CC BY
15
я
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА МОДЕЛИ ЯЗВЕННОГО КОЛИТА*
Князев О. В.1, Хомерики С. Г1, Трубицына И. Е.1, Коноплянников А. Г.2
1 ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения Москвы»
2 Медицинский радиологический научный центр имени А.Ф. Цыба Министерства здравоохранения Российской Федерации
TRANSPLANTATION OF MESENCHYMAL STROMAL CELLS OF BONE MARROW ON THE MODEL OF ULCERATIVE COLITIS
Knyazev O. V.1, Khomeriki S. G.1, Trubitsyna I. E.1, Konoplyannikov A. G.2
1 Moscow Clinical Scientific Center
2 Medical Radiological Research Center name by A.F. Tsyb
Резюме
Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) используется для стимуляции репара-тивных процессов в самых различных органах и тканях. Цель нашей работы заключалась в оценке репаративного потенциала МСК костного мозга при остром и хроническом повреждении кишечника у крыс линии Вистар, индуцированном натрий декстран-сульфатом (ДС). Эксперимент по изучению репаративного потенциала и безопасности трансплантации МСК костного мозга при остром и хроническом поражении кишечника, индуцированном натрий ДС был проведен на крысах линии Вистар. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в данном эксперименте продемонстрировала улучшение гистологической картины слизистой оболочки кишки. Опыт продемонстрировал перспективность данного метода в области медицинского использования клеток стволового типа, направленного на повышение эффективности терапии хронических воспалительных заболеваний кишечника.
Ключевые слова: воспалительные заболевания кишечника, мезенхимальные стромальные клетки, экспериментальный колит
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2017; 144 (8): 62-66
Summary
Transplantation of allogenic mesenchymal stromal cells (MSCs) is used for the stimulation of reparative processes in various organs and tissues. The aim of our work was to assess the reparative potential of MSCs to bone marrow in acute and chronic damage to the intestines of Wistar rats induced by sodium dextran-sulfate (DS). An experiment to study the reparative capacity and safety of transplantation of MSCs bone marrow in acute and chronic intestinal damage induced by sodium DS was carried out on Wistar rats. Transplantation of mesenchymal stromal cells in this experiment showed improvement of the histological picture of the intestinal mucosa. Experience has demonstrated the feasibility of this method in the field of medical use of stem cells the type that is aimed at increasing the effectiveness of therapy of chronic inflammatory bowel diseases
Key words: mesenchymal stromal cells, reparative processes, inflammatory bowel diseases, model of colitis Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2017; 144 (8): 62-66
Князев Олег Владимирович
Knyazev Oleg V. oleg7@bk.ru
* Иллюстрации к статье - на цветной вклейке
в журнал.
трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.
| transplantation of mesenchymal stromal cells of bone marrow.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относят язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), по уровню заболеваемости значительно уступают другим заболеваниям органов пищеварения, но по тяжести течения, частоте осложнений и летальности они во всем мире занимают одно из ведущих положений в структуре болезней желудочно-кишечного тракта. Результаты проведенных больших контролируемых исследований свидетельствуют о постоянном росте заболеваемости этой патологией в мире. Согласно последним данным распространенность ЯК в Северной Америке составляет 249 на 100 тысяч населения, БК - 319 на 100 тысяч, распространенность ЯК в Европе составляет 505 на 100 тысяч населения, БК - 322 на 100 тысяч; заболеваемость ЯК в Северной Америке составляет 19,2 на 100 тысяч населения, БК - 20,2 на 100 тысяч, заболеваемость ЯК в Европе составляет 24,3 на 100 тысяч населения, БК - 12,7 на 100 тысяч. В США и странах Западной Европы отмечаются более высокие темпы заболеваемости ЯК и БК, чем в других странах мира. Ежегодно в США регистрируется более 1 миллиона новых случаев ВЗК, причем 50 % случаев приходится на ЯК и 50 % - на БК. Обе формы ВЗК повышают риск развития рака толстой кишки, и обе патологии значительно увеличивают общую заболеваемость и смертность. Дебютируя в раннем возрасте, ЯК и БК сохраняют свою активность на протяжении длительного времени, приводя к инвалидизации.
