CC BY
170
АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 2 (32) 2015. с. 65-73 Биология
УДК 582.232
ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНЫЕ «ЦВЕТЕНИЯ» В ФИНСКОМ ЗАЛИВЕ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ
Людмила Николаевна Волошко Татьяна Владимировна Сафронова
Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
Финский залив Балтийского моря, «цветение» воды, цианобактерии, биологически активные вещества, токсины.
Анализ экстрактов биомассы «цветения» воды в Финском заливе (Ленинградская обл.) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) выявил гепатотоксичные циклические пептиды (микроцистины) и ингибиторы ферментов (цитотоксины). На всех исследованных станциях Невской губы и у штамма M. aeruginosa CALU 1018 выявлена цитотоксическую активность экстракта биомассы (43-78%) по отношению к испытанной линии клеток лимфобластомы мышей (SP2). Высокая активность экстракта биомассы цветений к трипсину была зафиксирована на ст. 16, 19 и 21 (89-99%). Все образцы биомассы проявили специфическую активность по отношению к холинэстеразе, что указывает на возможное присутствие нейротоксичных алкалоидов в заливе.
WATER BLOOMS PRODUCED BY CYANOBACTERIA IN THE FINNISH BAY OF BALTIC SEA
Ludmila N. Voloshko Tatiana V. Safronova"
Komarov Botanical Institute RAS [email protected]
Finnish Bay of the Baltic Sea, water blooms, cyanobacteria, bioactive compounds, toxins
HPLC of the extracts in selected samples from the lake revealed a high diversity of toxins, including hepatotoxic cyclic peptides (microcystins) and inhibitors of enzymes (cytoxins) In all investigated stations of Finnish Bay and M. aeruginosa CALU strain 1018 revealed relatively high cytotoxic activity of the extracts of biomass (43-78%) with respect to the tested mice lymphoblastoma cell line (SP2). High activity of the extracts of biomass blooms trypsin was fixed on the stations 16, 19 and 21 (89-99%). All samples showed a specific activity of the biomass in relation to the cholinesterase, indicating the possible presence of neurotoxic alkaloids in the Finnish Bay.
В последние десятилетия в результате антропогенного загрязнения водоемов Северо-Запада России наблюдаются резкие изменения состава водных биоценозов, в том числе массовое развитие цианобактерий, что обычно сопровождается выделением и накоплением в водной среде биологически активных веществ и токсинов, представляющих опасность для человека и животных (3, 7, 8, 14, 37, 38). Среди токсинов, образуемых цианобактериями, наиболее обычны гепатотоксины, которые являются мощными канцерогенами. Подобные токсические цветения водоемов Северной Европы стали обычными (21, 29, 30, 31, 32). В Англии, Норвегии и Финляндии токсические цветения водоемов рассматривают в качестве национальной проблемы; здесь созданы специальные центры для их изучения и контроля. Резкое увеличение хозяйственной деятельности на акватории Невского эстуария вызывает серьёзные экологические проблемы. Финский залив является мелководным водоемом
65
(средняя глубина — 35 м), антропогенная нагрузка на него очень велика и состоит в сбросе сточных вод пятимиллионного города Санкт-Петербурга.
Эвтрофирование представляется одной из наиболее важных проблем для окружающей среды как в восточной части Финского залива, так и во всём Балтийском море. Только с речным стоком Невы в Балтийское море приносится около 8% биогенных веществ (около 3 тыс. т фосфора и 60 тыс. т азота). В настоящее время из общего количества растворённого фосфора, поступающего в Невскую губу со стоком реки Невы и её рукавов, примерно 60% приходится на «антропогенный» фосфор и около 40% — на «природный» (1). За последние 20 лет, несмотря на предпринимаемые меры по очистке сточных вод, уровень первичной продукции в мелководном районе восточной части Финского залива увеличился в 2-3 раза и достиг уровня эвтрофного водоёма (1). В этом заливе величина первичной продукции в середине лета почти достигает уровня, характерного для гиперэвтрофных вод. Высокая степень эвтрофирования вод Финского залива во второй половине лета проявляется в массовом развитии цианобактерий.
