CC BY
113
международный опыт
Трансплацентарная передача SARS-CoV-2-инфекции
.* **
Виванти А.Ж.1, Вайлуп-Феллус К.2, Прево С.3, Зюпан В.4, Саффи С.5, Ду Као Д.6, Беначчи А.1, Де Лука Д.4' 7_
1 Отделение акушерства и гинекологии, Больница Антуана Беклера, Клиника Университета Париж-Сакле, 92140, Кламар, Франция
2 Отделение вирусологии, Больница Поля Брусса, Клиника Университета Париж-Сакле, 94800, Вильжюиф, Франция
3 Отделение патологии, Госпиталь Бисетр, Клиника Университета Париж-Сакле, Ле Кремлен-Бисетр, Франция
4 Отделение педиатрической и неонатальной реанимации, Больница Антуана Беклера, Клиника Университета Париж-Сакле, 92140, Кламар, Франция
5 Отделение радиологии, Больница Антуана Беклера, Клиника Университета Париж-Сакле, 92140, Кламар, Франция
6 Отделение общей педиатрии, Больница Антуана Беклера, Клиника Университета Париж-Сакле, 92140, Кламар, Франция
7 Отделение патологии и терапевтических инноваций - ^БЕРМ 11999, Клиника Университета Париж-Сакле, 94270, Ле Кремлен-Бисетр, Франция
Вспышка БА1К5-СсМ-2 - первая пандемия века. Инфекция БА1К5-СсМ-2 передается воздушно-капельным путем; другие пути передачи предполагаются, но не были подтверждены. Пока неясно, может ли БАКБ-СсМ-2 передаваться от матери к плоду. Мы представляем клинический случай трансплацентарной передачи БА1К5-СсМ-2 ребенку, рожденному от матери, инфицированной в последнем триместре, с реализацией неврологических нарушений у новорожденного. Передача инфекции была подтверждена комплексными вирусологическими и патологическими исследованиями. БА1К5-СсМ-2 вызвал: 1) материнскую виремию; 2) плацентарную инфекцию, подтвержденную иммуногистохимическим анализом и очень высокой вирусной нагрузкой; воспаление плаценты, доказанное гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями; 3) неонатальную виремию после плацентарной инфекции. Новорожденный был обследован клинически, с помощью методов визуализации и последующего наблюдения. У новорожденного отмечались неврологические проявления, подобные тем, которые описаны у взрослых пациентов.
Transplacental transmission of SARS-CoV-2 infection
Vivanti A. J.1, Vauloup-Fellous C.2, Prevot S.3, Zupan V.4, Suffee C.5, Do Cao J.6, Benachi A.1, De Luca D.4 7
1 Division of Obstetrics and Gynecology, Antoine BécLère Hospital, Paris SacLay University Hospitals, 92140, CLamart, France
2 Division of Virology, Paul Brousse Hospital, Paris SacLay University Hospitals, 94800, ViLLejuif, France
3 Division of Pathology, Bicetre Hospital, Paris SacLay University Hospitals, Le KremLin-Bicêtre, France
4 Division of Pediatrics and NeonataL Critical Care, Antoine BécLère Hospital, Paris SacLay University Hospitals, 92140, CLamart, France
5 Division of RadioLogy, Antoine BécLère HospitaL, Paris SacLay University HospitaLs, 92140, CLamart, France
* © The Author(s), 2020.
** Данная статья находится в открытом доступе в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Common License (http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая позволяет неограниченно использовать, распространять и воспроизводить данные любым способом при условии надлежащей ссылки на оригинальную работу.
6 Division of General Pediatrics, Antoine Béclère Hospital, Paris Saclay University Hospitals, 92140, Clamart, France
7 Physiopathology and Therapeutic Innovation Unit-INSERM U999, Paris Saclay University, 94270, Le Kremlin-Bicêtre, France
SARS-CoV-2 outbreak is the first pandemic of the century. SARS-CoV-2 infection is transmitted through droplets; other transmission routes are hypothesized but not confirmed. So far, it is unclear whether and how SARS-CoV-2 can be transmitted from the mother to the fetus. We demonstrate the transplacental transmission of SARS-CoV-2 in a neonate born to a mother infected in the last trimester and presenting with neurological compromise. The transmission is confirmed by comprehensive virological and pathological investigations. In detail, SARS-CoV-2 causes: (1) maternal viremia, (2) placental infection demonstrated by immunohistochemistry and very high viral load; placental inflammation, as shown by histological examination and immunohistochemistry, and (3) neonatal viremia following placental infection. The neonate is studied clinically, through imaging, and followed up. The neonate presented with neurological manifestations, similar to those described in adult patients.
