CC BY
59
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS
0 И. П. Шабалкин, А. С. Ягубов, 1996 УДК 616.155.392-036.11-636.87-07
И. П. Шабалкин, А. С. Ягубов
ЦИТОФОТОМЕТРИЯ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ РЕЦИДИВА ПРИ ЛЕЙКОЗЕ
Отдел молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследования
Эффективность лечения злокачественных заболеваний крови во многом зависит от дифференциальной диагностики и раннего прогнозирования рецидива этих заболеваний. Тем самым перед клинической медициной постоянно стоит задача разработки новых методических приемов, которые позволили бы получать все более точную информацию о характере болезни пациента. Одним из них может быть, по нашему мнению, метод оценки функциональной активности генома клетки [4]. Метод основан на цитофотометрическом анализе клеточной популяции после окраски ядер клеток по Фель-гену (окраска на ДНК) и нафтоловым желтым 8 (окраска на гистоны). Для количественного определения функциональной активности генома клетки введен показатель Кфагсн.
Кфагс„ — коэффициент функциональной активности генома клетки выведен из отношения величин гис-тон/ДНК после определения оптической плотности ядра, окрашенного нафтоловым желтым 8 и по Фель-гену. Данный метод дает возможность определить в анализируемой популяции количество клеток, отклоняющихся от нормы по функциональной активности их генома. Различный характер распределения клеток по величине значений Кфагсн можно использовать в качестве теста при дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний системы кроветворения. Наряду с этим по гистограммам, построенным на основе определенных значений Кфагсн, можно следить за динамикой течения заболевания и количественно оценить эффективность его лечения. Ряд приведенных ниже данных, основанных на результатах наблюдений за больными с различными формами лейкозов, проходивших курс лечения в НИИ детской онкологии ОНЦ РАМН, свидетельствует о возможности использования этого метода в медицинской практике.
Материалы и методы. Мазки костного мозга подсушивали на воздухе в течение 1 ч, после чего фиксировали при 4° С в течение
1 ч 10 мин в забуференном 10% нейтральном формалине, приго-
I. P. Shabalkin, A. S. Yagubov
CYTOPHOTOMETRY IN DIFFERENTIAL DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF RECURRENCE IN LEUKEMIA
Department of Molecular Biological and Radioisotopic Methods of Investigation
Efficiency of treatment of blood malignancies to a high degree depends upon differential diagnosis and early prognosis of recurrence. The clinical medicine is continuously in search of new investigation approaches providing more accurate information about the disease. Evaluation of functional activity of the cell genome is one of such approaches [4]. The methodology is based on cytophotometry of cell populations after staining of cellular nuclei according to Feulgen (DNA staining) and with naphthol blue S (histone staining). To make quantitative evaluation of cell genome functional activity we used a parameter Clagcn.
Cfagcn, *• e- coefficient of functional activity of the cell genome, was derived from histone/DNA ratio as determined by optical density of nuclei after staining with naphthol yellow and according to Feulgen. This method allows determination of the number of cells different from normal ones by their genome functional activity. The difference in cell distribution with respect to Cfagcn may be used in differential diagnosis of hemopoietic malignancies. Besides, histograms based on Cfa„cn values may be applied to monitor disease course and to assess treatment efficacy. Examples below demonstrate potential of the method as applied in treatment of patients with various leukemia types at the Institute of Pediatric Oncology of the CRC RAMS.
Materials and Methods. Bone marrow smears were dried in air for 1 h and fixed at 4°C for 1 h 10 min in buffered 10% neutral formalin prepared according to Lilly [2]. Then the specimens were washed 30 min with cold pipeline water and 10 min with warm (37°C) distilled water. The specimens heated to 37°C were then hydrolyzed 20 min in 5N HC1 at 37°C, quickly rinsed in cold IN HC1 and in distilled water. Then they were transferred to SchifPs reagent solution (pH 2.7) prepared according to de Thomasi [2] and preliminary heated to room temperature to stay there for 2 h 10 min. The stained specimens were washed 3 times 10 min each in sulfureous water and then 20 min in warm running pipeline water and 10 min in distilled water. The slightly dried specimens were stained for 45 min in 0.1% naphthol yellow S solution (pH 2.8). The stained specimens
Рис. 1. Гистограмма распределения клеток костного мозга пациента № 1 в зависимости от изменения величины Кфаген.