Выполнение работ по проекту базируется на значительном опыте авторов в области культивирования цианобактерий и исследования их роли в биоценозах водоемов (4, 5, 6, 9, 10, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 27, 28, 34, 35).
Цель работы: изучение цианобактерий в Финском заливе Балтийского моря и оценка степени опасности цветения воды в этом регионе
Методы исследований
Отбор проб проводился со станций 16, 19, 21 и 26 (Рис. 1) планктонной сеткой (газ №78) в июле-августе 2006-2007 гг. во время цветения воды. Для сбора биомассы профильтровывался слой воды с глубины 1 м до поверхности. Концентрированную биомассу лиофильно высушивали при -70°С. В зоне цветения в районе станции Лебяжье (ст. 26) выделен штамм Microcystis aeruginosa CALU 1018. Чистую культуру выделяли из проб воды методами предельного разведения и истощающего мазка (33).
Экстракция токсинов. Биомасса цветений экстрагировалась 70% водным раствором метанола (6 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Экстракт центрифугировали при 4000 g в течение 1 мин и затем использовали для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и тестирования биологической активности ферментов.
Мелководный JigöCTpÄWJ« район ^Éw; . j • ■ . . д^ и 16 Нер.г-кая губа Стрельна- " • * • •• • •• ■
Рис. 1. Схема расположения станций в Финском заливе.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. HPLC-анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agil ent 1100 Mass Spectrometer MSD SL-Ion Trap (37, 38) (Рис. 2-3). Циклические пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax XDBC8 (4,6150 мм). Мобильную фазу составляли метанол -вода (линейный градиент от 30% до 100%-ного метанола в течение 30 мин) со скоростью протока 0,6 мл мин-1 при 30°С. Объем анализируемого экстракта составлял 20 мкл. Пики на выходе из колонки регистрировали с помощью двух датчиков: масс-спектрометра типа «ion-trap» и ультрафиолетового полихроматического детектора (PDA). Циклические пептиды выявляли на хроматографе при 230 нм (время удержания 10-25 мин). В ходе тандемной масс-спектрометрии определялись масс-заряды (m/z) ионизированных молекул (MSI). Идентификацию токсинов осуществляли путем сравнения молекулярных масс (масс -зарядов) пиков соединений, по времени соответствующих циклическим пептидам, используя литературные данные. Кроме того, при идентификации циклического пептида учитывалась возможность принадлежности масс-заряда не самой ионизированной молекуле, а ее аддукту — протонированной молекуле [М + Н] , молекулярному иону, связанному с металлами [М + Na]+ или [М + К]+, или иону с утерянными фрагментами [М + Н Н2О]+.
Биологические тесты in vitro
Тест на цитотоксическую активность жизнеспособности клеток (МТТ-тест) является эффективным методом для тестирования жизнеспособности клеток (25, 26, 36, 37). Цитотоксическая активность биомассы цветений проверялась на культивируемой клеточной линии SP2 лимфобластомы мышей в иммунологической камере. Этот колориметрический метод основан на вычислении дегидрогеназной активности (желтая тетразолиевая соль окисляется до синего формазана). Лунки без экстракта использовали в качестве контроля. Материал инкубировался в термостате при 37°С в течение 1 ч. Затем исследуемый экстракт
биомассы (10 мкл) помещали в лунки иммунологической камеры (3*3 мкл). Суспензии клеток мышей (200 мкл) добавляли в лунки с экстрактом или без него, и иммунологическую камеру помещали в термостат на 5 ч. Оценка цитотоксического эффекта (% живых и мертвых клеток) проводилась путем определения оптической плотности в спектрофотометре Sunrise-Tecan при 590-640 нм или по числу погибших клеток (%), определенному с помощью цитофлуориметра. Количество мертвых клеток <20% условно принимали за отсутствие цитотоксического эффекта; 20 -50% за слабый эффект; 50-80% за средний эффект; >80% за высокий эффект.
