CC BY
63
УДК 616.31:612
ЦИРКАДИАННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
В.И. ШЕМОНАЕВ1, А.А. МАЛОЛЕТКОВА1 ДМ. ФРОЛОВ2, В.В. НОВОЧАДОВ2 И.П. РЫЖОВА3
1)Волгоградский государственный медицинский университет
2) Волгоградский государственный университет
3) Белгородский государственный национальный исследовательский университет
e-mail: [email protected]
Введение. Ротовая жидкость (РЖ) - сложная по происхождению и составу биологическая среда, участвующая в реализации множества функций: иммунобиологическом надзоре, пищеварительной, минерализующей, очищающей. Несмотря на то, что РЖ содержит лишь 0,2-0,4% белка и не более 2% других веществ, она обладает высокой внутренней структурированностью, что обусловлено наличием в ней мицелл на основе фосфата кальция. Присутствие в смешанной слюне кислых белков, богатых пролином, придает ей вязкость и тягучесть. Важным компонентом местного гомеоста-за является кислотно-основное равновесие в полости рта, с которым тесно связаны физические и биохимические свойства РЖ [2, 10].
Исследование морфологии биологических жидкостей - принципиально новое научное направление, которое имеет комплексный системный подход к их изучению с позиций физической химии, кристаллографии и принципов синергетики. Кристалло-построение в процессе высушивания РЖ отражает не только ее химический состав, но также прижизненные свойства и функциональные изменения [4, 8, 9].
Процессы, происходящие в биологических системах, имеют ритмический характер с различной периодичностью ввиду своей изменчивости во времени. Известно, что циркадианные ритмы оказывают влияние более чем на 300 физиологических констант организма с изменением состояния вегетативной иннервации и эндокринных желез [1, 11]. Поэтому необходимо более глубокое исследование свойств РЖ в зависимости от биоритмов.
Целью исследования стало изучение циркадианной организации физико-химических свойств ротовой жидкости у практически здоровых людей.
Материалы и методы. В исследование были включены 200 человек (100 мужчин и 100 женщин) в возрасте 21-25 лет, случайно отобранных из группы лиц с полными зубными рядами и ортогнатическим прикусом, не нуждающихся по результатам стоматологического обследования в санации полости рта.
За 30 минут до исследования исключали прием пищи, питья, курение и физические упражнения. Перед каждой пробой обследуемый полоскал ротовую полость водой трижды, удалял остатки воды чистой салфеткой, вносил РЖ в пластиковую пробирку с крышкой [2].
Определение рН проводили сразу после получения РЖ при помощи прибора «Acorn pH5 series pH/oC Meter» (Oakton, США). Перед началом работы производили калибровку прибора по стандартному буферу (рН=7,0), далее электрод промывали в дистиллированной воде и помещали в пробирку с собранной РЖ для определения pH. Перед последующим определением электрод промывался в физиологическом растворе и дистиллированной воде.
Работа посвящена изучению биоритмологической организации параметров ротовой жидкости человека. Методом Косинор-анализа проведено моделирование их среднесуточного ритма. Определена четкая временная структура изменения изучаемых параметров ротовой жидкости в пределах циркадианного ритма.
Ключевые слова: ротовая жидкость, хронобиология.
Определение вязкости РЖ проводили при помощи ротационного вискозиметра DV-II+ (Brookfield, США) с использованием SS-адаптера для образцов малого объема. Значения вязкости получали в сантипуазах (сПз), затем переводили полученные данные в единицы системы СИ - ПаС.
Для морфологического исследования и компьютерной кристаллографии пробирка с 0,5 мл РЖ помещалась в холодильник на 8-12 часов. За этот отрезок времени происходило осаждение крупных частиц и формирование осадка. Затем проводили забор надосадочной жидкости в количестве 0,02 мл при помощи полуавтоматического дозатора и наносили каплю на предметное стекло. Капля высушивалась при температуре 20-25oC, относительной влажности 65-70% и минимальной подвижности окружающего воздуха в течение трех часов. По истечении этого времени получали фацию РЖ, которая представляла собой высушенную пленку. Изучение полученных фаций проводили под микроскопом [8].
На качественном уровне морфологическое исследование слюны включало в себя выделение наиболее типичных типов структуропостроения в периферической и центральной зоне фации.
