Тромболитические свойства ферментов базидиальных грибов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 616.992

ТРОМБОАИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ БАЗИДМААЬНЫХ ГРИБОВ

Денисова Н.П. (вед.научн.сотрудник)*

Ботанический институт им. В. Я. Комарова Российской Академии наук, Санкт-Петербург, Россия

© Денисова Н.П., 2009

Изучены тромболитическая, фибринолитическая, молокосвертывающая и общая протеолитическая активности ферментов из плодовых тел базидиомицетов (около 400 видов), принадлежащих к различным таксономическим и экологическим группам. Установлено, что сапротрофные и симбиотрофные группы базидиомицетов существенно различаются по уровню биосинтеза указанных протеиназ. Наиболее выраженная протеолитическая активность характерна для определённых групп сапротрофных видов, тогда как симбиотрофные макромицеты характеризовались низким уровнем или полным отсутствием протеолитической активности любого типа. Высокие уровни фибринолитической и тромболитической активности преобладают у ксилотрофов, особенно у грибов белой гнили, среди других сапротрофов - у видов, обитающих на субстратах, богатых лигно-целлюлозными комплексами (древесина разной степени деструкции, компостные субстраты и т.п.). Составлен список видов базидиальных грибов, обладающих выраженной тромболитической активностью на фоне низкой общей протеолитической активности, что представляет особый интерес с позиций практической медицины.

Ключевые слова: базидиомицеты, плодовые тела, тромболитическая активность, фибринолитическая активность

THROMBOLYTIC PECULIARITIES OF BASIDIAL FUNGI

Denisova N.P. (Leading researcher)

V. L. Komarov Botanical Institute of Russian Academy of Sciences, Saint Petersburg, Russia

© Denisova N.P., 2009

The thrombolytic, fibrinolytic, milk-clotting and general proteolytic activity of fruiting bodies of about 400 species of basidiomycetes belonging to various taxonomical and ecological groups have been studied. Sufficient distinction between saprotrophic and symbiotrophic groups of the basidiomycetes in the levels of proteinases biosynthesis was established. It was shown that the most pronounced proteolytic activity in combination with wide-range substrate specificity was characteristic for group of saprotrophic mushrooms, whereas the symbiotrophic fungi were characterized with low level or even full absence of the aforesaid types of activity. The most expressed fibrinolytic and thrombolytic activities were marked for lignotrophic saprotrophs and litter saprotrophs associated with lignin-cellulose complexes (rotten wood, compost substrates etc). The list of species of basidiomycetes which synthesize enzymes possessing high thrombolytic activity and low general proteolytic activity is presented.

Key words: basidiomycetes, fibronolytic activity, fruiting bodies, thrombolytic activity

* Контактное лицо: Денисова Нина Павловна Тел.: 8-921-883-15-23

ВВЕДЕНИЕ

Протеолитические ферменты составляют молекулярную основу практически всех жизненно важных функций организмов любого уровня организации. Пептид-гидролазы бактерий, растений и животных изучены достаточно широко и полно, однако в отношении протеолитических систем высших грибов информационная база неоднородна.

В прошлом столетии магистральное направление теоретических исследований грибных пептид-гидролаз касалось, в основном, выяснения их роли в процессе онтогенеза (микро- и макромицетов) и различных механизмов патогенеза, в том числе фитопатогенеза. Прикладные микологические направления были связаны, главным образом, с вопросами интенсификации метаболических процессов у грибов (в основном - микромицетов) с целью получения различных биотехнологических продуктов пищевого и медицинского назначения - кормового/пищевого белка, новых антибиотических соединений, различных БАВ, включая некоторые ферменты.

В связи с дефицитом животного сырья, возникшим в конце прошлого столетия во многих странах, обострился и дефицит протеолитических ферментов. Особенно остро это коснулось группы протеиназ молокосвёртывающего действия. В связи с этим в разных микологических центрах мира широким фронтом были развернуты работы по скринингу и изучению Этих ферментов в различных группах микро- и макромицетов. Приблизительно в те же 70-80 годы XX в. аналогичные работы были начаты и в нашей стране.