Анализ токсинов с использованием специфических реакций:
Тест на ингибиторную активность трипсина определяли согласно Кэннел с соавт. (17). Трипсин (Sigma) растворяли в 50 mM Tris-HCl (рН 7,6) до концентрации 150 ед. -мл-1. В качестве субстрата использовали N-бензоил-D,L-аргининe-p-нитроанилид (BARNA; 4,6 мг), растворенный в 100 мкл диметилсульфоксида. 50 мкл раствора трипсина и 10 мкл тестируемого раствора вносили в лунки камеры и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Реакция начиналась с добавления 115 мкл раствора субстрата. Экстинкцию проб определяли с начала и по завершении инкубации при 37°С в течение 30 мин или 60 мин на спектрофотометре Sunrise-Tecan при 410 нм. Экстракт считали активным, если уменьшение экстинкции по сравнению с контролем составляло >50%.
Тест на ингибиторную активность холинэстеразы оценивали колометрическим методом (40). Этот метод был оптимизирован применительно к использованию иммунологических камер и спектрофотометра Sunrise-Tecan. Для каждого теста 125 мкл фосфатного буфера (рН 8.0), 50 ед. мл-1 раствора холинэстеразы, 25 мкл 7,6 мМ 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты и 20 мкл экстракта вносились в лунку иммунологической камеры. Реакция инициировалась добавлением 30 мкл 6,2 мМ ацетилхолин-йодида (АТС1) и завершалась образованием желтой 5 -тио-2-нитробензойной кислоты (TNB). Экстинкцию определяли спектрофотометрически при 412 нм последовательно 10 раз с интервалом 12 с при 30°С. Для каждого экстракта определение проводили в трех повторностях. Ингибирование фермента рассчитывали на графике экстинкция/время в линейной области по отношению к контролю (100% активность, отсутствие ингибирования). Концентрацию ингибитора, снижающую активность фермента на 50%, определяли путем интерполяции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И обсуждение
Видовой состав цианобактерий в Финском заливе и Невской губе. В Балтийском море зарегистрировано свыше 100 видов цианобактерий (21), 16 из которых обладают способностью продуцировать гепато- и нейротоксины (Табл. 1). Цветения азотфиксирующих цианобактерий в Балтийском море происходят ежегодно в конце лета (июль -август) (23, 24). В составе цветений из доминантными видами являются токсигенные Nodularia spumigena и Aphanizomenon flos-aquae (30, 31). По сведениям Lehtimaki (24), этому благоприятствует оптимальное для этих видов низкое отношение растворенных соединений азота к концентрации фосфора в Балтийском море.
В период исследований в августе 2006-2007 гг. преобладали цианобактерии Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs ex Bornet Flahault, Anabaena lemmermannii P. Richter, A. spiroides Klebahn, Microcystis aeruginosa Komarek, M. wesenbergii Komarek Gomphosphaeria lacustris Chodat, Woronichinia naegeliana (Unger) Elenkin и Gloeotrichia echinulata P.G. Richter.
Массовое развитие цианобактерий характерно для многих водоемов Северо-Запада России, токсичные цветения при этом вызывают около 20 видов (2) В 1985-1987 г. в Финском заливе было зарегистрировано 6 токсичных цианобактериальных цветений, в которых доминировали Nodularia spumigena и Aphanizomenon flos-aquae (30, 31). Во всех цветениях в Финском заливе, а также в пробах из зон цветения в Балтийском море,
присутствовал гепатотоксин нодулярин, продуцентом которого является Nodularia spumigena, которая доминирует в цветениях Балтийского моря. В прибрежных водах Финляндии также были отмечены токсичные цветения с преобладанием таких видов, как Nodularia spumigena, Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena lemmermannii, Microcystis aeruginosa и Oscillatoria agardhii.
