2-деоксигуанозина (8-OHdG) в моче чувствительным конкурентным иммуноферментным методом. Выявление и оценка связи показателей цитогенетических изменений соматических клеток и концентрации в крови хрома, марганца, никеля выполнена на основании расчета показателя отношения шансов (ОШ) и его доверительного интервала ^1). Критерием наличия связи «концентрация металла в крови — показатель эффекта» являлось ОШ>1 [4]. Выявление различий изучаемых показателей между исследуемыми группами и уровня содержания в крови хрома, марганца, никеля оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа. В качестве критерия для проверки статистических гипотез использовали критерий Фишера (Б). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05
Результаты. Оценка качества атмосферного воздуха селитебной застройки в зоне влияния источников выбросов металлургического и машиностроительного производств свидетельствует о том, что в течение последних 3 лет среднегодовые концентрации хрома и никеля составляли 1,0—1,2 ПДКс.с., марганца 1,1—2,2 ПДКс.с. Превышение референтных концентраций для хронического ингаляционного воздействия по хрому составило 18—22 ШСс^, никелю — 20—24 ШГС^, марганцу — 22—44 ШСс^. В условиях загрязнения атмосферного воздуха исследуемыми металлами постоянно проживают до 250 тыс. человек, в том числе до 40 тыс. детей.
Углубленными исследованиями показано, что в крови детей группы наблюдения регистрируются повышенные концентрации изучаемых металлов относительно показателей у детей группы сравнения и референтных значений. При этом, у детей, проживающих на расстоянии 0,3—0,5 км от границы промышленной площадки (45 % от общего числа обследованных), концентрация марганца в крови установлена на уровне 0,04—0 06 мг/дм3, что составляет 3,6—5,5 ШЬ; никеля (35 % детей) — 0,1—0,2 мг/дм3 (6,6—13,3 ШЬ), хрома (40 % детей) - 0,03—0,04 мг/дм3 (2,1—2,9 ШЬ) (р = 0,001—0,003) (таблица). У детей, проживающих на расстоянии 2,5—3,0 км (25 % от общего числа обследованных), концентрация марганца в крови установлена на уровне 0,016—0,03 мг/дм3 (1,5—2,7 ШЬ), никеля (15 % детей) - 0,04—0,08 мг/дм3 (2,6—5,3 ШЬ), хрома (20 % детей) - 0,016—0,025 мг/дм3 (1,2—1,8 ШЬ) (р = 0,001—0,025).
У детей с концентрацией марганца в крови на уровне 0,04—0,06 мг/дм3, никеля — 0,1—0,2 мг/дм3, хрома — 0,03—0,04 мг/дм3 установлен полиморфизм хромосом, распространенность которого составила сэ 383,0 %с, что в 2,0 раза выше данного показателя ^^ у детей группы сравнения (р = 0,0001) и в 5,4 раза Д выше среднероссийского показателя (табл.). с=
Спектр полиморфных изменений хромосом з-представлен несколькими вариантами: увеличе- ) нием размеров спутников, спутничных нитей у акроцентрических хромосом (46,ХХ,2^+[11], 46,XY,13pstk+,14ps+ [11]); увеличением гете- ^^ рохроматиновых сегментов метацентрических и субметацентрических хромосом (46,XYqh-[11], = 46,ХХ16аЬ+[12], 46,ХХ, ^+[13]); развитием 3 полиморфных вариантов двух и более хромо- £ сом в кариотипе (46,XY,1qh+,15ps+,16qh+[11], = 46,ХХ^+,2^к+[11], 46,XY,1qh+,22ps+[11], 46,ХХ^+, 9qh+,21 Lpstk+[11]). Выявлен патологический дисбаланс по половым хромосомам (трисо-мия Х хромосомы (47,ХХХ[12]), не обнаруженный в группе сравнения.