Vivanti A.J., Vauloup-Fellous C., Prevot S., et al. Transplacental transmission of SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2020; 11 (1): 3572.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17436-6
SARS-CoV-2 вызывает новое инфекционное заболевание, вызванное коронавирусом (COVID-19) и передается в основном воздушно-капельным путем, однако были выдвинуты гипотезы о возможности передачи другими путями. Описано несколько случаев перинатальной передачи, однако пока остается не ясно, как произошла передача вируса: через плаценту, трансцервикальным путем или постнатально. Для оптимизации ведения беременности и предотвращения неонатальных случаев заболевания важно понимание биологии вируса и изучение как самого аспекта передачи вируса плоду, так и иных возможных путей передачи. В данной статье мы представляем подробно изученный случай, демонстрирующий трансплацентарную передачу SARS-CoV-2 с последующим развитием клинической картины заболевания COVID-19 у новорожденного в виде неврологических проявлений.
Результаты
Презентация случая. Первобеременная, 23 года, поступила в Университетскую клинику в марте 2020 г. на сроке беременности 35+2 нед с лихорадкой (38,6 °C), сильным кашлем и обильным отхождением мокроты, возникшим за 2 дня до госпитализации. В крови, мазках из носоглотки и влагалища методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) были обнаружены оба гена (E и S) SARS-CoV-2 (описание методики см. в разделе «Методы» ниже). До заболевания COVID-19 беременность у женщины протекала без осложнений, данные ультразвуковых и других стандартно выполняемых исследований были в норме. При поступлении в больницу у пациентки отмечалась тромбо-цитопения (54х109/л), лимфопения (0,54х109/л), увеличение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (60 с), повышение трансаминаз (АСТ 81 МЕ/л; АЛТ 41 МЕ/л), повышенный уровень С-реактивного белка
(37 мг/л) и ферритина (431 мкг/л). Через 3 дня после поступления, по данным кардиотокографии (КТГ), был зарегистрирован III тип патологической кривой сердцебиения плода (рис. 1), на основании чего пациентке было показано оперативное родоразрешение II категории срочности (дистресс плода, не представляющий немедленной угрозы для жизни), согласно рекомендациям (https:// www.rcog.org.uk/globalassets/documents/guidelines/goo dpractice11classificationofurgency.pdf). Операция кесарева сечения проводилась пациентке при интактных амни-отических оболочках, с использованием средств защиты для изоляции от пациента и под общей анестезией из-за наличия респираторных симптомов у матери. До нарушения целостности оболочек был взят образец прозрачных околоплодных вод для определения наличия генов E и S SARS-CoV-2. Отсроченное пережатие пуповины не проводилось, так как остается неизвестным его влияние на передачу вируса SARS-CoV-2. Женщина оставалась в стационаре под наблюдением и была выписана в удовлетворительном состоянии через 6 дней после родоразрешения.
Новорожденный мальчик (гестационный возраст 35+5 нед) имел массу тела при рождении 2540 г. Оценка по шкале Апгар составила 4 (частота сердечных сокращений = 1, дыхательная активность = 1, цвет кожи = 1, мышечный тонус = 1, остальные пункты = 0), 2 (цвет кожи = 1, мышечный тонус = 1, остальные пункты = 0) и 7 (частота сердечных сокращений = 2, дыхательная активность = 2, цвет кожи = 2, мышечный тонус = 1) на 1-й, 5-й и 10-й минуте соответственно. Реанимационная помощь оказывалась в соответствии с действующими международными рекомендациями (неинвазивная вентиляция с использованием лицевой маски до 5 мин жизни, затем интубация и инвазивная вентиляция с титрованием фракции вдыхаемого кислорода до 0,30; мониторинг, включая ЭКГ, измерение CO2 в конце выдоха, периферическое насыщение крови кислородом и перфузионный индекс). Новорожден-