В конце XX столетия число прикладных исследований с использованием культур и плодовых тел макромицетов резко возросло, и на рубеже второго и третьего тысячелетий эта группа макромицетов заняла уникальную прикладную нишу, существенно отличающую их от других мицелиальных грибов. Новые знания, накопленные в области физиологии, биохимии, молекулярной биологии базидиомицетов, и многовековой мировой опыт их использования в народной медицине (ставший информационно значительно более доступным), позволили расширить перспективы практического использования высших базидиомицетов в качестве потенциально богатого и, как представляется сегодня, неиссякаемого источника различных биологически активных соединений медико-биологической направленности [1, 2].

Продуценты грибных тромболигических ферментов, как и сами тромболитические препараты, имеющие прямое медицинское назначение, в России первоначально были подробно изучены и охарактеризованы в различных группах микромицетов (Егоров Н.С. с соавт,, 1979, 1988). В качестве примера можно указать на фибринолитический препарат «террилигин», разработанный на основе использования почвенного микромицета Aspergillus terrícola и предложенный к практическому внедрению (Се-

лезнева А.А. с соавт., 1982, 1986). Однако узкий круг тромболитических препаратов микробного происхождения и наличие в них серьёзных побочных эффектов (в первую очередь, в связи с высоким уровнем общего, неспецифического протеолиза) по-прежнему сдерживают их широкое применение в медицинской практике.

Биосинтез пептид-гидролаз фибрино- и тром-болитического действия у Basidiomycetes до конца двадцатого столетия оставался практически terra incognita. Отсутствие достаточно полной информации об уровне фибринолитической и тромболитиче-ской активностей у разных представителей макромицетов и дефицит этих ферментов в медицинской практике определили актуальность такого направления исследований. К сожалению, поиск и изучение новых продуцентов тромболитических ферментов и сегодня продолжают оставаться актуальной проблемой практической медицины во многих странах мира.

Первые целенаправленные исследования фибринолитической (ФА) и тромболитической активностей (ТА) базидиальных макромицетов были начаты в России в лаборатории биохимии грибов Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской Академии Наук. Одними из первых в этом направлении были работы Н.Н. Фалиной по изучению культур Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) P. Karst. [3]. В дальнейшем эти исследования были продолжены на широком микологическом материале, включающем культуры и плодовые тела базидиомицетов из различных таксономических и экологических групп (Денисова Н.П. и др., 1982,1987,1990). В настоящей работе сделана попытка объединить воедино весь исследованный материал в России (СССР — в те годы), и на его основе составить общую картину распределения фибрино-литических и тромболитических ферментов в различных таксономических группах базидиомицетов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом настоящей работы служили свежие плодовые тела макромицетов, относящиеся к различным таксономическим и экологическим группам базидиомицетов.

Природные плодовые тела собирали в течение ряда лет в лесных массивах различных географических районов территории бывшего СССР (от Северо-Запада до Дальнего Востока).

В общей сложности было исследовано около 400 видов плодовых тел макромицетов.

Фибринолитическую и тромболитическую активности базидиомицетов оценивали в белковых комплексах, полученных из экстрактов плодовых тел исследуемых видов [4].

Для получения экстрактов собранные в природе плодовые тела гомогенизировали в забуференном физрастворе, гомогенизат оставляли на 12-14 часов при 3-4 °С, центрифугировали (3,5 тыс. об./мин), белковые комплексы экстрактов осаждали сернокис-

лым аммонием в течение 1 часа при 3-4 °С, Осадок собирали фильтрованием или центрифугированием (в зависимости от вида грибов), растворяли в дистиллированной воде, диализовали вначале против проточной водопроводной воды (контролируя исчезновение анионов S04), затем против дистиллированной воды при 3-4 °С в течение 14 часов, растворы сублимационно высушивали в режиме для ферментных белков. В сухих препаратах определяли содержание белка и уровни ФА и ТА.

Для более полной ферментной характеристики полученных белковых комплексов в них, кроме ФА и ТА, дополнительно оценивали уровень общего неспецифического протеолиза и уровень молокосвёртывающей активности (MCA), которую мы часто наблюдали «сцепленной» с ТА.

Уровень общей протеолитической активности (ПА) определяли по степени гидролиза казеиновых белков стандартным методом [5], уровень молокосвёртывающей активности — стандартным методом [6,7], содержание белка — стандартным методом Лоури.

Фибринолитическую активность оценивали экспресс-методом [8] по площади зон лизиса фибриновых пленок.