Количественный анализ объектов был осуществлен с помощью аппаратного компьютерного комплекса «Видеотест-Морфо 3,0», включающего исследовательский микроскоп класса Цейс, цифровую камеру, компьютер с пакетом встроенных лицензионных программ изготовителя. Осуществляли цифровую съемку дегидратированной капли препарата (фации) под микроскопом при увеличении 10 и сохраняли файл в JPEG-формате.
Радиальную морфометрию фаций производили с помощью оригинальной программы «Радиана», разработанной одним из авторов [6], с выводом результатов в формат Microsoft Office Excel (Microsoft, США). Раздельно определяли интегральную яркость периферической и центральной зон фации в системе RGB, захватывая в выделенную зону не менее 20% их общей реальной площади.
Для количественного доказательства циркадианной зависимости оцифрованные изображения фаций РЖ были использованы для расчета трех показателей:
- радиальной толщины краевой зоны (R, мкм);
- безразмерного белково-кристаллического коэффициента (БКК), отражающего соотношение площадей краевой и центральной зон;
- коэффициента интенсивности структуропостроения, отражающего сложность взаимопереходов на границе между зонами.
Статистический анализ проводился поэтапно с помощью программного пакета «STATISTICA 6.0». После проверки выборки на нормальность распределения вычислялась средняя арифметическая величина (М) и стандартная ошибка средней арифметической (m). Проверка достоверности различий осуществлялась по критерию Стью-дента (t) [3]. Параметры биоритмов были рассчитаны с помощью компьютерной программы «Cosinor V2.5 for Excel 2000/XP/2003», в которой реализован математический алгоритм на основе косинор-анализа [7].
Результаты и их обсуждение. При определении pH, вязкости РЖ, а также ее кристаллографических характеристик исходили из того, что для этого имеются объективные предпосылки: определенная цикличность приема пищи и ассоциированные с ними изменения деятельности системы пищеварения в целом, суточная динамика гормональной регуляции водно-солевого и других видов обмена, цикличность деятельности центральной нервной системы и организма в целом.
Значение рН ротовой жидкости за период исследования с 8.00 до 20.00 составило в среднем 6,82±0,10. При изучении суточной динамики рН РЖ был обнаружен сдвиг значений в щелочную сторону к 14.00 (7,03±0,06), по сравнению со значением в утренние часы (6,65±0,15). Данные различия статистически достоверны (t=4,8, р<0,05). Также выявлено изменение значений к 20.00 с возвращением значений рН к слабокислой реакции РЖ (6,58±0,11), разница между показателями достоверна (t=3,5, р<0,05). Суточная амплитуда колебаний рН РЖ составила 0,45 (табл. 1).
С 8.00 до 14.00 происходит постепенное уменьшение концентрации Н+ и сдвиг среды РЖ в щелочную сторону, а с 14.00 до 20.00 - наоборот, показатель рН смещается в кислую сторону. С учетом того, что рН является отрицательным десятичным лога-
рифмом концентрации Н+ в жидкости, реальные суточные колебания этих ионов в РЖ составляют более 6 раз.
При моделировании среднесуточной динамики рН РЖ методом Косинор-анализа была получена усредненная синусоида. Ортофаза значений рН приходилась на 14.00 (7,оз±о,о6), парафаза - на 20.00 (6,58±0,11). Построение эллипса рассеяния и его доверительных границ в пределах околосуточного ритма методом Косинор-анализа подтвердила наличие ритмичной периодичности изучаемого показателя (рис. 1).
Исследование вязкости РЖ показало, что её значения составляют в среднем 0,148±0,003 ПаС. Изучение вязкости РЖ за период с 8 до 20 часов показало уменьшение её значений к 14.00 (0,127±0,00б ПаС) по сравнению со значениями в утренние часы (0,154±0,008 ПаС), различия статистически достоверны ^=2,7, р<0,05). К 20.00, по сравнению с 14.00, отмечалось увеличение вязкости РЖ до 0,1бз±0,008 ПаС ^=3,6, р<0,05). Суточная амплитуда колебаний данного показателя составила 0,036 ПаС (табл. 1).