Рис. 1. Запись сердечного ритма плода (кардиотокограмма, КТГ). Тахикардия, отсутствие вариабельности базальной линии, отсутствие акцелераций с повторяющимися длительными и поздними децелерациями. Эти результаты соответствуют патологической кривой КТГ III типа, который ассоциирован с неблагоприятными исходами в неонатальном периоде. КТГ была записана за 26 мин до кесарева сечения
ный был переведен в отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) в полностью изолированный бокс с вентиляцией с отрицательным давлением. Анализ газов крови пуповинной крови показал нормальные уровни рН и лактата. Новорожденный не получал никаких седа-тивных или обезболивающих препаратов и находился под наблюдением в соответствии со стандартными протоколам и ОРИТН: оценка по шкале Сарнат, данные эхокардиографии и ультразвукового исследования (УЗИ) легких при поступлении в ОРИТН были в пределах нормы. Показатели жизненно важных функций организма оставались нормальным
и в течение периода наблюдения, и через ~6 ч ребенок был экстубирован. Перед экстубацией были взяты капиллярная кровь на анализ газового состава крови (через 1,5 ч жизни) и клинический анализ крови, которые показали нормативные значения. Кроме того, перед экстубацией кровь и аспират из трахеи (взятый без использования бронхоскопии) были исследованы с помощью КТ-РСК, оба оказались положительными на гены Е и 5 БАКБ-^-2. Лаваж проводился по стандартной методике, как подробно описано ниже. Результаты посева крови на бактерии или грибковую флору были отрицательными. Назофарингеальный и ректальный мазки
Таблица 1. Основные лабораторные данные новорожденного
I Данные клинического анализа крови I 1-е сутки жизни I 2-е сутки жизни I 3-е сутки жизни I 5-е сутки жизни 1
Лейкоциты/л 10,32х109 6,97х109
Эритроциты/л 4,54х1012 4,84х1012
Гемоглобин, г/дл 13,9 14,7
Гематокрит, % 41,6 41,4
Тромбоциты/л 339х109 319х109
Лимфоциты/л 4,39х109 3,05х109
Нейтрофилы/л 3,97х109 2,78х109
Ретикулоциты, % 3,04 3,39
Анализы газового состава крови
рН 7,27 7,38 7,34
рСО2, мм рт.ст. 41 41 47
рО2, мм рт.ст. 41 40 30
ВЕ, ммоль/л -7,8 -1,4 -1
Лактат, ммоль/л 7 1,3 1,5
Натрий, ммоль/л 135 141 141
Калий, ммоль/л 6,3 5,2 4,3
Хлор, ммоль/л 109 110 110
Кальций, ммоль/л 1,08 1,33 1,38
Биохимия крови
СРБ, мг/л <5 <5
ПКТ, мкг/л 0,95 0,61
ПКТ пуповинной крови, нг/л 0,19
Общий билирубин сыворотки, мкмоль/л 106
Конъюгированный билирубин, мкмоль/л 0
Щелочная фосфатаза, ед./л 133
АСТ, ед./л 38
АЛТ, ед./л 9
ГГТ, ед./л 290
Тропонин I, нг/л 43
Анализы спинномозговой жидкости
Белок СМЖ, г/л 1,49 1,24
Количество лейкоцитов в СМЖ/мм3 300 11
Глюкоза СМЖ, ммоль/л 2,9 2,4
Примечание. Все образцы взяты путем венозной пункции, за исключением анализов газового состава крови, которые были выполнены из образцов артериализированной капиллярной крови, полученных путем укола в пятку. Все измерения проводились сертифицированными аналитическими микрометодами, используемыми в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных и подвергающимися периодическому контролю качества. Все результаты были в пределах нормы, за исключением белка и уровня лейкоцитов в спинномозговой жидкости на 3-й день жизни; концентрация глюкозы в спинномозговой жидкости (гликорахия) всегда коррелировала с уровнем глюкозы в крови, их уровни определяли одновременно. Расшифровка аббревиатур дана в тексте.
первоначально собирали после гигиенической обработки ребенка в 1-й час жизни, а затем были взяты повторно через 3 и 18 дней постнатального возраста: они были исследованы с помощью КТ-РС1К и все оставались положительными по 2 генам БАКБ-С^-2. Стандартные биохимические параметры крови (включая тропонин, маркеры функции печени и почек) контролировали на 2-й день жизни, их значения были нормальными. Вскармливание ребенка осуществлялось искусственной молочной смесью.