У детей данной группы установлены выраженные изменения показателей, характеризующих нарушения ядерного аппарата буккальных эпите-лиоцитов. Выявлен дисбаланс клеточного обновления, проявляющийся замедлением апоптозной активности и усилением активности процесса пролиферации. Частота регистрации клеток буккаль-ного эпителия с кариорексисом, кариолизисом и апоптозными телами в 1,6 раза ниже относительно аналогичных показателей группы сравнения (р = 0,012—0,028). Частота регистрации многоядерных клеток и клеток с центральной круговой насечкой ядра в 1,8—2,0 раза превысила показатели сравнения (р = 0,014—0,036). Установлено выраженное нарушение нормального цикла митотического деления, ведущего к формированию микроядер. Распространенность клеток с микроядрами и про-трузиями в 4,0 раза выше показателей группы сравнения (р = 0,001—0,002) и в 5,0 раз выше среднероссийских показателей. Зарегистрирована выраженная активность окислительного повреждения на уровне ДНК клетки, о чем свидетельствует концентрация 8-OHdG в моче (293,4 ± 29,4) нг/см3, в 2,0 раза превышающая аналогичный показатель у детей группы сравнения. Установлена связь интенсивности окислительного повреждения на уровне ДНК клетки с концентрацией исследуемых металлов в крови (ОШ = 3,1—4,2; DI = 2,5—4,8; р = 0,001). Вклад марганца никеля и хрома в повышение уровня содержания 8-OHdG в моче составил 22—29 %, в формирование полиморфизма хромосом лимфоцитов и аномалий ядерного аппарата — 24—32 % (Б = 7,73—13,85; р = 0,001—0,031).
У детей с концентрацией марганца в крови на уровне 0,016—0,03 мг/дм3, никеля — 0,04—0,08 мг/ дм3, хрома — 0,016—0,025 мг/дм3 распространенность полиморфизма хромосом составила 250,0 %, что в 1,3 раза выше показателя сравнения, в 3,5 раза — среднероссийского показателя. Спектр вариантов полиморфизма хромосом представлен увеличением спутников акроцентрических хромосом (46,ХХ,^+[11], 46,ХХ,22ps+[l2]) и гетерохроматиновых сегментов 1, 9 хромосом (46,ХХ,1qh+[13], 46,ХХ,9qh+[12]), в то время как у детей группы сравнения наблюдается только увеличение спутников акроцентрических хромосом (46,ХХ,13ps+ [11], 46,ХХ,2^+[11]). Установлена умеренная активация процесса клеточного деления, характеризующаяся усилением апоптотической активности и активности процесса пролиферации. Установленная распространенность клеток с кариорексисом, ка-риолизисом и апоптозными телами в 1,3 раза выше аналогичных показателей группы сравнения (р = 0,015—0,033), многоядерных клеток и клеток с цен-
Ш №11 (248)
41
Таблица. Содержание металлов в крови и распространенность изменений хромосом, буккальных эпителиоцитов у детей в зоне влияния выбросов в атмосферный воздух металлургических и машиностроительного производств
Показатели Группа наблюдения (M ± m) Группа сравнения ( M ± m) Достоверность различий (р<0,005)
расстояние до промплощадки 0,3—0,5 км расстояние до промплощадки 2,5—3,0 км
Цитогенетические показатели, %%
Полиморфизм хромосом 383,0 ± 23,0 250 ± 28,0 189,0 ± 19,0 0,0001
Микроядра 2,56 ± 0,66 1,28 ± 0,22 0,64 ± 0,09 0,001
Ядерные протрузии типа «язык» 1,36 ± 0,28 0,59 ± 0,12 0,31 ± 0,06 0,002
Ядерные протрузии типа «разбитое яйцо» 0,35 ± 0,14 0,18 ± 0,04 0,09 ± 0,03 0,001
Показатели пролиферации, %
Ядра с круговыми насечками 2,34 ± 0,29 1,76 ± 0,13 1,17 ± 0,10 0,014
Многоядерные клетки 0,34 ± 0,11 0,24 ± 0,08 0,17 ± 0,05 0,036
Показатели деструкции, %
Ядра с вакуолизацией 6,15 ± 1,50 12,82 ± 2,31 9,86 ± 0,19 0,015
Клетки с апоптозными телами 0,37 ± 0,09 0,76 ± 0,21 0,59 ± 0,15 0,033
Содержание металлов в крови, мг/дм3
Марганец 0,052 ± 0,011 0,023 ± 0,007 0,011 ± 0,003 0,000
Никель 0,151 ± 0,023 0,061 ± 0,016 0,021 ± 0,009 0,000
Хром 0,035 ± 0,004 0,020 ± 0,005 0,006 ± 0,001 0,000
тральной круговой насечкой ядра — в 1,4 раза выше (р = 0,016—0,024). Выявлено умеренное повышение цитогенетических показателей. Частота встречаемости клеток с микроядрами и протрузиями до 2,0 раз выше показателей сравнения (р = 0,007—0,041). Концентрация 8-OHdG в моче (195,3 ± 18,7 нг/см3) в 1,3 раза выше показателя группы сравнения (р = 0,033), что характеризует умеренно выраженное повышение активности окислительного повреждения ДНК клетки. Установлена связь окислительного повреждения на уровне ДНК клетки с концентрацией исследуемых металлов в крови (OR = 2,0—2,8; DI = 1,5—3,6; р = 0,001). Данные связи у детей, проживающих вне экспозиции исследуемых химических факторов, отсутствуют. Доля вклада перечисленных химических мутагенов в повышение уровня содержания 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в моче составила 8—14 %, в формирование полиморфизма хромосом лимфоцитов и аномалий ядерного аппарата буккальных эпителиоцитов — 9—18 % (Б = 10,55—21,11; р = 0,001—0,025).
