CC BY
39
УДК 578.827.1
Ключевые слова: ретровирус, лейкоз, домашняя птица,мониторинг, ПЦР
Кеу words: retrovirus, leukosis, poultry, monitoring, PCR
Карамендин К. О., Саятов М. Х., Кыдырманов А. И., Нуршин К. А., Сулейменова С.
ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСОВ ЛЕЙКОЗА ПТИЦ В КАЗАХСТАНЕ И ИХ РАННЯЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА В ПЦР
CIRCULATION OF AVIAN LEUKOSIS VIRUSES AND THEIR EARLY MOLECULAR
DIAGNOSTICS BY PCR
Республиканское государственное предприятие «Институт микробиологии и вирусологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан. Адрес: 050010, Республика Казахстан,
г. Алматы, ул. Богенбайбатыра, д. 103.
Institute of Microbiology and Virology, Republican State Enterprise of Science Committee of Education and Science Ministry of the Republic of Kazakhstan. Address: 050010, Republic of Kazakhstan, Almaty, Bogenbaybatyr str.,103
Карамендин Кобей Омертаевич, вед. науч. сотрудник лаборатории экологии вирусов. Тел. (727) 291-84-97
Karamendin Kobey O., Leading Researcherin the Laboratory of Viral Ecology. Tel. +7 (727) 291-84-97 Саятов Марат Хусаинович, гл. науч. сотрудник лаборатории экологии вирусов Sayatov Marat H., Chief Researcher in the Laboratory of Viral Ecology Кыдырманов Айдын Исагалиевич, зав. лабораторией экологии вирусов Kydyrmanov Aidyn I., Head of the Laboratory of Viral Ecology Нуршин Куандык Аманбаевич, ст. науч. сотрудник лаборатории экологии вирусов Nurshin Kuandyk A., Senior Researcher in the Laboratory of Viral Ecology Сулейменова Сымбат, старший лаборант Suleymenova Symbat, Senior Laboratory Assistant
Аннотация. В настоящей статье описываются результаты молекулярной диагностики лейкоза птиц с целью получения новых данных по распространению различных генетических вариантов вируса в птице-хозяйствах юго-востока Республики Казахстан. На птицефабрике из юго-востока Казахстана произошла массовая вспышка болезни среди птицепоголовья различных возрастов. Осуществлен скрининг собранных материалов с помощью ПЦР, в результате которого получены положительные результаты в шести исследованных на лейкоз птиц пробах. Проведенные нами исследования с помощью ПЦР позволяют выявить на ранних стадиях циркуляцию ВЛП1 в птицеводческих хозяйствах Казахстана, что имеет важное значение для своевременного принятия профилактических мероприятий.
Summary. This article describes the results of molecular diagnostic of leukosis in poultry, in order to obtain new data about distribution of various genetic variants of the virus among poultry farms at southeast of the Republic of Kazakhstan. There was a massive outbreak of disease among domestic birds of different ages in the poultry farms at southeast of Kazakhstan. The screening of collected materials by PCR-method was performed, and positive results were obtained in six samples which were tested for leukemia. Our studies using RT-PCR can detect the early stages of the avian leukosis virus that circulate among poultry farms in Kazakhstan, and that is essential for the timely maintenance ofprophylactic measures.
Введение
Одним из самых актуальных заболеваний, причиняющих существенный урон птицеводству, является лейкоз птиц. Наносимый им ущерб складывается из гибели и вынужденного убоя птицы, резкого снижения яйценоскости, нарушения процессов воспроизводства в племенном птицеводстве, браковки тушек, ограничительных мероприятий [5].
Лейкоз птиц (лат. Leukosis avium; гемо-бластоз, лейкемия, белокровие, гепатолим-фоматоз, лимфобластоз) - неопластическая
1 ВЛП - вирус лейкоза птиц (прим. ред.)
вирусная болезнь, характеризующаяся системными опухолевидными разрастаниями кроветворной ткани [1].
Вирус лейкоза относится к семейству ретровирусов (Retroviridae), подсемейству Oncovirinae. Все онкогенные вирусы имеют общее свойство - при заражении ими чувствительных животных они индуцируют опухоли.
У кур, инфицированных вирусом лейкоза птиц (ВЛП), на вторые-третьи сутки наблюдается интенсивное размножение в крови
возбудителя, однако птицы не выделяют его во внешнюю среду. Вирусемию сменяет ви-русоносительство в течение всей жизни. Выделение вирусов начинается с момента размножения возбудителя в паренхиматозных органах и продолжается до гибели птицы. От больной птицы вирус выделяется со слюной, экскрементами и яйцами.
Болезнь регистрируют в более чем 50-ти странах с развитым птицеводством у многих видов птиц, однако чаще болеют куры, у которых она в основном и диагностируется [4].