На 3-й день жизни у новорожденного резко появились признаки гипервозбудимости, отмечались нарушение толерантности к энтеральному питанию, осевой гипертонус и опи-стотонус; исследование спинномозговой жидкости (СМЖ) на БАКБ-С^-2, бактерии, грибы, энтеровирусы, вирус простого герпеса 1 и 2 было отрицательным, содержание глюкозы нормальное, однако отмечалось повышение уровня лейкоцитов до 300/мм3 и небольшое повышение уровня белка
(1,49 г/л). Взятый одновременно посев крови бактериального роста не выявил. УЗИ головного мозга и электроэнцефалограмма (ЭЭГ) отклонений не выявили. Клинических симптомов, характерных для наследственных болезней обмена, также не отмечено. Симптомы постепенно регрессировали в течение 3 дней и повторный анализ СМЖ на 5-й день жизни отклонений не выявил, однако сохранялись умеренная гипо-тензия и нарушение усвоения питания. Основные результаты лабораторных анализов приведены в табл. 1. Магнитно-резонансная томография (МРТ) на 11-й день жизни выявила двусторонний глиоз белого вещества в перивентрикулярной и подкорковой области с незначительным преобладанием поражения слева (рис. 2). Новорожденный не получал противовирусные препараты или какое-либо другое специфическое лечение, был выписан из стационара через 18 дней. Последующее наблюдение в возрасте около 2 мес жизни показало дальнейшую положительную динамику невроло-
В Г
/ Ч л
- м* V / J
.У
гического статуса (улучшился тонус, отмечены нормальные показатели моторного развития ) и МРТ-картины (уменьшение степени повреждения белого вещества); параметры роста и данные клинического осмотра были без отклонений.
Вирусология и патология. RT-PCR ткани плаценты был положительным для обоих генов SARS-CoV-2. На рис. 3 показаны все результаты RT-PCR, полученные на разных локусов от матери и новорожденного: вирусная нагрузка в плацентарной ткани было значительно выше, чем в околоплодных водах и в крови матери и новорожденного.
Гистологическое исследование плаценты проводили по методике, описанной в разделе «Методы» (см. ниже); были выявлены диффузное отложение фибрина около ворсин хориона с очагами инфаркта, острый и хронический интервиллузит. При иммуноокрашивании с антителами против N-белка SARS-CoV-2 выявлено интенсивное диффузное повышение интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток трофобласта. При использовании специальных красителей и иммуногистохимических методов других патогенов не выявлено. На рис. 4 и 5 показаны результаты макроскопического и микроскопического исследования плаценты, а также имму-ногистохимии.
Обсуждение
Мы демострируем доказанный случай трансплацентарной передачи SARSCoV-2 ребенку от беременной, заболевшей COVID-19 на поздних сроках беременности. Недавно описанные в литературе клинические случаи с предполагаемой трансплацентарной передачей вируса имеют существенные недостатки. Так, в некоторых случаях не удалось обнаружить SARSCoV-2 у новорожденных или сообщали только о наличии специфических антител; в других случаях вирус обнаружен в образцах у новорожденных, но путь передачи оставался не ясен: плацента, амниотическая жидкость и кровь матери или новорожденного не подвергались систематическому исследованию при каждом случае потенциальной передачи.
Недавно была опубликована классификация, в которой даны определения для идентификации случаев инфекции SARS-CoV-2 у беременных, плодов и новорожденных, и мы придерживались ее критериев, чтобы охарактеризовать случаи потенциальной перинатальной передачи SARS-CoV-2. Согласно этой классификации, врожденная неонатальная инфекция считается доказанной, если вирус обнаружен в амниотической жидкости, собранной до разрыва околоплодных оболочек, или крови, взятой сразу после рождения, поэтому наш случай полностью соответствует врожденной SARS-CoV-2 инфекции, в то время как вышеупомянутые случаи классифицируются только как возможные или даже маловероятные. Другой недавний отчет описывает случай с аналогичными находками в плаценте, но он был определен только как вероятный случай врожденной инфекции SARS-CoV-2, потому что пуповинная кровь и кровь новорожденного не исследовались.
Оба гена E и S SARS-CoV-2 были обнаружены у каждого пациента во всех образцах, поэтому все они были признаны положительными в соответствии с рекомендациями European
Рис. 2. Результаты магнитно-резонансной томографии головного мозга на 11-е сутки жизни
Изображения сделаны на двух разных уровнях и демонстрируют повышение интенсивности перивентрикулярного и подкоркового белого вещества в лобной или теменной области (стрелки).