Предварительно были отработаны методические приёмы, позволившие получать стабильные при 37 “С фибриновые плёнки с использованием стандартных препаратов фибриногена (без примеси плазминогена) и тромбина производства Каунасского предприятия бакпрепаратов (Литва).

Фибриновые плёнки получали путём полимеризации растворов бычьего фибриногена и тромбина [9]. С Этой целью смешивали буферные растворы

0,3% фибриногена и 1% тромбина, смесь переносили в чашки Петри (диаметр 9 см, ровное дно, строго горизонтальная поверхность). На поверхность образовавшегося полимерного фибрина наносили 0,03 мл исследуемого ферментного раствора (белок 1 мг/мл), в одной чашке ставили 3 параллели, для каждого исследуемого образца использовали 2 чашки. В случае высокой ферментативной активности исследуемый препарат разводили забуференным физраствором. Чашки выдерживали строго горизонтально в термостате при 37 °С в течение 18 час, затем измеряли зоны лизиса фибрина. Фибринолитическую активность выражали в условных единицах на 1 мл исследуемого раствора, удельную ФА — на 1 мг белка. За одну условную единицу принимали зону лизиса фибриновой пластинки в 10 мм2.

Тромболитическую активность оценивали in vitro по времени лизиса экспериментальных тромбов крови человека [10]. Для получения тромбов использовали цитратную донорскую кровь одной и той же группы (НИИ гематологии и переливания крови, Санкт-Петербург), препараты тромбина с исходной активностью 125-250 ед./амп.

Лизис тромбов контролировали в течение 24 часов с интервалом 30 мин — 2 часа (в зависимости от

предполагаемой активности фермента). Тромболи-тическую активность исследуемых образцов оценивали по времени, необходимому для полного растворения тромба. Образец считали неактивным, если по истечении суток не происходило полного растворения тромба.

В плодовых телах с выраженной тромбо- и/или фибринолитической активностью уровень её условно принимали за высокий или средне-высокий; в первом случае зоны лизиса фибриновых плёнок достигали более 900 мм2. За средне-высокий уровень ФА принимали зоны лизиса плёнки в диапазоне 500-900 мм2, зоны лизиса менее 500 мм2 относили к низкому уровню ФА. Высокий уровень тромболи-тической активности означает, что сгусток тромба под влиянием исследуемого образца полностью растворялся в течение 2-8 часов, при средне-высоком уровне — не более 15 часов, при низком уровне - в пределах до 23 часов.

При необходимости таксономического отнесения продуцентов ферментов использовали систему М. Moser [11] с некоторыми модификациями для семейств Pleurotaceae [12], Cortinariaceae и Hygrophoraceae [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты анализа фибринолитической и тром-болитической активностей в плодовых телах бази-диальных макромицетов разных таксономических групп представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 приведены семейства, в составе которых активные виды не были обнаружены или их выявляли лишь эпизодически. В таблицах 2 и 3 представлены семейства, в которых обнаружили значительное количество видов с выраженной тромболитической и фибринолитической активностями.

Таблица 1

Семейства агарикоидных базидиомицетов с редкой

встречаемостью активных видов

Число Активные виды Сопутствующая

видов (изучен./ активи.)

Таксоны ТА ФА активность [ПА1 МСА2]

__________________________am нрп.у____________________

Boletales______________________________________48/3

Strobilomycetaceae 2/0 нет нет

Boletaceae 38/3 нет Boletinus asiaticus*, Leccinum variicolor, Psiloboletinus lariceti Boletus satanas [ПА*]

Paxillaceae 5/0 нет нет Paxillusinvolutus [ПА*, Гем]

Gomphidiaceae 3/0 нет нет

Agamies__________________ 85/5

Pseudohygrocybe

Hygrophoraceae 19/3 нет punicea, Hygrophorus agathosmus, H. chrysodon H. chrysodon [ПА*]

Entolomataceae 14/2 Entoloma abortivum* Clitopilus prunulus* C. prunulus [ПА*], E. abortivum [MCA]

Amanitaceae 20/0 нет нет

Cortinariaceae 32/0 нет нет

Russulales 49/2

Russulaceae 49/2 Lactarius scrobiculatus* Lactarius blumii L. scrobiculatus [MCA*]

ВСЕГО 183/10 2 8

* — высокий уровень указанной ферментативной активности; ПА1 - протеолитическая активность; МСА2 — молокосвёртывающая активность; Гем. — гемолиз

Из таблицы 1 видно, что представители семейств Strobilomycetaceae, Paxillaceae, Gomphydiaceae, Amanitaceae, Cortinariacea характеризовались полным отсутствием ферментов, лизирующих тромбы крови и полимерный фибрин; по экологической принадлежности эти виды относят к одной трофической группе — симбиотрофным макромицетам.