По оси абсцисс — значения Кфаген; по оси ординат — частота встречаемости клеток с определенным значением Кфаген. о — контроль (донор № 105); * — пациент № 1 (январь 1990 г.).
Fig. 1 Histogram of bone marrow cell distribution with respect to changes in Cfagen in patient 1
Numbers on the x axis show Ctagen values; numbers on the у axis show rate of cells with certain Cfagen values, o, control (donor 105); *, patient 1 (January 1990).
товленном по Лилли [2]. Далее препараты промывали холодной водопроводной водой 30 мин, теплой (37° С) дистиллированной 10 мин. Прогретые при 37° С препараты гидролизовали 20 мин в 5 н. НС1 при 37° С. Затем быстро споласкивали в холодной 1 н. НС1 и в дистиллированной воде. Препараты переносили на 2 ч 10 мин в заранее прогретый до комнатной температуры раствор реактива Шиффа (pH 2,7), приготовленный по де Томази [2]. Окрашенные препараты промывали 3 раза по 10 мин в сернистых водах, далее 20 мин теплой проточной водопроводной водой и 10 мин дистиллированной. Слегка подсушенные препараты окрашивали 45 мин в 0,1% растворе нафтолового желтого Б (pH 2,8). Окрашенные препараты промывали 3 раза по 1 мин в третичном бутиловом спирте (2-метилпропанол-2), предварительно прогретом до 26° С. Промытые препараты сушили в течение суток в суховоздушном термостате при 37° С. В качестве контроля взяты два донора (№ 105, 103) из ранее проанализированной по критерию Кфагсн группы, включающей 9 человек, которые статистически не различались по вышеназванному критерию. Анализировали материал на микроспектрофотометре «иш-уаг» (Австрия), определяя в условных единицах оптическую плотность ядра клетки после окраски по Фельгену при X 575 нм, а после окраски нафтоловым желтым Б при 1 445 нм. Все данные были статистически обработаны с использованием критерия Стьюдента при р < 0,05. В каждом случае анализировали по 100 клеток костного мозга пациента (опыт) и донора (контроль). На основе полученных данных строили гистограммы распределения клеток в зависимости от изменения величины К,|)агсн. Для оценки степени отклонения опыта от контроля предложен показатель С, выраженный в процентах. Данный показатель определяют по разности между площадью гистограммы опыта и той частью площади гистограммы контроля, которая
were then washed 3 times 1 min each in tertiary butyl alcohol (2-methyl propanol-2) heated to 26°C. Further the specimens were dried in a dry air stove at 37°C. Material from two donors (Nos. 105 and 103) from a group of 9 persons previously tested for Ctagcn an(3 showing no statistically significant difference from the normal level by this factor was taken as control. The specimens were analyzed using a Univar (Austria) microspectrophotometer. Cell nucleus optic density was measured in conventional units at 575 nm after the Feulgen staining and at 445 nm after the naphthol yellow S staining. Statistical analysis of differences was performed by the Student’s test at p < 0.05. One hundred bone marrow cells were analyzed in each patient (test) and each donor (control). Cell distribution histograms with respect to changes in Cfa„cn value were constructed basing on the findings. Deviation of test values from control ones was evaluated using a parameter C expressed as percentage. This parameter was determined by the difference between the test histogram area and the part of the control histogram area which coincided with the test histogram, the number of test and control cells analyzed being equal (see the figure). Since the histogram area is the total of areas of rectangles having one equal side in the test and control (the same step size on the x axis conventionally taken for unit), then actual deviation of a test value from a relevant control value may be determined by the number of test cells with Cfagcn values not encountered in the control and by percentage of test cells with a certain Cfagc„ value exceeding the number of control cells with the same Clagcn.
Let us consider for example histograms of patient 1 and donor 105 (see the figure). The first difference between the test and control histograms is that only 34 from 100 bone marrow cells of patient 1 have the same Cfagen values as the donor’s. Hence, C is 66%.