Centre for Disease Control (https://www.ecdc.europa.eu/en/ all-topics-z/coronavirus/threatsand-outbreaks/covid-19 /lab-support/questions). Стоит отметить, что вирусная нагрузка в плацентарной ткани была намного выше, чем в амниотической жидкости или в материнской крови: это говорит о наличии вируса в клетках плаценты, что согласуется с данными о воспалении при гистологическом исследовании. Наконец, кривые RT-PCR мазков из носоглотки новорожденных на 3-й и 18-й дни жизни были выше, чем в 1-й день (пока ребенок находился в полной изоляции в помещении с отрицательным давлением): это является подтверждением того, что мы наблюдали врожденную инфекцию, а не пост-натальное заражение. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что: 1) произошла материнская виремия, и вирус достиг плаценты, как продемонстрировали результаты иммуногистохимического исследования; 2) вирус вызвал значительную воспалительную реакцию, о чем свидетельствуют высокая вирусная нагрузка, гистологическое исследование и результаты иммуногистохимического исследования; 3) неонатальная виремия возникла после плацентарной инфекции. Наши результаты также согласуются с другим исследованием, в котором описано присутствие вирионов в ткани плаценты, хотя не сообщалось ни о плацентарном воспалении, ни о фетальной/неонатальной инфекции.
В плаценте наблюдались признаки острого и хронического интервиллузита, соответствующие тяжелому системному воспалительному статусу матери, вызванному инфекцией SARS-CoV-2. Так как RT-PCR ткани плаценты был положи-
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Цикл амплификации РНК
Плацента
Назофарингеальный мазок (1\1Ь) Ректальный мазок (1\1Ь) Назофарингеальный мазок (1\1Ь) Назофарингеальный мазок (М) Кровь (М)
Назофарингеальный мазок (1\1Ь) Положительный контроль Околоплодные воды (М) Кровь (1\1Ь)
Мазок из влагалища (М)
В
Образцы матери Вирусная нагрузка, Log Образцы новорожденного Вирусная нагрузка, Log
Назофарингеальный мазок 4,22 Кровь 1,15
Мазок из влагалища 0,63 Назофарингеальный мазок (1-е сутки жизни) 2,21
Плацента 11,15 Ректальный мазок 4,71
Околоплодные воды 2,09 Назофарингеальный мазок (3-и сутки жизни) 7,30
Кровь 4,87 Назофарингеальный мазок (18-е сутки жизни) 4,54
Рис. 3. Результаты полимеразной цепной реакции в реальном времени
Гены E и S SARS-CoV-2 соответственно для материнских и неонатальных образцов (оси X и Y представляют количество амплифици-рованной РНК и количество циклов соответственно; чем раньше обнаружен сигнал, тем меньше количество циклов и выше вирусная нагрузка) (А, Б). Вирусная нагрузка для каждого образца (выраженная в логарифмических копиях/1 млн клеток для плаценты и в логарифмических копиях/в миллилитрах для всех остальных экземпляров) (В). Все образцы матери были получены непосредственно перед родами или во время кесарева сечения; образцы новорожденных представлены в хронологическом порядке, с 1-го по 3-й день жизни, за исключением последнего мазка из носоглотки (полученного на 18-й день постнатального возраста). Линия положительного контроля представлена супернатантом культуры SARS-CoV-2 (см. «Методы»). Вирусная нагрузка в бронхоальвеолярной жидкости не показана. Э01 -дни жизни, М - материнские образцы, НЬ - образцы новорожденного.
А Б В
Рис. 4. Макро- и микроскопическое исследование плаценты
А - макроскопические поражения в виде отложения фибрина около ворсин хориона с инфарктом в виде неровных цепей желто-белого уплотнения (стрелка); Б - микроскопические поражения при интервиллузите, характеризующиеся инфильтрацией межворсинчатых пространств нейтрофилами и гистиоцитами (стрелка) (окраска НЕБ, исх. ув. *400); В - интервиллузит с несколькими 0068+ гистиоцитами (стрелка); нейтрофилы негативны с антимакрофагальными антителами (иммуногистохимический анализ анти-0068, исх. ув. х400).
тельным на SARS-CoV-2, образцы крови матери и новорожденного также положительные, передача вируса явно произошла через плаценту. Интересно, что плаценты от женщин, пораженных SARS-CoV-1, имели аналогичные патологические признаки интервиллузита с выпадением фибрина между ворсин. Известно, что ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) является рецептором для проникновения SARS-CoV-2 в клетку и интенсивно экспрессируется в плацентарной ткани. Данные исследований на животных показывают, что экспрессия ACE2 изменяется в тканях плода/новорожденного с течением времени и достигает пика между концом беременности и первыми днями постна-тальной жизни. Сочетание этих данных и наших результатов подтверждает, что трансплацентарная передача действительно возможна в последние недели беременности, хотя мы не можем исключить возможность передачи и влияние на плод и при более ранних сроках беременности, так как по этой проблеме пока нет определенных литературных данных.