Разнообразие биологически активных веществ в биомассе цианобактерий из цветений Невской губы
Как правило, цианобактериальное цветение воды сопровождается выделением и накоплением биологически активных веществ и токсинов, представляющих опасность для человека и животных (3, 11, 29, 37, 38, 39). Токсины в соответствии с их активностью разделяются на две группы: биотоксины и цитотоксины. При тестировании биотоксинов обычно используются водные беспозвоночные или небольшие позвоночные животные, такие, как мыши. По химической структуре и направленности действия биотоксины подразделяются на две группы — гепатотоксичные циклические пептиды (гепатотоксины) и нейротоксичные алкалоиды (нейротоксины). Гепатотоксины действуют на гепатоциты и являются канцерогенами. Нейротоксины нарушают функции нервной системы и вызывают смерть мышей в течение нескольких минут из -за паралича дыхательных мышц. Цитотоксины влияют на функции отдельных клеток, в частности ингибируют ферменты, но не убивают многоклеточный организм. Их активность исследуется на клеточных культурах млекопитающих. По химической структуре токсины цианобактерий подразделяются на три основные группы: пептиды (циклические и ациклические), алкалоиды и липополисахариды (11, 32). Механизмы воздействия токсинов цианобактерий разнообразны — от гепатотоксического и нейротоксического эффекта до ингибирования трансляции.
HPLC анализ лиофилизированной биомассы штамма M. aeruginosa, выделенного из Невской губы, показал, что штамм продуцирует высокотоксичные циклические пептиды: микроцистин-LR (ЛК50= 5 мкг-кг-1) и [DMAdda5] микроцистин -LR (ЛК50= 90-100 мкг-кг-1), а также цитотоксины анабенопептин F и микропептин 88-A. Биомасса цветения, отобранная на ст. 16 также содержит гепатотоксин Микроцистин -LR. Различные цитотоксины, ингибиторы разнообразных ферментов, были идентифицированы в биомассе цветений на станциях 19, 21 и 26 (Табл. 1). На ст. 16 цитотоксины не были идентифицированы.
Таблица 1.
Биологически активные вещества, продуцируемые цианобактериями в Невской губе Финского залива
Биологически активные вещества ЛК50 -1 мкг-кг Штамм или биомасса цветений m/z [М+Н]+
Гепатотоксичные циклические пептиды (микроцистины)
[DMAdda5] микроцистин -LR 90-100 Microcystis aeruginosa CALU 1018 981.4
Микроцистин-LR 50 M. aeruginosa CALU 1018 Невская губа, ст. 16 995.4
Цитотоксины
Аеругинозин 298-A TI ThI Невская губа, ст. 21 605.6
Анабенопептин A Ell Невская губа, ст. 21 844.6
Анабенопептин D — M. aeruginosa CALU 1018 828.4
Анабенопептин F PI Невская губа, ст. 21 851.6
Микропептин 88-A ChTI M. aeruginosa CALU 1018 1095.4
Микропептин SF 909 PI Невская губа, ст. 21 909.5
Осцилламид Y - Невская губа, ст. 19 858.5
Осциллапептилид 97-A - Невская губа, ст. 26 1046
Обозначения: [M+H]+ — молекулярная масса аддукта (протонированного пептида), [DMAdda5] — О-деметил-Adda, Adda — (28,38,88,98)-3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил-10-фенилдека-4,6-диеновая кислота, TI — ингибитор трипсина,ТЫ — ингибитор тромбина, ElI — ингибитор эластазы, ChTI — ингибитор химотрипсина, PI — ингибитор протеаз.
Тест на цитотоксическую активность по отношению к клеточной культуре млекопитающих.
Наиболее значительный цитотоксичный эффект наблюдался при испытании биомассы штамма M. aeruginosa с культивируемой клеточной линией SP2 лимфобластомы (78%). Данный эффект объясняется способностью этого штамма продуцировать гепатотоксины — Микроцистин -LR и [DMAdda5] микроцистин-LR (Табл. 2-3).
Таблица 2.
Цитотоксическая активность и активность ферментов после воздействия экстрактов лиофилизированной
биомассы цветений и штамма M. aeruginosa CALU 1018.