ВЛП делится на шесть подгрупп А, В, С, D, Е и J на основании различий в поверхностных гликопротеидных белках вирусов, ответственных за образование вируснейтра-лизующих антител, перекрестную интерференцию и определяющих круг хозяев [9].
Экзогенные подгруппы А, В, С, D и J горизонтально и вертикально передаются потомству [3], но эндогенная подгруппа Е наследуется по закону Менделя [8].
Изучением лейкоза птиц вплотную начали заниматься в 1970-е гг., когда эпизоотии в коммерческих стадах были обычным явлением, и смертность от заболевания составляла около 2 %. В то время чаще выделяли вирусы лейкоза подгруппы А, реже - подгруппы В, а С и D еще не были распознаны.
Анализ литературы указывает на трансконтинентальное распространение вируса. В конце 1980-х и начале 1990-х гг. высокопатогенная разновидность ВЛП (7) вызвала значительную гибель птиц в Великобритании и Японии. В середине 1990-х гг. вирус распространился в других европейских странах и достиг США и Аргентины. Впоследствии в 2000-х гг. вирус обнаружили в Китае и Малайзии [2, 6, 7].
Несмотря на успехи, достигнутые в искоренении заболеваемости лейкозом птиц в развитых странах, вирус завоевывает все более прочные позиции в таких странах, как Китай, где наблюдается заболеваемость кур не только мясного, но и яичного направления.
Сельское хозяйство Казахстана также уязвимо для заноса ВЛП на его территорию, и проведение систематического мониторинга
является актуальной задачей сегодняшнего дня. Несмотря на повсеместную распространенность болезни и изученность природы самого ВЛП, мониторинг заболеваемости в Казахстане не проводился, современных данных о распространении вируса в регионе не имеется.
В настоящей статье описываются результаты молекулярной диагностики лейкоза птиц с целью получения новых данных по распространению различных генетических вариантов вируса в птицехозяйствах юго-востока РК.
Материалы и методы
Сбор полевых материалов. Для вирусологических, молекулярно-биологических исследований биопробы собирали стерильными пинцетами от павших птиц после пато-логоанатомического вскрытия и помещали в стерильные флаконы с транспортировочной средой. Все пробы до проведения исследований хранили в жидком азоте (-196°С).
Выделение РНК из биологических образцов проводили с использованием набора QIAampViralRNAMinikit (QiagenGmbH, Hilden) или с помощью TrizolLS в соответствии с рекомендациями производителей.
КДНК из РНКВЛП получали методом обратной транскрипции с использованием универсального праймера random hexamer.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами к консервативной последовательности env-гена ВЛП (AD1-F GGGAGGTGGCTGACTGTGT и H7-R CGAACCAAAGGTAACACACG) при следующих условиях: начальная 2-х мин денатурация ДНК при 95°С, тринадцать циклов, включающих денатурацию (93°С, 1 мин), отжиг праймеров (60°С, 1 мин) с понижением температуры на один градус с каждым циклом, удлинение цепи (72°С, 1 мин 30 сек), затем 30 циклов амплификации, включающих денатурацию (93°С, 1 мин), отжиг прай-меров (48°С, 1 мин) и удлинение цепи (72°С, 1 мин 30 сек) с последующей окончательной элонгацией при 72°С, 10 мин. Реакцию ставили в термоциклере Eppendorf Gradient (Германия).
В качестве положительного контроля использовали РНК изолята ВЛП/цыпленок/Ал-маты/44/2013, отрицательного контроля - де-ионизированную воду.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 2 % растворе агарозы (Sigma, США) в трис-ацетатном буфере при напряжении 88V (8 вольт/см) на аппарате Biostep (Великобритания).
Результаты исследований и обсуждение
Сбор биологических образцов в птицеводческих хозяйствах Казахстана и их скрининг с помощью ПЦР
Основанием для сбора материала и проведения клинико-морфологических и мо-лекулярно-генетических исследований кур в одной из птицефабрик юго-востока Казахстана явилась массовая вспышка болезни среди птицепоголовья различных возрастов. В начале вспышки симптомы болезни с летальным исходом проявлялись у небольшого количества взрослых кур. Постепенно количество больных и павших особей нарастало. Массовому охвату болезни вначале подверглись куры-несушки в возрасте 423 дня, затем, через 17 дней, - куры в возрасте 440 дней, и спустя несколько дней болезнь охватила и бройлерных цыплят 30-ти дневного возраста. Заболевшие птицы погибали в большом количестве в состоянии общего сильного угнетения. Всего от домашних птиц в хозяйстве на юго-востоке Казахстана собраны биологические образцы от 30-ти больных кур в виде кусочков органов, мазков и цельной крови, а также костного мозга из бедренной кости.