Интересно, что мы описали случай врожденной инфекции, клинически проявляющийся неврологическими нарушениями после неонатальной виремии. До этого в литературе были представлены подозрения на неонатальную инфекцию SARS-CoV-2 с неспецифическими симптомами
или с клинической картиной пневмонии, а неврологические симптомы обычно наблюдались у взрослых пациентов и рассматривались главным образом как следствие системного воспалительного ответа. Ранние неврологические проявления также наблюдались у другого новорожденного, рожденного от SARSCoV-2 положительной матери, хотя вертикальный путь передачи не был полностью исследован. В нашем случае неврологическая симптоматика и воспалительные изменения СМЖ четко последовали за документированной виремией. Другие вирусные или бактериальные инфекции и все прочие неонатальные заболевания, потенциально способные вызвать подобные клинические симптомы, были исключены. Нейровизуализация продемонстрировала повреждение белого вещества мозга, которое может быть вызвано воспалением сосудов вследствие инфекции SARS-CoV-2. Аналогичные данные МРТ были получены и у взрослых пациентов.
В заключение нами продемонстрировано, что трансплацентарная передача инфекции SARS-CoV-2 возможна в последние недели беременности. Трансплацентарная передача может вызвать воспаление плаценты и неонаталь-ную виремию с последующим развитием у новорожденного неврологической симптоматики, вероятно, вследствие церебрального васкулита.
А ' ^ ' '' ' " В
Рис. 5. Иммуноокрашивание плаценты на Ы-белок 8АР8-СоУ-2 (иммуногистохимия анти-Ы, исх. ув. х800): а - интенсивная коричневая цитоплазматическая позитивность трофобластных клеток около ворсин в плаценте в нашем случае (стрелки); Б, В -2 отрицательных контроля (первичное антитело, 2 8АР8-СоУ-2 отрицательные плаценты)
Методы
Забор образцов у пациентов. Биологические образцы для тестирования с помощью RT-PCR были получены и подготовлены следующим образом. Назофарингеальные и вагинальные мазки были получены в соответствии с рекомендациями US Center for Disease Control and Prevention (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/inpatient-obstetric-healthcare-guidance.html; https://www.cdc.gov/group-bstrep/downloads/gbs_swab_sheet21.pdf). Образец плацен тарной ткани брали со стороны хориона и измельчали в 400 мл воды без РНКазы и ДНКазы; 1 мл крови и мазки помещали в Virocult® viral транспортные средства (Sigma, Сент-Луис, Мичиган, США). Небронхоскопический бронхоальвеоляр-ный лаваж (БАЛ) выполнялся по хорошо известной стандартизированной методике: новорожденного помещали на спину с головой, повернутой вправо так, чтобы аспират был преимущественно взят из левого легкого. Физиологический раствор (1 мл/кг, 37 °C) вводили в эндотра-хеальную трубку через Y-образный переходник. После 3 циклов искусственной вентиляции легких аспирацион-ный катетер осторожно вводили на 0,5 см за кончик трубки, и жидкость из бронхов аспирировали в стерильную ловушку для образцов (BALF Trap; Vigon, Ecouen, Франция) с отрицательным давлением 50 мм рт.ст. Эту процедуру повторяли при повернутой влево голове, так что аспират был получен преимущественно из правого легкого. Эта процедура соответствует рекомендациям Экуан Respiratory Society advices for pediatric and neonatal BAL. Во время процедуры пациента не отключали от аппарата искусственной вентиляции легких, фракция вдыхаемого кислорода составляла 0,25, десатурации и брадикардии не было. Все образцы хранили при +4 °C и исследовали в течение 24 ч.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Вирусная РНК была выделена из 200 мкл клинических образцов с NucliSENS® easyMag® (BioMerieux, Craponne, Франция) и элюирована в 100 мкл. Набор RealStar® SARS-CoV-2 RT-PCR 1.0 (Altona Diagnostics GmbH, Гамбург, Германия), нацеленный на ген E (специфичный для линии B-бета-коронавирус) и ген S (специфичный для SARS-CoV-2), использовали в соответствии с рекомендациями производителя (https://altona-diagnostics.com/en/products/reagents-140/reagents/realstar-real-time-pcr-reagents/realstar-sars-cov-2-rt-pcrkitruo.html). Анализ включает систему гете-рологичной амплификации (внутренний положительный контроль) для выявления возможного ингибирования RT-PCR и подтверждения целостности реагентов набора. Положительный контроль - культура SARS-CoV-2 - супер-натант, предоставленный производителем набора. Тер-моциклирование проводили при 55 °C в течение 20 мин для обратной транскрипции, затем 95 °C в течение 2 мин и 45 циклов при 95 °C в течение 15 с, 55 °C в течение 45 с, 72 °C в течение 15 с с Applied Biosystems ViiA7 instrument (Applied Biosystems, Thermo Fisher, Уолтем, США). Пороговое значение цикла <40 интерпретируется как положительное для РНК SARS-CoV-2. Наша методика привела к чрезвычайно низкому пределу обнаружения [LOD = 1200 имп/мл (12 имп/прием)]. Воспроизводимость
и согласованность между анализами были 100% для отрицательных и положительных тестов против 2 других распространенных методов анализа.