Цитотоксическая Ингибирование Ингибирование
активность (смертность %) трипсина(%) ацетилхолинэстеразы (%)
M. aeruginosa CALU 1018 78 - 18
Невская губа, ст. 16 71 89 22
Невская губа, ст. 19 56 97 29
Невская губа, ст. 21 60 99 24
Невская губа, ст. 26 43 13 30
Смертность (%) клеток SP2 после воздействия экстрактов лиофилизированной биомассы цветений (ст. 16), содержащей Микроцистин -LR, была высокой (71%). Образцы биомассы цветений, отобранные со ст. 19 и 21 проявили среднетоксичную активность в отношении клеточной культуры, что можно объяснить отсутствием в экстрактах токсичных биотоксинов-микроцистинов. Так в биомассе ст. 21 присутствовали только цитотоксины: Аеругинозин 298-A (ингибитор трипсина и тромбина), Анабенопептин A и F (ингибиторы эластазы и протеазы), Микропептин SF 909 (ингибитор протеазы). В биомассе ст. 19 отмечен цитотоксин Осцилламид Y (действие не известно), а также восемь неидентифицированных пептидов. Слаботоксичный эффект экстракта биомассы со ст. 26 был выявлен в присутствии цитотоксина Осциллапептилида 97 -A с неизвестным действием. Цитотоксины влияют на функции отдельных клеток, в частности ингибируют ферменты, но не убивают многоклеточный организм.
Тест на ингибиторную активность трипсина
Трипсин — протеолитический фермент, один из основных ферментов пищеварения; катализирует гидролитическое расщепление белков и пептидов. Активность трипсина может подавляться токсинами, синтезируемыми микроорганизмми (12, 13). Биомасса штамма M. aeruginosa и биомасса со ст. 26 не проявили активности в отношении трипсина в присутствии цитотоксинов (Анабенопепин D и неидентифицированный пептид с [M+H]+=601,5 для M. aeruginosa и Осциллапептилид 97-A для ст.26), которые содержались в этих образцах биомассы. При тестировании образцов биомасс со ст. 16, 19 и 21 был получен высокоспецифичный эффект в отношении этого фермента, что для ст. 21 можно объяснить наличием ингибитора трипсина Аеругинозин 298 -A, а для ст. 19 трипсин-ингибирующим действием одного или нескольких из 8 неидентифицированных пептидов.
Тест на ингибиторную активность ацетилхолинэстеразы
Для выявления нейротоксина анатоксина -а и его количественной оценки используется способность токсина ингибировать ацетилхолинэстеразу. Концентрация анатоксина -а(с) учитывается по количеству прореагировавшего с токсином фермента, поскольку данная реакция является необратимой (40). Известно, что массовое развитие нейротоксичных цианобактерий происходит главным образом в Северной Америке, но также они развиваются
в водоемах Европы и Австралии. Нейротоксины нарушают функцию нервной системы и вызывают смерть мышей в течение нескольких минут из -за паралича дыхательных мышц.
Ингибирование ацетилхолинэстеразы нейротоксином считается подтвержденным при степени ингибирования более 20%. Данный эффект обусловлен присутствием в экстрактах нейротоксина анатоксина -а(с), являющегося специфическим инибитором ацетилхолинэстеразы. Для видов рода Microcystis характерно образование только гепатотоксичных токсинов микроцистинов, но не нейротоксинов (32), что и наблюдалось как отсутствие ингибирования экстрактом лиофилизированной биомассы штамма M. aeruginosa. В тоже время для экстрактов биомассы ст. 16, 19, 21 и 26 эффект ингибирования был подтвержден, что говорит о возможном присутствии в этих образцах нейротоксин-продуцирующих цианобактерий (Табл. 2). Анатоксин-а(с) — сильный органофосфатный ингибитор ацетилхолинэстеразы, синтезируемый штаммами Anabaena flos-aque и A. lemmermannii (26). В наших исследованиях эти виды цианобактерий были обнаружены в составе цветений в Невской губе.
Таким образом, проведенный HPLC анализ показал, что в составе биологически активных веществ в Невской губе присутствуют две структурные разновидности наиболее опасных токсинов, циклических пептидов с гепатотоксиной направленностью. Кроме того, были идентифицированы цитотоксины, ингибиторы различных ферментов: аеругинозин 298 -A, анабенопептин A, F и D, микропептин 88-A и SF 909, осциллапептилид 97-A, осцилламид Y. На всех исследованных станциях Невской губы и у штамма M. aeruginosa CALU 1018 выявлена достаточно высокого уровня цитотоксическую активность экстракта биомассы (43 -78%) по отношению к испытанной линии клеток (SP2). Высокая активность экстракта биомассы цветений к трипсину была зафиксирована на ст. 16, 19 и 21 (89-99%). Образцы биомассы Невской губы проявили специфическую активность по отношению к холинэстеразе, что указывает на возможное присутствие нейротоксичных алкалоидов в Невской губе.