Осуществлен скрининг собранных материалов в ПЦР, в результате которого получены положительные результаты в шести исследованных пробах (рис. 1).
Как представлено на рисунке 1, в результате реакции с праймерами к участку env-гена вируса лейкоза кур ожидаемый продукт в ~326 пар оснований обнаружен в шести исследованных образцах, что свидетельствует о циркуляции ВЛП подгрупп А, В, С, D или Е среди домашних птиц.
Всегда существует вероятность появления новых ретровирусов в результате
Рис. 1.Результаты ПЦР с РНК, выделенными из биопроб от домашних кур в птицефабрике юго-восточного Казахстана. Обозначения: «М» - ДНК маркер; «К+» - положительный контроль (ВЛП/цыпленок/ Алматы/44/2013); «К-» - отрицательный контроль (деионизированная вода); «№ 1-6» - нумерация проб.
мутаций, примером чего может служить обнаружение в 1980-х гг. вируса лейкоза подгруппы 7, явившегося продуктом редкой генетической рекомбинации между экзо-и эндогенными вирусами. Данный вирус, вызывающий миелоидный лейкоз, распространился по всему миру и явился причиной значительных экономических потерь в птицеводстве. Следовательно, в будущем возможно появление новых измененных вариантов, представляющих угрозу для сельского хозяйства.
На сегодняшний день в литературе мало сведений о частоте заболеваемости лейкозом в птицеводческих хозяйствах, характере и степени поражения отдельных органов и тканей. До сих пор остается сложным и спорным вопрос дифференциальной диагностики отдельных форм лейкоза от других болезней со сходной клиникой и патологоанатомиче-скими проявлениями. По клиническим признакам болезнь не распознается; гематологические исследования, имеющие некоторое значение для выявления эритробластоза и лимфоидного лейкоза птиц, сложно проводить в значимых масштабах.
Заключение
Проведенные нами исследования с помощью ОТ-ПЦР позволяют выявить на ранних стадиях циркуляцию ВЛП в птицеводческих хозяйствах Казахстана, что имеет важное значение для своевременного принятия профилактических мероприятий.
Список литературы
1. Сюрин, В. Н., Самуйленко, А. Я., Соловьев, Б. В., Фомина, Н. В. Вирусные болезни животных [Текст]/ В. Н. Сюрин, А. Я. Самуйленко, Б. В. Соловьев, Н. В. Фомина // М. : ВНИТИБП, 1998. - 928 с.
2. Fadly, A. M., Smith, E. J. Isolation and some characteristics of an iaolate associated with myeloid leukosis in meat-type chickens in the United States [Текст] / E. J. Smith, A. M. Fadly // Avian Diseases. -1999. - № 43. - P. 391-400.
3. Fadly, A. M., Payne, L. N. Leukosis/sarcoma group [Текст] / A. M. Fadly, L. N. Payne // Diseases of poultry. -2003. - № 11. - P. 465-516.
4. Fadly, A. M. Avian tumor diseases [Текст] / A. M. Fadly // Proc. 14th World Vet. Poult. Congr. Exhibit. Istanbul, Turkey, 2005. - Р. 4.
5. Fenton, S. P., Reddy, M. R., Bagust, T. J. Single and concurrent avian leukosis virus infections with avian leukosis virus J and avian leukosis virus A in Australian meattype chickens [Текст] / S. P. Fenton, M. R. Reddy, T. J. Bagust // Avian Pathology. - 2005. - № 34. -P. 48-54.
6. Payne, L. N., Brown, S. R., Bumstead, N., Howes, K., Frazier, J. A., Thouless, M. E. A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens [Текст] / L. N. Payne, S. R. Brown, N. Bumstead, K. Howes, J. A. Frazier, M. E. Thouless // Journal of General Virology. - 1991. - № 72. - P. 801-807.
7. Payne, L. N., Gillespie, A. M., Howes, K. Induction of myeloid leukosis and other tumors with the HPRS-103 strain of ALV [Текст] / L. N.Payne, A. M. Gillespie, K. Howes // The Veterinary Record. - 1991. - № 129. -P. 447-448.
8. Pham, T. D., Spencer, J. L., Johnson, E. S. Detection of avian leukosis virus in albumen of chicken eggs using reverse transcription polymerase chain reaction [Текст] / T. D. Pham, J. L. Spencer, E. S. Johnson // J. Virol. Methods. - 1999. - № 78. - P. 1-11.
9. Zhang, H. M., Bacon, L. D., Cheng, H. H., Hunt, H. D. Development and validation of a PCR-RFLP assay to evaluate TVB haplotypes coding receptors for subgroup Band subgroup E avian leukosis viruses in White Leghorns [Текст] / H. M. Zhang, L. D. Bacon, H. H. Cheng, H. D. Hunt // Avian Pathol. - 2005. - № 34. - P. 324-331.