Среди болетовых грибов заметная ФА была обнаружена в плодовых телах симбиотрофных видов Leccinum variicolor Watl. иPsiloboletinus laricety (Sing.) Sing., а в плодовых телах Boletinus asiaticus Sing. отмечен высокий уровень ФА Среди гигрофоровых макромицетов ферментативную активность только в отношении фибрина наблюдали у подстилочного сапротрофа Pseudohygrocybe punicea (Fr.) Kovalenko и у факультативных симбиотрофов Hygrophorus agathosmus (Fr.) Fr. и H. chrysodon (Batsch : Fr.), при этом у последнего вида в параллели с ФА выявили выраженную общую неспецифическую ПА.

Преимущественно симбиотрофные виды (более 60) из семейств Etolomataceae и Russulaceae проявляли высокую ферментативную активность по обоим субстратам. Это относится к видам Entoloma abortivum (Berk, et Curt.) Donk и Lactarius scrobiculatus (Scop.: Fr.) Fr. Высокий уровень ТА у этих видов отмечали в параллели с выраженной МСА и, особенно высокой, у L. scrobiculatus. Наличие в ферментном комплексе облигатного симбиотрофа высокого уровня специфических активностей на фоне низкого неспецифического протеолиза представляется интересным признаком, выделяющим его среди других видов симбиотрофных базидиомицетов.

Таким образом, из 183 видов указанных в таблице 1 семейств, пептид-гидролазы с высокой тромбо-и фибринолитической активностями обнаружили в плодовых телах двух видов, у 8 видов выявили ферментативную активность только по фибрину. Подавляющее большинство исследованных видов этих семейств принадлежало к группе симбиотрофных базидиомицетов.

В таблице 2 представлены семейства порядка Agaricales, в которых наблюдали более частую встречаемость активных видов с высоким и средневысоким уровнем ферментативной активности. Исследованные виды этих семейств относят к разнообразным экологическим группам сапротрофных базидиомицетов (ксилотрофы, подстилочные, почвенные, гумусовые сапротрофы, копротрофы и др.).

Таблица 2

Семейства агарикоидных базидиомицетов с частой встречаемостью активных видов

Число Активные виды Сопутствующая активность (ПА, MCA)

Таксоны видов (изучен./ активи.) ТА ФА

Agonales

Pleurotaceae 11/5 Panus rudis* Pleurotus ostreatus,* P. pulmonarius* Pleurotus cornucopiae, Panus tigrinus Panus tigrinus ПА*, Гем.; Pleurotus ostreatus ПА*, MCA; P. cornucopiae ПА*, MCA

Pluteaceae 3/1 Pluteus atricapillus* Щ P. atricapillus ПА*

Agaricaceae 27/5 Chlorophyllum molybdites* Agaricus silvícola, A. abruptibulbus, A. placomyces*, Macrolepiota mastoidea* Ch. molybdites (Singapore)

Coprinaceae 16/8 Psathyrella candolleana* P. marcescibilis* P. microrhiza*, P. padiceogri-sea* Coprinus disseminatus* Panaeolus sp., P. sphinctrinus, Panaeolina foenisecii

Bolbitiaceae 13/6 Bolbitius vitellinus*, Agrocybe erebia* Conocybe teñera, C. hujsmanii*, Pholiotina arrhenii* Agrocybe sphaleromorpha

ВСЕГО** 70/25 11 14

* высокий уровень указанной ферментативной активности; Гем. - гемолиз; [А] - большой разброс Значений; ** исключая семейство Trkholomataeeae

Семейство Tricholomataceae как самое «многоликое» по таксономической и трофической структуре и как более объёмное по количеству исследованных таксонов включено в самостоятельную таблицу 3.