совпадает с площадью гистограммы опыта при одинаковом количестве проанализированных клеток как в опыте, так и в контроле (рис. 1). Так как площадь гистограммы оценивается как сумма площадей прямоугольников, одна сторона которых одинакова для опыта и контроля (один и тот же размер шага на абсциссе оси координат гистограммы, условно принятый за единицу), фактически степень отклонения опыта от контроля сводится к оценке количества клеток опыта, величина Кфагсн которых не имеет аналогичных значений в контроле, и определению доли клеток опыта с конкретной величиной Кфагсн, превышающей число клеток контроля с таким же значением
Кфагсн-
Для примера рассмотрим гистограммы пациента № 1 и донора № 105 (см. рис. 1). Первое различие между гистограммами заключается в том, что из 100 проанализированных клеток костного мозга пациента № 1 только 34 клетки имеют значения КфаГсн, совпадающие со значениями Кфагсн донора. Отсюда показатель С равен 66%. Второе различие связано с разным количеством клеток, приходящихся на каждый разряд гистограммы опыта и контроля. Так, среди общего количества проанализированных клеток костного мозга пациента № 1 со значением Кфагсн=1,1 насчитывается 17 клеток, а у донора имеется только одна клетка с аналогичным значением. Сравнительная оценка гистограмм по разрядам позволяет ответить па вопрос, в клетках какого разряда гистограммы пациента произошли изменения под действием того или иного фактора, что может иметь значение при изменении тактики лечения больного.
Результаты и обсуждение. Сравнительный анализ степени тяжести заболеваний у детей с различными формами лейкозов, оцениваемый гемоцитологическим методом (т. е. по проценту бластных клеток) и по критерию Кфагсн, показал, что наблюдается прямая корреляция между процентом бластных клеток и долей клеток, отклоняющихся от нормы по Кфагсм (показатель С): чем больше процент бластных клеток, тем выше показатель С. Иллюстрацией служит табл. 1, в которой представлены выборочные данные, отражающие общие тенденции в группе из 32 больных, находящихся под наблюдением в течение нескольких лет. Обращает па себя внимание то, что ни в одном случае показатель С не достигает 100%. Это, по-видимому, обусловлено тем, что часть бластных клеток является клетками, которые перешли с уровня, характерного для нормально функционирующей дифференцированной клетки костного мозга, на другой функциональный режим, приобретая свойства совершенно иной дифференцированной клетки [6]. Так, например, показано, что в опухолях далеко не эндокринного происхождения (легких, печени, почек, пищевода и др.) наблюдается образование некоторых гормонов в таких количествах, что это может привести к существенному дисбалансу гормонального статуса организма и развитию в некоторых случаях синдрома соответствующего заболевания [7, 9]. По данным А. К. Протасовой [3], у детей, больных острым пелимфобластным лейкозом, при каждом морфологическом типе бластных клеток встречается более чем один иммунологический фенотип клеток. При этом ни один из иммунологических маркеров не экспрессируется на 100% бластных клеток.
Несмотря на то что гемоцитологический показатель (процент бластов) является наиболее широко используемым в практике критерием, последний не всегда в полной мере отражает истинное состояние больного, особенно когда речь идет об определении состояния ремиссии или рецидива. Считается, что если в популяции костного мозга больного обнаружено более 5% бластных клеток, то имеет место рецидив заболевания, при других значениях— ремиссия [1]. Одпако, как по-
T аблица 1 Table 1
Зависимость между долями клеток костного мозга, ОТКЛОНЯЮЩИХСЯ ОТ нормы ПО критерию Кфаген (показатель С), и процентом бластных клеток у детей, больных различными формами лейкозов Correlation of bone marrow cell fraction deviating from the normal cells by Cfagen (parameter C) and blast percentage in patients with leukemia
№ пациента Форма лейкоза Количество бластных клеток Показатель С, %
1 ОНЛЛ (М2) / ANLL (М2) 100 50
2 ОНЛЛ (М2)/ANLL (М2) 85 47
3 ОНЛЛ (М2)/ANLL(М2) 60 42
4 ОНЛЛ (М3) /ANLL (М3) 100 79
5 ОНЛЛ (М3)/ANLL (М3) 60 52
6 ОНЛЛ (M4) / ANLL (М4) 100 76
7 ОНЛЛ (М4) / ANLL (М4) 70 51
8 ХНЛЛ / CNLL 60 56
9 ХНЛЛ / CNLL 20 34
10 ОЛЛ / ALL 100 87
11 ОЛЛ / ALL 34 47
Patient’s No. Leukemia type No. of blast cells Parameter С, %
Примечание. ОНЛЛ (М2) — острый нелимфобластный лейкоз, вариант М2; ХНЛЛ — хронический нелимфобластный лейкоз; ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз.