Таким образом, в зонах влияния источников выбросов металлургических и машиностроительных производств формируется неудовлетворительное качество атмосферного воздуха по уровню содержания марганца до 2,2 ПДКс.с. (до 44 ^Сс^г), хрома и никеля — до 1,2 ПДКс.с. (до 22—24 ^Сс^г). У детей селитебной застройки, расположенной на расстоянии 0,3—0,5 км от источников выбросов в атмосферный воздух, в крови регистрируются изучаемые металлы в концентрациях, до 13,0 раз превышающие референтные значения, на расстоянии 2,5—3,0 км — до 5 раз. Мутагенный эффект выражается в повышенной частоте клеток с цитогене-тическими аномалиями на фоне усиления проли-феративной активности, окислительных реакций на уровне ДНК клетки, снижения апоптотической активности, что является неблагоприятной тенденцией, характеризующей накопление генетически измененных клеток в популяции. Доказанные причинно-следственные связи показали, что маркерами мутагенного эффекта на популяционном уровне являются повышенная частота клеток с полиморфизмом хромосом в виде увеличения размеров спутников, спутничных нитей, гетерохро-
матиновых участков (в 3,5—5,4 раза относительно среднероссийского показателя, в 1,3—2,0 раза — относительно показателя в группе сравнения); повышенная частота многоядерных клеток и клеток с круговой насечкой ядра (в 1,4—2,0 раза относительно показателя группы сравнения), сниженная частота клеток с вакуолизацией и апоптозными телами (в 1,3—1,6 раза), повышенный уровень 8-OHdG в моче (в 1,3—2,0 раза).
Использование маркеров цитогенетической индикации мутагенного эффекта у населения при аэротехногенном воздействии хрома, марганца и никеля позволит повысить эффективность санитарно-гигиенической экспертизы и расследований, своевременно выявлять группы риска и осуществлять профилактику отдаленных последствий в виде хромосомных аберраций, врожденных пороков развития, стигм дизэмбриогенеза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Онищенко Г.Г., Зайцева Н.В., Землянова М.А. Гигиеническая индикация последствий для здоровья при внешнесредовой экспозиции химических факторов / Под ред. Г.Г. Онищенко. Пермь: Книжный формат, 2011. 532 с.
2. Зайцева Н.В., Шур П.З., Май И.В., Сбоев А.С., Волк-Леонович О.П., Нурисламова Т.В. Комплексные вопросы управления риском здоровью в решении задач обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия на муниципальном уровне //Гигиена и санитария. 2007. № 5. С. 16—18.
3. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н.У. Тица. М.: Медицина, 1986. 472 с.
4. Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариологических показателей при оценке цитогенетического статуса человека //Медицинская генетика. 2007. Т. 6. № 11 (65). С. 3—11.
5. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. М.: Медиа Сфера, 1998. 352 с.
Контактная информация
Землянова Марина Александровна, тел.: 8 (342) 236-39-30, e-mail: [email protected]
Contakt Information:
Zemlyanova Marina. phone: 8 (342) 236-39-30, e-mail: [email protected]