Таблица 1
Циркадианная динамика рН и вязкости ротовой жидкости у обследуемых лиц
Время Значение, М±т Достоверные различия
8 10 12 14 16 18 20
рН ротовой жидкости
8.00 6,68±0,12 - * *
10.00 6,77±0,08 -
12.00 6,8з±0,08 - *
14.00 7,03±0,06 * * - * *
16.00 7,00±0,05 * - *
18.00 6,81±0,06 * * -
20.00 6,58±0,11 * -
Вязкость
8.00 0,154±0,009 - *
10.00 0,149±0,009 - *
12.00 0,142±0,008 - *
14.00 0,127±0,006 * * * - * * *
16.00 0,144±0,005 * -
18.00 0,156±0,007 * * - *
20.00 0,163±0,008 * -
* - достоверные отличия с величинами показателя в соответствующие часы
Построение усредненной синусоиды и эллипса рассеяния средней синусоиды методом Косинор-анализа также доказывало четкую временную структуру вязкости РЖ (рис. 1).
Рис. 1. Циркадианные эллипсы рассеяния рН и вязкости ротовой жидкости
практически здоровых лиц
Для исследования микрокристаллизации РЖ методом высушивания и компьютерной кристаллографии из общей группы было отобрано случайным образом 50 человек: 25 мужчин и 25 женщин. В результате были получены данные, свидетельствующие в пользу четкой циркадианной организации интегральных физико-химических свойств РЖ.
При анализе фации РЖ, полученной в 8.00, обращали внимание на относительно небольшую краевую (белковую) зону, гомогенную или гомогенно-слоистую по строению. Переход к центральной (кристаллической) зоне был четко структурирован, сложно организован, содержал многочисленные взаимопереходы от зоны к зоне. Центр фации был представлен многочисленными крупными мечевидными или папоротникообразными кристаллическими структурами солей с присутствием небольшого числа темных точечных включений (рис. 2).
Рис. 2. Строение фации слюны обследуемого К. в различное время суток. 8.00 А. Тонкая гомогенная краевая зона с хорошо выраженным сложным рисунком перехода к кристаллической зоне. В. Центральная зона содержит мечевидные и папоротникообразные структуры, точечные включения. 14.00. Б. Более широкая краевая зона с размытым плавным переодом к кристаллической. Г. Относительно гомогенная кристаллическая зона с множеством аморфных структур. Окраска нативная, увеличение 10.
К 10.00 краевая зона фации РЖ становилась несколько толще, приобретала отчетливую слоистость, граница с центральной зоной сохраняла четкость и сложную структуру взаимопереходов. На фоне преобладания мечевидных и папоротникообразных структур появлялись единичные мелкие кристаллы простых солей, количество точечных плотных включений несколько возрастало. В 12.00 толщина краевой зоны фа-
ции значительно увеличивалась, одновременно значительно упрощался и размывался рисунок перехода к центральной (кристаллической) зоне. Центр фации имел мозаичную структуру с чередованием небольших участков структур папоротникообразного, мечевидного и аморфного типа. Присутствовало множество мелких темных включений, экцентрично выявлялись скопления аморфных темных плотных участков. При исследовании в 14.00 фация имела макисмально выраженную краевую зону, которая была относительно гомогенной, а переход к центральной зоне был плавным и нечетко структурирован. Центральная зона большей частью была выполнена аморфными кристаллическими структурами и скоплениями темного плотного материала (рис. 2).
В 16.00 изменения, развившиеся за предыдущие 8 часов наблюдения, приобретали обратное развитие: несколько уменьшались размеры и гомогенность краевой зоны, визуализировалась граница между зонами, вновь появлялись папоротникообразные структуры, несколько снижалось количество темных включений. В 18.00 в фации четко выделялась маленькая краевая фация, имевшая ярко выраженное слоистое строение и четкую рельефную границу с центральной зоной. Центр фации был выполнен классическими мечевидными структурами с небольшим количеством папоротникообразных, число темных плотных включений было минимальным. При исследовании в 20.00 фация РЖ практически сохраняла строение, выявленное на предыдущем сроке наблюдения.
Радиальная величина краевой зоны фации РЖ составила в среднем 178,6±3,1 мкм. Прослеживалась четкая циркадианная динамика величины исследуемого показателя: возрастание от 133,7±1,2 мкм в утренние часы до максимума в 14.00 (305,5±4,2 мкм) с последующим снижением с минимумом размеров краевой зоны в 18.00 (103,8±2,1 мкм). Суточная амплитуда колебаний величины показателя составила 201,7 мкм, с максимальными отклонениями в 41,8% от среднесуточного (табл. 2).