Note. ANLL (М2), acute non-lymphoblastic leukemia, variant М2; CNLL, chronic non-lymphoblastic leukemia; ALL, acute lymphoblastic leukemia.
The second deviation is related to different numbers of cells in each test and control histogram rank. There are 17 cells with Cfagcll 1.1 in the patient’s cells analyzed against 1 cell with the same Cragcn value in the control. Comparative analysis of histograms with respect to rank determines the patient’s histogram rank in which some changes occurred under the effect of this or that factor, and this may be of significance when choosing treatment strategy.
Results and Discussion. Comparison of disease severity in children with various leukemia types as evaluated by hemocytology (i. e. by percentage of blasts) and by the Cf showed direct correlation between percentages of blasts and cells different from normal ones with respect to Cfagcn (the parameter C); the larger blast percentage, the higher the parameter C. Table 1 reflects general tendencies in a group of 32 patients under fol-low-up for several years. Note that the parameter С fails to reach 100% in any of the cases. It seems that a part of blasts shifted from the level of normally functioning differentiated bone marrow cells to another functional level and acquired properties of other differentiated cells [6]. It was showed, for instance, that tumors of non-endocrine (lungs, liver, kidneys, esophagus, etc.) origin may generate some hormones in amount that may lead to a significant disbalance in the body hormonal status and sometimes to development of certain diseases [7, 9]. According to A.K.Protasova [3] there are more than one immunological phenotypes for each morphological type of blasts in children with acute non-lym-phoblastic leukemia. While none of the immunological markers is expressed on 100%) of their blasts.
Although the hemocytological characteristic (percent-
Таблица 2 Table 2
Время обнаружения рецидива по критерию Кфаген (показатель С) и проценту властных клеток у детей, больных ОЛЛ Time of recurrence detection by Cfagen (parameter C) and by blast percentage in children with ALL
№ пациента № истории болезни Дата обследования пациента, месяц, год Состояние больного на момент обследования, % бластов Показатель С к моменту обследования, % Дата обнаружения рецидива морфологическим методом, месяц, год Доля бластов к моменту обнаружения рецидива морфологическим методом, % Интервал времени между обнаружением рецидива по показателю С и проценту бластных клеток, мес
1 84/2971 01.90 3,2 66,0 01.91 20,0 12
2 89/2878 02.90 1,2 49,0 12.90 29,2 9
3 86/2188 02.91 - 53,0 07.91 42,8 5
4 88/3634 06.92 0,2 52,0 07.93 100,0 13
5 90/1526 12.93 1,6 56,0 04.94 5,6 4
90/1526 04.94 5,6 68,0 02.95 34,0 10
6 85/2342 06.91 0,8 34,0 05.92 80,0 11
85/2342 02.93 3,2 51,0 05.93 9,0 3
7 90/1682 12.93 2,0 42,0 06.94 6,0 6
Patient’s No. Case history No. Month and year of patients’ examination Percentage of blasts at examination Parameter С at examination Month and year of recurrence detection by morphology Blast percentage at recurrence detection by morphology Months of interval between recurrence detections by the parameter С and blast percentage
казывают биохимические и иммунологические исследования, процент патологических клеток может быть значительно выше, чем это определяется морфологическим методом (т. е. по проценту бластных клеток). Данный феномен носит название «минимальная остаточная болезнь» [8, 10, 11]. Отмеченный факт свидетельствует, что необходим поиск новых эффективных критериев для раннего прогнозирования рецидивов при гемобластозах. Для этой цели можно воспользоваться методом оценки функциональной активности генома клетки. В качестве примера ниже приведены сравнительные результаты анализа мазков костного мозга больного острым лимфобластным лейкозом, полученные морфологическим методом и с использованием критерия кфагсн.