Таким образом, анализ экстрактов биомассы «цветения» воды в Финском заливе (Ленинградская обл.) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) выявил гепатотоксичные циклические пептиды (микроцистины) и ингибиторы ферментов (цитотоксины). На всех исследованных станциях Невской губы и у штамма M. aeruginosa CALU 1018 выявлена цитотоксическую активность экстракта по отношению к испытанной линии клеток лимфобластомы мышей (SP2) и к трипсину. Все образцы биомассы проявили специфическую активность по отношению к холинэстеразе, что указывает на возможное присутствие нейротоксичных алкалоидов в заливе.
Литература
1. Алимов А.Ф., Голубков С.М. Изменения в экосистемах восточной части Финского залива // Вестник Российской Академии Наук. — 2008. — Т. 78, №3. — С. 223-234.
2. Белякова Р.Н., Волошко Л.Н., Гаврилова О.В., Гогорев Р.М., Макарова И.В., Околодков Ю.Б., Рундина Л.А. Водоросли, вызывающие «цветение» водоемов Северо-Запада России / Под ред. К.Л. Виноградовой. М.: ТНИ КМК. — 2006. — 367 с.
3. Волошко Л.Н. Токсины и другие биологически активные вещества цианобактерий // Проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения". Экологическая школа в г. Петергофе — Наукограде Российской Федерации: Матер. регион. молод. научн. конф. (28-29 ноября 2007 г.) Санкт-ПетербургСПб, СПбГУ. Изд. «Золотое сечение». — 2007. — С. 19-30.
4. Волошко Л.Н., Драбкова В.Г., Гришкун О.М. Токсические "цветения" воды в Ладожском озере и сопредельных водоемах // 8 ежег. научн. конф. «XXI век: Молодежь, экология, ноосфера и устойчивое развитие». Тез. докл. СПб: СПбГУ. — 2000.— С. 12-13.
5. Волошко Л.Н., Титова Н.Н., Гаврилова О.В., Драбкова В.Г., Капустина Л.Л., Громов Б.В. К изучению биологии токсигенных цианобактерий, изолированных из водоемов региона Ладожского озера // «Автотрофные организмы». Матер. II Межд. конф. М.: МГУ. — 2000.— С. 41-42.
6. Волошко Л.Н., Титова Н.Н., Гаврилова О.В., Бедягина О.М., Громов Б.В. Исследование Oscillatoria agardhii Gom. в культуре // Альгология. — 2002. — Т. 12, №1. — С. 24-33.
7. Волошко Л.Н., Копецкий И., Титова Н.Н., Плющ А.В., Драбкова В.Г., Капустина Л.Л., Пиневич А.В. Разнообразие токсинов, синтезируемых цианобактериями Ладожского озера // «Автотрофные организмы». Матер. III Межд. конф. М.: МГУ (памяти Е.Н. Кондратьевой). М.: МГУ. — 2005. — С. 23.
8. Волошко Л.Н., Морозова А.А., Сафронова Т.В., Дзись-Войнаровская. А.А. Разнообразие токсинов, синтезируемых цианобактериями (синезелеными водорослями) в водоемах Ленинградской области // «Альгологические исследования: современное состояние и перспективы на будущее». Матер. I Всерос. научно-практ. конф УФА: БГУ. (16-18 ноября 2006 г.). — 2006а. — С. 24-26.
9. Волошко Л.Н, Морозова А.А., Сафронова Т.В., Дзись-Войнаровская А.А. Исследование токсических цианобактериальных цветений воды в водоемах Ленинградской области // «Экология Петергофа —Наукограда РФ и сопредельных территорий». Матер. научно-метод. конф. СПб: СПбГУ (29-30 ноября 2006 г.) — 2006б. — С. 13-14.
10. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В., Морозова A.A., Дмитриева Т.С., Титова Н.Н., Плющ А.А. 2007. Разнообразие токсинов и других биологически активных соединений, синтезируемых цианобактериями в водоемах г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области // «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов». Матер. 2 научн. конф. с участием стран СНГ (11-14 сентября 2007 г.). Петрозаводск., Инст. Биол. Карел. НЦ РАН. — 2007. — С. 36-37.
11. Волошко Л.Н., Плющ А.В.,. Титова Н.Н Токсины цианобактерий (Cyanophyta, Cyanobacteria) // Альгология. — 2008. — Т. 18, № 1. С. 3-20.
12. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В. Использование современных научных подходов при оценке разнообразия токсинов в цианобактериальных цветениях воды // Сборник тезисов IX Межд. экол. форума «День Балтийского моря». СПб.: ООО изд. Диалог. — 2008. — С. 226-227.
13. Волошко Л.Н., Пиневич А.В., Копецкий И., Титова Н.Н., Хроузек П., Зелик П. Продуцируемые цианобактериями токсины в период «цветения» воды в Нижнем Суздальском озере (Санкт-Петербург, Россия) // Альгология. — 2010. — Т. 20, №2. — С. 210-233.
14. Волошко Л.Н. Пиневич А.В. Разнообразие токсинов цианобактерий // Астраханский вестник экологического образования. — 2014, № 1 (27). — С. 68-80.
15. Волошко Л.Н., Копецкий И., Хроузек П. Токсичные цианобактериальные «цветения» в Красном озере (Ленинградская обл., Россия) // Астраханский вестник экологического образования. — 2014, № 2 (28). — P. 68-80.
16. Громов Б.В., Мамкаева К.А., Волошко Л.Н. К изучению токсичных "цветений" в озерах северо-запада России / В сб.: Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод. Ярославль: ЯГТУ. — 1996. — С. 22.
17. Cannell R.J.P., Kellam S.J., Owsianka A.M., Walker J.M. Results of a large-scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors // Planta Medica. — 1988. —V. 54. — P. 10-14.
18. Gromov B.V., Vepritskij A.A., Mamkaeva K.A., Voloshko L.N. A survey of toxicity of cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and adjacent water bodies // Hydrobiologia. — 1996. —V. 322. — P. 129-136.
19. Gromov B.V., Voloshko L.N., Mamkaeva K.A. Several cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and adjacent water bodies // In: Proceed. of the Second Intern. Lake Ladoga Symp. Finland: Joensuu. — 1997. — P. 120122.
20. Gromov, B.V., Titova N.N., Voloshko L.N. Toxic cyanobacterial water blooms in Lake Ladoga (North-West Russia) // In: Second Balkan Botanical Congress. (May 14-18, 2000, Istanbul, Turkey). — 2000. — P. 79.
21. Hallfors, G. Checklist of Baltic Sea phytoplankton species (including some heterotrophic protistan groups). Baltic Sea Environment Proceedings. Helcom — 2004. — V. 95. — 210 pp.
22. Hrouzek P., Tomek P., Lukesova A., Urban J., Voloshko L., Pushparaj. B., Stefano V., Lukavsky J., Stys D., Kopecky J. Cytotoxicity and secondary metabolites production in terrestrial Nostoc strains, originating from different climatic/geographic regions and habitats: Is their cytotoxicity environmentally dependent? // Environmental Toxicology. — 2011. — P. 345-358.
23. Kononen, К. Dynamics of the toxic cyanobacterial blooms in the Baltic Sea // Finn. Mar. Res. — 1992. — № 261 — 36 p.
24. Lehtimaki J., Moisander P., Sivonen K., Kononen K. Growth, nitrogen fixation and nodularin production by two Baltic Sea cyanobacteria // Appl. Environ. Microbiol. — 1997. — V. 63, No 5. — P. 1647-1656.
25. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. — 1983. —V. 65 — P. 55-63.
26. Onodera H., Satake M., Oshima Y., Yasumoto T., Carmichael W.W. New saxitoxin analogues from the freshwater filamentous cyanobacterium Lyngbya wollei // Nat. Toxins — 1997. — V. 5. — P. 146-151.