Исследование плаценты. Забор проб плаценты, макро-и микроскопическое исследования были выполнены в соответствии с положениями Амстердамского консенсуса. Плаценту фиксировали в 4% забуференном формалине, а образцы заливали в парафин. Окрашивание выполняли на срезах толщиной 3-5 мкм с помощью следующих методов: гема-лун-эозин-шафран, периодические кислотные пятна Шиффа и метод Гомори-Грокотта. Иммуногистохимическое исследование для обнаружения пероксидазой и контрастированием гемалун проводили на приборе Leica Bond III automat using the Bond Polymer Refine Detection kit (Leica DS9800) после предварительной термической обработки при pH 6 или 9 в зависимости от протестированных моноклональ-ных антител: CD68 (Dako PG-M1, 1:200), CD163 (Leica 10D6, 1:200), CD20 (Dako L26, 1:400), CD3 (Dako F7.2.38, 1:50), CD5 (Novocastra 4C7, 1:50), CMV (Dako CCH2 + DDG9, 1:1), Parvo virus (AbcVs, Abc10-P038), SARS-CoV-2 (Abclonal, rabbit pAB, 2019- nCoV N Protein, 1:2400). Отрицательные контроли для иммуногистохимии SARS-CoV-2 были сделаны следующим образом: контроль поликлональных первичных антител кролика, отрицательный образец плаценты на SARS-CoV-2 с аналогичными преаналитическими условиями и фиксацией в формалине.
Этические аспекты. От женщин было получено письменное информированное согласие для публикации данного отчета. Согласно французскому законодательству, одобрение совета института (IRB) не требуется для отчетов о случаях, при условии, что письменное согласие от пациентов получено. The French Ethical Committee for the Research in Obstetrics and Gynecology проверили работу и подтвердили, что одобрение IRB не было нужно. Исследование было выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и рекомендациями CARE.
Отчетность. Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в «Nature Research Reporting Summary».
Доступность данных. Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в данную опубликованную статью.
Вклад авторов. А. Виванти и К. Вайлуп-Феллус оказывали помощь матерям и провели весь комплекс вирусологических исследований, провели поиск литературы, подготовили рисунки, интерпретировали данные и написали черновик рукописи. С. Прево провел патологическое обследование, подготовил рисунки и интерпретировал данные. В. Зюпан и С. Саффи выполнили и интерпретировали нейровизуали-зационные методы обследования. Д. Ду Као помогал лечить новорожденных и интерпретировал всю клиническую картину и лабораторные тесты. А. Беначчи помогал в поиске литературы, сборе и интерпретации данных, а также в лечении женщин. Д. Де Лука написал черновик рукописи, лечил новорожденных, придумал данный проект и объединил все данные. Все авторы критически рассмотрели рукопись на предмет важности интеллектуального содержания и одобрили ее в окончательной версии.
АВТОР ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Де Лука Даниэль (Daniele De Luca) - отделение педиатрической и неонатальной реанимации, Больница Антуана Беклера, Кламар; отделение патологии и терапевтических инноваций, Университет Париж-Сакле, Ле-Кремлен-Бисетр, Франция E-mail: dm.deluca@icloud.com
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Zeng H., et al. Antibodies in infants born to mothers with COVID-19 pneumonia. JAMA. 2020; 323: 1848-9.
2. Dong L., et al. Possible vertical transmission of SARS-CoV-2 from an infected mother to her newborn. JAMA. 2020; 323: 1846-8.