Пациент № 1 (история болезни 84/2971) на момент обследования (январь 1990 г.) по всем клиническим показателям находился в состоянии ремиссии. На это указывали и данные анализа мазков костного мозга, проведенные в гемоцитологической лаборатории: доля бластных клеток соответствовала 3,2%. Однако результаты исследования популяции костного мозга пациента № 1г проведенные с использованием критерия Кфагсн, свидетельствовали, что в изучаемой популяции произошли значительные изменения. По среднему значению величина Кфагсн больного № 1 статистически достоверно отличалась от Кфагсн донора № 105:
Кфагсн больного № 1 — 1,17 (1,11 -г- 1,23),
Кфагсн донора № 105— 1,63 (1,57 4- 1,69).
Причем, как видно на рисунке, доля клеток, отклоняющихся от нормы по величине Кфагсн, достигла 66% что дало основание прийти к заключению о сдвиге равновесия в популяции костного мозга пациента № 1 в сторону злокачественной трансформации. Действительно, через год, в январе 1991 г. при исследовании костного мозга морфологическим методом у пациента № 1 диагностирован рецидив (20% бластов). Из приведенного примера следует, что по критерию Кфагсн можно
age of blasts) is the major criterion in the clinical practice, it fails to reflect correctly the patient’s condition especially as concerns remission or recurrence. Indeed, if the patient’s bone morrow population contains more than 5% of blasts, the patient’s state is defined as recurrence, otherwise it is remission [1]. However, biochemical and immunological studies demonstrate that percentage of pathological cells may be much higher than by morphological investigation. This phenomenon is called ’minimal residual disease’ [8, 10, 11]. Therefore, new criteria are needed for early prognosis of recurrence in hemoblastosis. The method of evaluation of cell genome functional activity may be used for this purpose. As an example we present below results of comparison of bone marrow smears from a patient with acute lymphoblastic leukemia by morphological methodology and by the Cfagcn criterion.
Patient 1 (case history 84/2971) was in remission by clinical examination in January 1990. The remission was confirmed by hemocytological findings (3.2% of blasts). However, study of the patient’s bone marrow cell population by the Cf showed significant changes. The patient’s mean Cf values were different from those of donor 105 in a statistically significant manner:
Patient’s Cfa„cn 1.17 (1.11-^1.23) versus donor’s Cf.,„cn 1.63 (1.57-5-1.69).
As seen in the figure percentage of cells deviating from the normal level by Cfa„cn reaches 66 which suggests a shift in the patient’s bone marrow population towards malignant transformation. This suggestion was confirmed after one year (January 1991) when morphological investigation of the patient’s bone marrow discovered 20%> of blasts, i.e. recurrence. This example shows that the Cfagcn evaluation allows detection of changes in patients’ bone marrow population much earlier as compared with morphological methodology. Study of a group of children with acute lymphoblastic leukemia being in remission
обнаружить изменения в популяции костного мозга больного задолго до выявления их морфологическим методом. Результаты наблюдений за группой пациентов показывают (табл. 2), что у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, но находящихся в момент обследования в ремиссии, наступлению рецидива предшествуют изменения в качественном составе популяции клеток костного мозга. За 3 — 13 мес до клинического проявления рецидива в популяции клеток костного мозга больного число клеток, отклоняющихся от нормы по критерию Кфагсн(показатель С), превышает 33%. Следует подчеркнуть, что данные табл. 2 не включают результаты исследований за больными, которые длительное время находятся в состоянии ремиссии. У последних в течение всего срока наблюдений показатель С был меньше 33%. Опираясь на эти данные, можно высказать предположение, что существует точка перехода нормальной популяции клеток костного мозга в качественно новое состояние, заканчивающееся рецидивом. Эта критическая точка соответствует 1/3 клеток, отклоняющихся от нормы в сторону злокачественной трансформации по критерию Кфагсн.
Интересно, что проведенное нами ранее исследование [5], касающееся изучения влияния перевивных опухолей на отдаленные органы и ткани организма-опухоленосителя по критерию Кфагсн, показало, что различие по Кфагсп между органом/тканью интактного животного и тем же органом/тканью животного-опу-холеносителя статистически достоверно, если показатель С равен или превышает 33%. Другими словами, при меньших значениях показателя С опухоль не оказывает влияния на тот или иной орган/ткань живот-ного-опухоленосителя.