Как видно из таблицы 2, в семействе Pleurotaceae, включающем практически только ксилотрофные виды базидиомицетов, выраженный биосинтез тром-бо- и фибринолитических ферментов обнаружили в плодовых телах Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., P. pulmonarius (Fr.) Quél., P. cornucopiae (Paul.) Roll., Panus tigrinus (Bull.: Fr.) Sing., при этом наблюдали и высокий уровень общей ПА, а у вида Р. tigrinus, дополнительно, и гемолиз крови. Среди исследованных видов этого семейства плодовые тела Panus rudis Fr. отличались благоприятным, с медицинской точки зрения, сочетанием высокого уровня ФА и ТА и низкого уровня неспецифического протеолиза.

Виды из рода Lentinus — L. edodes (Berk.) Sing. (коммерческие плодовые тела, Япония), L. fulvidus (Bres.) Pilat., L. lepideus (Fr.: Fr.) Fr., L. lepideus f. rufescens A. Petrov не проявили протеолитической активности ни по одному из исследованных белковых субстратов.

Многие образцы плодовых тел видов этого семейства были собраны в разных географических зонах (Армения, Азербайджан, Белоруссия, Япония, Северо-Западный и Сибирский регионы России и

др.). Сравнительным анализом этих образцов показано, что географический район обитания исследованных видов не влиял на уровень их ферментативной активности.

В семействе Pluteaceae. у ксилотрофа Pluteus atricapillus (Secr.) Sing. выявили высокий уровень ТА и ФА, однако при этом наблюдали широкую вариабельность активностей в зависимости от географического района обитания вида.

В семействе Agaricaceae из 27 исследованных видов высокие ФА и ТА обнаружили только у вида Chlorophyllum molybdites (Meyer: Fr.) Mass. (образец из Сингапура), но её сопровождала высокоуровневая ПА. В плодовых телах Agaricus placomyces Peck и Macrolepiota mastoidea (Fr.) Sing, высокую ферментативную активность наблюдали только в отношении фибрина как субстрата.

В семействе Coprinaceae примечателен род Psathyrella (все образцы плодовых тел были из Латвии). Из 8 исследованных видов этого рода Р. marcescibilis (Britz.) Sing., P. microrhiza (Lasch) Sing., P. spadiceo-grisea (Fr.) Maire и Р. candolleana (Fr.) Maire характеризовались высоким уровнем ФА и ТА, и при этом у них полностью отсутствовала MCA, которая часто сопутствует высоким уровням ТА. У Coprinus disseminatus (Pers.: Fr.) S.F.Gray, Panaeolus sphinctrinus (Fr.) Quél., Pspeciosus P.D.Orton и Panaeolina foenisecii (Pers.: Fr.) Maire, от мечали выраженную активность только по фибрину как субстрату.

В семействе Bolbitiaceae активный биосинтез тромболитических ферментов наблюдали у Bolbitius vitellinus (Pers.: Fr.) Fr. и Agrocybe erebia (Fr.) Kühner. У Conocybe teñera (Schaeff.: Fr.) Kühner, C. hujsmanii Knudsen et Watl., Pholiotina arrhenii (Fr.) Sing. и Agrocybe sphaleromorpha (Bull.: Fr.) Fayod отмечали высокую активность только в отношении фибрина.

Таким образом, указанные в таблице 2 семейства сапротрофных базидиомицетов содержали около трети активных видов (25 из 70 исследованных). Отмеченные активные виды в природе обитают в разнообразных эколого-трофических условиях, входя в группы напочвенных, подстилочных, гумусовых, дереворазрушающих грибов.

Как указано выше, семейство Tricholomataceae выделяют среди других, более компактных таксонов агарикоидных грибов, сложной таксономической структурой и широким эколого-трофическим спектром (симбиотрофы, подстилочные и гумусовые са-протрофы, ксилотрофы и т.д.). В настоящей работе исследовали свыше 100 видов из 25 родов этого семейства (в СССР ~ 40 родов).

Таблица 3

Распределение активных видов внутри родов семейства Tricholomataceae

Число Активные виды

Роды видов (изучен./ активи.) ТА ФА

Tricholoma 30/19 T. imbricatum Щ T. populinum [à], Т. album* Ж T. auratum* T. sudum* T. flavovirens* [ПА*], T. portentosum* T. sejunctum* [Д], T. saponaceum* [ПА*], T.scalpturatum [Ai T. myomyces* Щ T. mongolica Т. flavobrunneum* Т. terгейт, Т. vaccinum, Т. pessundatum [Гем., Д], Т. triste* T.columbetta*[ftA*l Т. terreum [Д]