Таблица 2
Циркадианная динамика количественных показателей строения фации ротовой жидкости обследуемых лиц
Время Значение, М±т Достоверные различия
8 10 12 14 16 18 20
Радиальная толщина краевой зоны
8.00 133,7±1,2 - * *
10.00 148,5±2,0 - * *
12.00 278,5±3,9 * * - * * *
14.00 305,5±4,2 * * - * * *
16.00 160,2±3,6 * * - * *
18.00 103,8±2,1 * * * * -
20.00 120,5±2,7 * * * -
Белково-кристаллический коэфс шциент
8.00 0,78±0,03 - * *
10.00 0,83±0,05 - * *
12.00 0,89±0,06 * * - * * *
14.00 1,31±0,08 * * - * * *
16.00 0,90±0,05 * - *
18.00 0,58±0,03 * * * * * -
20.00 0,47±0,03 * * * * * -
Интенсивность структуропостроения фации
8.00 14,25±0,45 - * * * * * *
10.00 9,78±0,33 * - * *
12.00 6,74±0,23 * - * *
14.00 2,71±0,17 * * * - * * *
16.00 4,82±0,21 * * * * - * *
18.00 7,29±0,36 * * * * -
20.00 10,80±0,61 * * * * -
При использовании метода Косинор-анализа, удалось провести моделирование среднесуточного ритма размеров краевой зоны фации РЖ. Полученная при этом усредненная синусоида имела четкую циркадианную зависимость с ортофазой в 14.00. Эллипс рассеяния не перекрывал начало системы координат, следовательно, радиаль-
ная толщина краевой зоны фации РЖ имела ритмы, статистически достоверные на принятом доверительном уровне (рис. 3).
Рис. 3. Циркадианная динамика и эллипсы рассеяния основных показателей
строения фации ротовой жидкости практически здоровых лиц
Значение белково-кристаллического коэффициента за период исследования фаций РЖ с 8.00 до 20.00 составило в среднем 0,82±0,08. При изучении суточной динамики белково-кристаллического коэффициента было обнаружено монотонное увеличение значений этого показателя к 14.00 (1,31±0,08), по сравнению со значением при измерении в утренние часы (0,78±0,03). Полученные различия статистически достоверны (1=6,2; р<0,001). После выявленного пика наблюдалось обратная динамика со снижением величины белково-кристаллического коэффициента до значений ниже, чем в утренние часы (в 20.00 - 0,47±0,03). Суточная амплитуда колебаний коэффициента составила 0,84, или по 54,9% в каждую сторону от среднесуточной величины.
Восстановление среднесуточной динамики белково-кристаллического коэффициента и построение эллипса рассеяния и его доверительных границ в пределах околосуточного ритма методом Косинор-анализа подтвердили наличие ритмичной периодичности изучаемого показателя.
Исследование интенсивности структуропостроения фации РЖ показало, что значение этого безразмерного показателя составляло в среднем 8,14±0,31. Интенсивность структуропостроения фации РЖ, как это видно из динамики ее показателя, монотонно уменьшалась более чем в 5,2 раза (с 14,25±0,45 до 2,71±0,17), различия достоверны (1=24,0 и р<0,001). В последующем величина коэффициента интенсивности структуропостроения увеличивалась, но не достигала значений, выявленных в утренние часы (к 20.00 - до 10,80±0,61). Суточная амплитуда колебаний данного показателя составила 11,54, или 76,8%.
При моделировании среднесуточной динамики интенсивности структуропо-строения фации РЖ была получена усредненная синусоида, на которой четко прослеживается наличие ритмических колебаний данного показателя в течение суток. Построение усредненной синусоиды, а также эллипса рассеяния и его доверительных границ в пределах околосуточного ритма методом Косинор-анализа подтвердило наличие ритмичной периодичности изучаемого показателя. Парафаза значений показателя приходилась на 14.00, а ортофаза - на 8.00.
Заключение. Проведенная оценка хронофизиологической организации изучаемых параметров выявила, что большинство из них имеет четкую временную зависимость в пределах циркадианного ритма.