27. Pinevich A.V., Mamkaeva K.A., Titova N.N., Gavrilova O.V., Ermilova E.V., Kvitko K.V., Pljusch A.V., Voloshko L.N., Averina S.G. St. Petersburg culture collection (CALU): four decades of storage and research with microscopic algae, cyanobacteria, and other germs // Nova Hedwigia. 2004. — 79 (1-2). — P. 115-126.
28. Safronova T., Voloshko L.A. A servey of cyanobacterial water blooms in the Lake Krasnoye (Russia) // Abstr. of the Second European Large Lakes Symposium (August 10-14, 2009, Norrtalje, Sweden). — 2009. — P. 5354.
29. Sivonen K. Cyanobacterial toxins and toxin production // Phycologia. — 1996. —V. 35, No 6. — P.
12-24.
30. Sivonen K., Carmichael W.W., Namikoshi M. Isolation and characterization of hepatotoxic microcystin homologs from the filamentous freshwater cyanobacterium Nostoc sp. strain 152 // Appl. Environ. Microbiol. — 1990a. — V. 56. — P. 2650-2657.
31. Sivonen K., Niemela S.I., Niemi R.M., Lepisto, I., Luoma, T.H., Rasanen, L.A. Toxic cyanobacteria (blue-green algae) in Finnish fresh and coastal waters // Hydrobiologia. — 1990b. — 190 (3). — P. 267-275.
32. Sivonen K., Jones G. Cyanobacterial toxins // Toxic cyanobacteria in water a guide to their public health consequences, monitoring and management. London: E. et F.N. Spon. — 1999. — P. 41-111.
33. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G.. Purification and properties of unicellular blue-green algae (Order Chroococcales) // Bacter. Rev. — 1971. — V. 35, No 2. — P. 171-205.
34. Voloshko L.N., Grishkun O., Titova N. Investigation of biology of toxigenic cyanobacteria Oscillatoria agardhii from Neva Bay // In: 3rd Intern. Lake Ladoga Symposium. «Monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes» (August 23-27, 199, Petrosavodsk. Karelia, Russia). — 1999. — P. 59.
35. Voloshko L.N., Titova N.N., Gavrilova O.V. Collection of toxigenic cyanobacteria strains isolated from Lake Ladoga blooms // In: 4th Intern. Lake Ladoga Symposium «Protection and management of Lake Ladoga and other large lakes» (September 2-6, 2002, Russia: Velikiy Novgorod). — 2002. — P. 60.
36. Voloshko L.N., Kopecky J. Titova N.N., Pljusch A.V., Safronova T.V., Morosova A.A., Drabkova V.G., Kapustina L.L., Pinevich A.V. A variety of toxins produced by cyanobacteria in the Lake Ladoga // In: European Large Lakes Symposium 2006 «Ecosystem changes and their ecological and socioeconomic impacts» (11-15 September, 2006, Estonia: Tartu) — 2006. — P. 83-84.
37. Voloshko L., Kopecky J., Safronova T., Pljusch A., Titova N., Hrouzek P., Drabkova V. Bioactive compounds produced by cyanobacteria in Lake Ladoga // Estonian J. of Ecology. — 2008a — No 57/2. — P. 100-110.
38. Voloshko L.N., Plushch A.A., Titova N.N. Toxins of cyanobacteria (Cyanophyta) // Intern. J. on Algae. — 2008b. — V. 10, No 1. — P. 14-33.
39. Voloshko. L.N., Pinevich A.V., Kopecky J., Titova., N.N., Hrouzek P., Zelik P. Water Blooms and Toxins Produced by Cyanobacteria in the Lower Suzdalskoe Lake (Saint-Petersburg, Russia) // Intern. J. on Algae. — 2010. — V. 12, Iss. 2. — P. 129-141.
40. Zelik P., Lukesova A., Voloshko L.N., Stys D., Kopecky J. Screening for acetylcholinesterase inhibitory activity in cyanobacteria of the genus Nostoc // J. of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2009. Iss. 2. P. 531-536.