Lepista 9/7 L. gilva* [Гем., Д], L. gl au cocan а* [ГІА*], L. irina* [ПА*], L.personata* [ПА*] L. nebularis*, L.sordida [ПА*], L. nuda [ПА*]

Lyophyllum 4/2 і decastes [ПА*, Д], L. ulmarium*

Clitocybe 11/5 C. maxima*, C. odor a C. candicans* C. gibba, C. sinopica

Marasmius 6/3 M. Vtiynnei* M.siccus* M. oreades [ПА*]

Leucopaxillus 4/3 L. gentianeus* [Гем.], L. tricolor*, L. nauseosodulcis

Collybia 11/2 C. marasmioides* C. acervata*,

Armillaria 2/1 A.mellea*[t\]

Oudemansiella 4/1 0. mucida

Flammulina 1/1 F. velutipes*

Tephrocybe 1/1 T. palustris*

Calocybe 1/1 C. gambosum*

Clitocybula 1/1 С. lacerate*

Myxomphalia 1/1 M. maura*

Rhodotus 1/1 R. palmatus*

Panellus, Laccaria, Mycena, Strobilurus, Меіапоіенеиса, Tricholomopsis, Catathelasma, Xeromphalina 30/0 нет нет

ВСЕГО 117/49 27 22

* высокий уровень ферментативной активности; Гем. -гемолиз; [А] - большой разброс значений

Как видно из таблицы 3, большую часть активных видов (80%) этого семейства составляют таксоны родов Tricholoma, Lepista, Lyophyllum, Clitocybe, Marasmius и Leucopaxillus. Обращает на себя внимание триада Tricholoma-Lepista-Lyophyllum, виды которой во многом имели сходную картину ферментативной активности (высокий уровень ТА часто сочетался с высоким уровнем общей ПА). Пептид-гидролазы с высокой тромболитической активностью обнаружили в плодовых телах 28 видов этой триады. Для некоторых видов родов Tricholoma and Lepista наблюдали широкий разброс значений ферментативной активности (независимо от географической зоны обитания вида). Однако для ви-

дов Tricholoma auratum (Paul.: Fr.) Gill., T. flavovirens (Pers.: Fr.) S. Lundell [syn.Z equestre (L.: Fr.) P. Kumm.], T. portentosum (Fr.) Quél., T. saponaceum (Fr.: Fr.) P. Kumm., T. sudum (Fr.) Quél. были характерны стабильно высокие значения тромболитической активности. Уместно упомянуть, что границы родов этой триады во многом условны, и существует ряд видов, сочетающих признаки в разных комбинациях таким образом, что их родовая принадлежность в различных классификационных схемах варьирует.

Среди облигатных симбиотрофных видов наиболее высокие значения ТА наблюдали у видов рода Tricholoma sect. Tricholoma.

Среди ксилотрофных видов стабильные и высокие уровни тромболитической активности отмечали у видов Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) P. Karst, и Rhodotus palmatus (Bull.: Fr.) Maire. Остальные виды представляли различные группы сапротро-фов, обитающих на различных смешанных древесногумусовых субстратах, которые, как правило, обогащены, органическими, в первую очередь, лигно-целлюлозными компонентами.

Таким образом, в семействе Tricholomataceae из 117 исследованных видов около половины (49) являлись активными. Из них высокий уровень тромбо- и фибринолитических ферментов обнаружили у 27 видов; протеиназы, гидролизующие только фибрин, наблюдали у 22 видов. Из всех исследованных семейств, представленных в таблицах 1-3, это семейство содержало наибольшее количество активных видов - 42%.

В общей сложности ферментативную активность по исследуемым белковым субстратам изучали в плодовых телах более 400 видов базидиомицетов, из них для 370 видов, вошедших в таблицы 1-3, определение ТА и ФА проводили одновременно с оценкой ПА и MCA.

На основе анализа представленного материала (табл. 1-3) сформировали сводный список базидиомицетов, плодовые тела которых содержат ферментные комплексы, лизирующие тромбы крови и фибриновые плёнки. Протеолитические ферменты у видов, представленных ниже, обладали высокой тромболитической и фибринолитической активностями и не обладали высокими уровнями активности по отношению к другим белковым субстратам. Виды, у которых ПА и/или MCA полностью отсутствовали, отмечены в списке дополнительно. Представленные виды базидиомицетов с относительно узкой субстратной специфичностью являются, на наш взгляд, интересными, а в некоторых случаях весьма перспективными объектами для дальнейших медикобиологических исследований.