Полученные результаты исследования характеристик РЖ выявили сходность хроноструктур уровня секреции и показателя рН и её вязкости: постепенный сдвиг рН
в щелочную сторону происходил с 8.00 до 14.00, а с 14.00 до 20.00 отмечалось относительное «закисление» среды. При этом наибольшие величины этих показателей отмечены в дневное время в период с 12.00 до 16.00, а наименьшие - в вечерние часы и ночное время. Изменение вязкости ротовой жидкости в течение дня происходило следующим образом: в период с 8.00 до 14.00 отмечается постепенное уменьшение вязкости ротовой жидкости, а затем её увеличение к 20.00.
Аналогичным образом подтверждается околосуточная физико-химических свойств РЖ по количественным показателям компьютерной кристаллографии: радиальной толщине краевой зоны фации, белково-кристаллическому коэффициенту и показателю интенсивности структуропостроения.
Полученные результаты подтверждают и дополняют проведенные нами ранее исследования [5], а знание временной организации РЖ в пределах циркадианного ритма может быть полезно для формирования хронофизиологического подхода к лечению стоматологических пациентов.
1. Агаджанян, Н.А. Хронофизиология, хронофармакология и хронотерапия / Н.А. Агаджа-нян, В.И. Петров, И.В. Радыш, С.И. Краюшкин. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2005. - 336 с.
2. Боровский, Е. В. Биология полости рта / Е. В. Боровский, В. К. Леонтьев. 2-е изд.- М.: Медицинская книга, 2001. - 304 с.
3. Герасимов, А.Н. Медицинская статистика / А. Н. Герасимов. - М.: Изд-во: МИА, 2007. -
480 с.
4. Мартусевич, А.К. Визуаметрия и спектрометрия в кристаллосаливадиагностике / А.К. Мартусевич, А.В. Воробьев, Ю.В. Зимин, Н.Ф. Камакин // Рос. стоматол. журнал. - 2009. -№4. - С. 30-32.
5. Малолеткова, А.А. Биоритмологическая организация диагностически-информативных параметров ротовой жидкости человека / А.А. Малолеткова, В.И. Шемонаев, Т.В. Моторкина // Вестник РУДН, 2009. №4. - С. 128-134.
6. Новочадов, В. В. Радиальная морфометрия: перспективы и способы применения в пато-гистологическом и цитологическом исследовании // Новые технологии в медицине: Труды Вол-ГМУ. - Т. 61, вып. 1. - Волгоград: ВолГМУ. - 2005. - С. 311-313.
7. Святуха, В. А. Обработка биоритмологических данных модифицированным методом Ко-синор-анализа / В. А. Святуха // Биофизика. - 1992. - Т. 37. - № 4. - С. 821-824.
8. Шатохина, С.Н. Морфологическая картина ротовой жидкости - диагностические возможности / С.Н. Шатохина, С.Н. Разумова, В.Н. Шабалин // Стоматология. - 2006. - №4. -С. 14-17.
9. Upgrading the twin variables algorithm for large structures /K. Bethanis [et al.]// Acta Crystal-logr. A. - 2000. - Vol. 56, Pt 2. - P. 105-111.
10. Humphrey, S.P. A review of saliva: norm; 11 composition, flow, and function / S.P. Humphrey, R.T. Williamson // J. Prosthet. Dent. - 2001. - Vol. 85, N 2. - P. 162-169.
11. Kariyawasam, A.P. A circannual rhythm in unstimulated salivary flow rate when the ambient temperature varies by only about 2 degrees / A.P. Kariyawasam, C. Dawes // Arch. Oral Biol. - 2005. -Vol. 50, N10. - P. 919-922.
Литература
CIRCADIAN ORGANIZATION OF PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF ORAL LIQUID OF APPARENTLY HEALTHY PEOPLE
V.I. SHEMONAEV 1, А A MALOLETKOVA 1 D.M. FROLOV 2, V.V. NOVOCHADOV 2 I.P. RYZHOVA 3
The present study is devoted to biorhythmical organization of human oral liquid parameters. A definite temporary structure of oral liquid parameters modification in the range of circadian rhythm was detected.
1) Volgograd State Medical University
2) Volgograd State University
Key words: oral liquid, chronobiology.
3) Belgorod National Research University
e-mail: [email protected]