Из сказанного следует, что популяция клеток переходит в качественно новое состояние, когда изменяется не менее 1/3 входящих в нее клеток. Если считать, что популяция представляет собой систему, состоящую из сообщества клеток, а организм — совокупность систем, то, опираясь на экспериментальные данные, можно прийти к заключению, что любая система должна переходить в качественно новое состояние в том случае, если функционально изменяется не менее 1/3 составляющих ее элементов. Отсюда в общем контексте работы злокачественность, на наш взгляд, можно рассматривать как заболевание, проходящее в организме 3 этапа развития:
I этап — в системе клеточной популяции, являющейся сообществом клеток ткани/органа;
II этап — в системе тканей и органов организма (нервной, пищеварительной, дыхательной и др.);
III этап — в системе целого организма, представляющего собой совокупность систем тканей и органов.
Таким образом, в каждой из этих систем переход от нормы к патологии должен происходить при отклонении от нормы более 1/3 составляющих ее элементов.
ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES
1. Бернар Ж. II Пробл. гематол. — 1965. — № 11. — С. 3—9.
2. Пирс Э. Гистохимия. — М., 1962.
3. Протасова А. К. Морфофункциональная характеристика вариантов острого миелоидного лейкоза у детей: Дис. ... д-ра мед.
наук. — М., 1990.
at examination (table 2) shows that recurrence is preceded by certain qualitative changes in composition of the patients’ bone marrow cell population. At 3 to 13 months before clinical recurrence the number of cells deviating from normal ones with respect to Ctagcn (parameter C) was more than 33%). Note that table 2 does not contain data on patients in long lasting remission. The parameter C in such patients is less than 33%) during the entire remission period. These data suggest that there is a critical point when the normal bone marrow cell population transforms into a qualitatively new state leading to recurrence. This critical moment comes when 1/3 of the cells demonstrate deviation towards malignant transformation as assessed by the Clagcn.
Of interest that one of our previous studies [5] concerning with the effect of transplanted tumors on remote organs and tissues of tumor-bearing animals as evaluated by Ctagcn showed that the difference between organs/tissues of intact animals and the same organs/tissues of tumor-bearers by Cfagcn was statistically significant if the parameter C was not less than 33%>. In other words, the tumor produces no effect on organs/tissues of the tumor-bearing animal if C is less than 33%).
It follows therefore that the cell population transforms into a new state when not less than 1/3 of its cells undergo changes. The population is a system of cell communities, the body is a community of various systems. Hence, the following conclusion may be made basing on experimental findings. Any system must transform into a new qualitative state if not less than 1/3 of its elements undergo functional changes. Therefore, malignancy may be considered a disease undergoing three stages of development:
stage I, in a cell population system, i.e. in a community of cells of an organ/tissue;
stage II, in a system of tissues and organs (nervous, digestive, respiratory, etc.);
stage III, in the system of the whole body as a
community of tissue and organ systems.
This hypothesis suggests that the transition from the normal status to pathology in each of these systems occurs when more than 1/3 of its elements become dif-
ferent from the normal elements.
4. Шабалкип И. П., Мамонтов С. Г. Гистохимический метод оценки функциональной активности генома клетки. Деп. ВИНИТИ. № 3134-В93.
5. Шабалкип И. П., Ягубов А. С. II Вестн. ОНЦ РАМН. — 1995. — № 4.— С. 14—17.
6. Швембергер И. Н. Рак и дифференцировка клетки. — Л., 1976.
7. Lipsetl М. В. II Cancer Res. — 1965. — Vol. 25. — P. 1068— 1078.
8. MacIntyre E. A., d'Auriol L., Dapare W. et al. //Clin. Invest. —
1990. — N 86.— P. 2135—2150.
9. Pearson O.H. //Cancer Res.— 1965.— Vol. 25. — P. 1974— 1975.
10. Meale С. A. М., Menarger Kitchingam G. R. et al. // Blood. —
1991, —N 78.— P. 739—747.
11. Tycko B., Palmer J. D., Link M. P. et al. // Cancer Cell. — 1989. — N 7.— P. 47—52.
Поступила 06.02.96 / Submitted 06.02.96