Виды базидиомицетов, в плодовых телах которых обнаружили выраженный биосинтез ферментов тромболитического действия:

♦ Agrocybe erebia (Fr.) Kühner

♦ Bolbitius vitellinus (Pers.: Fr.) Fr.

♦ Chlorophyllum molybdites (Meyer : Fr.) Mass.

♦ Clitocybe maxima (Wett, : Fr.)Kumm. [отсутств. MCA, ПА]

♦ Clitocybula lacerata (Lasch.) Metrod [отсутств. MCA]

♦ Collybia marasmioides (Britzelm.) Bresinsky et Stangl [отсутств. MCA, ПА]

♦ Entoloma abortivum (Berk, et Curt.) Donk

♦ Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) P. Karst.

♦ Lactarius scrobiculatus (Scop.: Fr.) Fr. [MCA*, отсутств. ПА]

♦ Lyophyllum ulmarium (Bull.: Fr.) Kühner

♦ Marasmius wynnei Berk, et Bres.

♦ Panus rudis Fr. [отсутств. MCA, ПА]

♦ Psathyrella candolleana (Fr.) Maire

♦ P. marcescibilis (Britz.) Singer

♦ P. microrrhiza (Lasch : Fr.) Konrad et Maubl.

♦ P. spadiceo-grisea (Fr.) Maire

♦ Rhodotuspalmatus (Bull.: Fr.) Maire

♦ Tricholoma auratum (Paul.: Fr.) Gill, [отсутств. MCA]

♦ T. sudum (Fr.) Quel. [отсутств. MCA]

Тромболитический эффект нового препарата, полученного из культуры Coprinus sp., подтверждён на модели экспериментального лазер-индуцированного фототромбоза в бедренной артерии крыс [14]. С помощью ультразвуковой допплерографии (Рис. 1) в течение 30 мин. наблюдали полное прекращение кровотока в артерии вследствие индуцированного тромбоза. Через 2 часа после образования тромба в яремную вену был введен указанный тромболитический препарат. Через 24 часа после его введения наблюдали восстановление исходного кровотока, что свидетельствует о тромболизисе.

Г1 ñí |>1ííl+f |ь ^ Lhlisiiu [

Г(Ш 06 I PfHt I ГЦл í

(ЗрЛЧ- |г v.-.

-и^йДЖ ■•9- ".'¡■'ч CMfftO.UH йНКДШЭв Г»С Pt-Ü

ту £ а

y

/»>11 пн 'judllist VU» ft. 1 I-Si IjbpD Ö« ■jensíl.lIH.' И- j«;li n-u.i

9 л ■

[Sw ■

srKi >4* Р.ДО ijw-'C: tíwMJ и-g m-o-

A FTÍT

'JÜ'kHi

'Wi Vri- П.1МЛ 3*1»P M N-fl fil «я

b r’_í* г Я5555fÜÜÜÍÜ!! 7! I1

v-ч г. . Vw4l. W. 11/11« i.,H III ■j«-tl1lll. №- 4, ñ 14-Í

Рис.1. Изменение скорости кровотока в бедренной артерии A. femoralis крысы:

1 - исходный, фоновый кровоток; 4 - прекращение кровотока через 30 мин облучения в результате тромбоза артерии; 5 - восстановление кровотока через сутки после введения в яремную вену тромболитического препарата из Coprinus sp. (публикуется с разрешения авторов)

Тромболитические препараты из культур Flammulina velutipes и Coprinus domesticus ранее были исследованы на собаках в экспериментах ех vivo и in vivo в Центре сердечно-сосудистой хирургии (Москва). Было показано, что иммобилизация этих препаратов на поверхности полимерных хирургических материалов приводила к появлению у них тромборезистентных свойств, что обеспечивало жизнь подопытным животным, в отличие от животных контрольной группы. Таким образом, показана принципиальная возможность использования ферментных препаратов из базидиомицетов для создания нового типа тромборезистентных полимерных материалов.

ВЫВОДЫ

Представленные в работе данные послужили основой для формулирования следующих общих выводов:

1. Биосинтез тромболитических ферментов в плодовых телах исследованных видов зависит, в первую очередь, от эколого-трофических особенностей видов, и только за редким исключением — от их таксономического статуса.