3. Zeng L., et al. Neonatal early-onset infection with SARS-CoV-2 in 33 neonates born to mothers with COVID-19 in Wuhan, China. JAMA Pediatr. 2020. DOI: https://doi.org/10.1001/jamapediatrics.2020.0878
4. Zhu H., et al. Clinical analysis of 10 neonates born to mothers with 2019-nCoV pneumonia. Transl Pediatr. 2020; 9: 51-60.
5. Yu N., et al. Clinical features and obstetric and neonatal outcomes of pregnant patients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective, single-centre, descriptive study. Lancet Infect Dis. 2020; 20: 559-64.
6. Alzamora, M.C., et al. Severe COVID-19 during Pregnancy and possible vertical transmission. Am J Perinatol. 2020. DOI: https://doi. org/10.1055/s-0040-1710050
7. American College of Obstetricians and Gynecologists. Practice bulletin no.106: intrapartum fetal heart rate monitoring: nomenclature, interpretation, and general management principles. Obstet Gynecol. 2009; 114: 192-202.
8. Perlman J.M., et al. Part 7: neonatal resuscitation: 2015 International Consensus on Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care Science With Treatment Recommendations (Reprint). Pediatrics. 2015; 136: 120-66.
9. Singh Y., et al. International evidence-based guidelines on point of care ultrasound (POCUS) for critically ill neonates and children issued by the POCUS Working Group of the European Society of Paediatric and Neonatal Intensive Care (ESPNIC). Crit Care 2020; 24: 65.
10. De Luca D., et al. Role of distinct phospholipases A2 and their modulators in meconium aspiration syndrome in human neonates. Intensiv Care Med. 2011; 37: 1158-65.
11. Zamaniyan M., et al. Preterm delivery in pregnant woman with critical COVID-19 pneumonia and vertical transmission. Prenat Diag. 2020. DOI: https://doi.org/10.1002/pd.5713.
12. Lorenz N., et al. Neonatal early-onset infection with SARS-CoV-2 in a newborn presenting with encephalitic symptoms. Pediat Infect Dis J. 2020. DOI: https://doi.org/10.1097/INF.0000000000002735
13. Shah P.S., Diambomba Y., Acharya G., Morris S.K., Bitnun A. Classification system and case definition for SARS-CoV-2 infection in pregnant women, fetuses, and neonates. Acta Obstet Gynecol Scand. 2020; 99: 565-8.
14. Kirtsman M., et al. Probable congenital SARS-CoV-2 infection in a neonate born to a woman with active SARS-CoV-2 infection. CMAJ. 2020. DOI: https://doi.org/10.1503/cmaj.200821
15. Algarroba G.N., et al. Visualization of SARS-CoV-2 virus invading the human placenta using electron microscopy. Am. J Obstet Gynecol. 2020. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajog.2020.05.023
16. Ng W.F., et al. The placentas of patients with severe acute respiratory syndrome: a pathophysiological evaluation. Pathology. 2006; 38: 210-8.
17. Li M., Chen L., Zhang J., Xiong C., Li X. The SARS-CoV-2 receptor ACE2 expression of maternal-fetal interface and fetal organs by single-cell transcriptome study. PLoS ONE. 2020; 15: e0230295.
18. Mao L., et al. Neurologic manifestations of hospitalized patients with coronavirus disease 2019 in Wuhan, China. JAMA Neurol. 2020; 77: 1-9.
19. Needham E.J., Chou S.H.-Y., Coles A.J., Menon, D.K. Neurological implications of COVID-19 infections. Neurocrit Care. 2020; 32: 667-71.
20. Poyiadji N., et al. COVID-19-associated acute hemorrhagic necrotizing encephalopathy: CT and MRI features. Radiology. 2020; 201187. DOI: https://doi.org/10.1148/radiol.2020201187.
21. Moriguchi T., et al. A first case of meningitis/encephalitis associated with SARS-Coronavirus-2. Int J Infect Dis. 2020; 94: 55-8.
22. De Blic J., et al. Bronchoalveolar lavage in children. ERS Task Force on bronchoalveolar lavage in children. European Respiratory Society. Eur Resp J. 2000; 15: 217-31.
23. Uhteg, K., et al. Comparing the analytical performance of three SARS-CoV-2 molecular diagnostic assays. J Clin Virol. 2020; 127: 104384.
24. Khong T.Y., et al. Sampling and definitions of placental lesions: Amsterdam Placental Workshop Group Consensus Statement. Arch Pathol Lab Med. 2016; 140: 698-713.
25. Riley D.S., et al. CARE guidelines for case reports: explanation and elaboration document. J Clin Epidemiol. 2017; 89, 218-35.