2. Пептид-гидролазы тромболитического действия, в основном, характерны для сапротрофных видов базидиомицетов, особенно — лигногрофной группы, активных биодеструкторов по типу белой гнили, и практически отсутствовали в подавляющем большинстве симбиотрофных видов.

3. Использование в качестве субстратов полимерного фибрина и искусственных тромбов крови помогает оценить не только уровень прямого фибриноли-тического действия, но и уровень активированного типа громболизиса, в результате чего все активные виды можно условно разделить на две большие группы — «тромболитические» и «фибринолитические».:

Выполнение данной работы в течение более 10 лет было возможным благодаря участию коллег лаборатории биохимии грибов БИН РАН, в первую очередь, к.б.н. Н. В. Псурцевой, внесшей основной вклад в экспериментальную оценку ферментативной активности, а также участию коллег из других учреждений, которым я также искренне выражаю свою признательность: проф. H.H. Петрищеву, зав. кафедрой патофизиологии СПбГМУ им. акад. И.1Т Павлова; сотрудникам отдела патофизиологии Федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова; проф. С. П. Новиковой, зав. лаб. химии и технологии материалов в Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМ, Москва; доценту кафедры технологии микробиологического синтеза СПбГТИ, к.т.н. М. М. Шамцяну. Отдельная благодарность старшему научному сотруднику БИН РАН, к.б.н. И. В. Змитровичу за регулярные и интересные консультации по вопросам таксономии и систематики грибов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wasser S.P. Medicinal mushrooms: ancient traditions, contemporary knowledge, and scientific enquiries// J. Med. Mushr.

— 2007. - Vol.9 - P.187-188.

2. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: Current perspectives (review)// Int. J. Med. Mushr. — 1999. - Vol.l — P.31-62.

3. Фалина H.H. Тромболитическая активность в культурах штаммов Flammulina velutipes (Fr.) Karst :// Микол, и Фи-топатол. - 1980. - Т.14. - С.40-42.

4. Фалина H.H., Денисова Н.П., Петрищев H.H., Псурцева Н.В. Метод получения фибринолитического фермента. Авторская заявка на изобр. №907070. - 1980.

5. Государственный стандарт (ГОСТ) 2064.2-74, Получение ферментов. Методы оценки протеолитической активности. — М: Стандарт, 1981 - С.17-25,

6. Kawai М., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. I, S creening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes// Agr. Biol. Chem. — 1970. - Vol.34 - P.159-163.

7. Типограф Д.Я., Петина T.A. Условия культивирования Aspergillus candidus, шт.111 и его ферментативные свойства// Прикл. биохим. и микробиол. - 1966. - Т.4 - С.417-424.

8. Astrup Т., MullertzS. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity// Arch. Biochem. and Biophys. - 1952. -

Yol.40 - P.346-351. 1

9. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов (Методы исследования). Ред. О.П.Низковская. - Ai «Наука», 1979. - 72 с,

10. Имшенецкий A.A., Броцкая С.З. Селекция микроорганизмов, обладающих тромболитической активностью// Микробиология - 1969. - Т.26, №6. - С,1043-1049.

11. Moser М. Die Röhrlinge und Blatterpilze (Polyporales, Boletales, Agaricales, Russulales). — Aufl.4. Jena: G. Fischer, 1978.

— 532 S,

12. Moser M. Die Röhrlinge und Blatterpilze (Agaricales). — Aufl.3. Jena: G. Fischer. — 1967. — 443 S.

13. Коваленко A.E. Определитель грибов СССР. Порядок Hygropltorales. — A.: «Наука», 1989. - 173 с.

14. Петрищев H.H., Васина Е.Ю., Чефу С.Г., Шамцян М.М. Модель экспериментального фототромбоза бедренной артерии крысы// Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2009. - Т.8,№1(29) - С.36-39

Ж Новикова С.П., Денисова Н.П., Ильина М.Б. и др. Метод получения полимерных материалов с тромборезистентными свойствами. Авторская заявка на изобр. №1182709. - 1985.

16. Denisova N.P., Novikova S.P. Enzyme preparations from higher Basidiomycetes mushrooms for making polymer materials with thromboresistant features// Int. J. Med. Mushr. — 2001. - Vol.3 - P.36-40.

Поступила в редакцию журнала 14.10.09 Рецензент: Н. П. Блинов