Изучение патогенетических механизмов ВЗК позволило обосновать диагностическое и прогностическое значение иммунологических, иммуно-гистохимических, генетических методов исследования. Эти комплексные исследования позволили рекомендовать применение новых классов лекарственных препаратов - селективных иммуноде-прессантов, имеющих локальное патогенетическое действие на механизмы развития воспалительной реакции [1].
Достижения в терапии ВЗК, разработка и внедрение генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП), открыли новый этап в лечении больных ВЗК, индуцируя быстрый ответ и удлинение клинической ремиссии после отмены стероидов. Благодаря этим препаратам врачи смогли получить полное и стойкое заживление слизистой оболочки кишки во всех сегментах, профилактику осложнений и возможность избежать оперативных вмешательств, снижение частоты и продолжительности госпитализаций, улучшение качества жизни пациентов. Среди селективных иммуносупрессоров, зарегистрированных в РФ к настоящему времени (2017 г.) для лечения больных ВЗК, в арсенале врача-гастроэнтеролога имеется 5 ГИБП - инфликси-маб, адалимумаб, цертолизубама пэгол, голимумаб и ведолизумаб. Но, несмотря на очевидные достижения в терапии ВЗК, проблема фармакотерапии остается до конца не решенной, около 30 % больных ВЗК нуждаются в проведении альтернативной биологической терапии, примерно 20-40 % пациентам требуется хирургическое вмешательство, хотя и после этого наблюдаются рецидивы.
Благодаря внедрению в медицинскую практику достижений фундаментальных исследований
в области молекулярной и клеточной биологии, стало возможным разработка новых способов лечения с использованием стволовых клеток, которое получило название «регенеративная медицина» [2].
Сведения о биологии мезенхимальных стромальных клеток (МСК), открытых А.Я. Фридин-штейном в 1968 году, значительно расширилось за последнее десятилетие. Известно, что они продуцируют определенные цитокины и ростовые факторы. Список цитокинов включает в себя такие факторы, как интерлейкины (ИЛ) -6, -7, -8, -11, -12, -14, колониестимулирующие факторы (грану-лоцитарный, макрофагальный), LIF, лиганд Flt-3 и SCF. МСК также тесно связаны с эндотелиаль-ными клетками и остеобластами, обладают широкой пластичностью. Многолетние исследования показали, что эти клетки обладают способностью дифференцироваться в костную, хрящевую и соединительную ткани, костномозговые элементы, миобласты, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, нервные клетки, эпителиальные клетки легких.
В последние годы, МСК применяются для лечения хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний (включая ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника и др.). Исследования проводятся на доклиническом и клиническом уровнях [3-7].
Известно, что МСК обладают иммуномодулирую-щим действием. Накопленные в литературе данные позволяют предположить следующий механизм: через активацию индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO) через разнообразные внеклеточные растворимые факторы. В данной схеме активации важным звеном является метаболизм триптофана. Происходит индукция иммунологической толерантность и усиление активности регуляторных Т- клеток (T-reg) [8-10]. IDO активируется через провоспалительные медиаторы и цитокины, главным образом интерферон -g (IFN-g). IFN-g действует на клетки жировой ткани, которые экспрессируют IDO, концентрация триптофана снижается, одновременно происходит накопление кинуренина. В результате подобной модуляции метаболизма триптофана снижается пролиферация лимфоцитов [8-10]. Кроме имму-номодулирующей способности, дополнительным преимуществом клинического применения МСК является то, что стволовые клетки обладают низкой иммуногенностью. Это связано с тем, что в не-стимулированных МСК экспрессия HLA 1 класса очень низкая, а HLA 2 класса и классические ко-стимулирующие молекулы CD 40, CD 80 и CD 86 не обнаруживаются. Было показано, что стимуляция IFN-g повышает HLA I и II класса, не влияя на экспрессию CD 40, CD 80 и CD 86. Таким образом, было выдвинуто предположение, что эти свойства могут позволять МСК избегать иммуннологического алло-генного распознавания, однако, в настоящее время это является предметом для дискуссии [11].
Последние десятилетие во многих лабораториях мира проводятся попытки использования трансплантаций МСК и их частично дифференцированного потомства для терапии поврежденных участков различных органов и тканей в опытах на лабораторных животных с использованием экспериментальных моделей. Объектами исследования становятся
различные заболевания - кардиомиодистрофии, инфаркта миокарда, нейро-дегенеративных заболеваний, диабета, пневмофиброза, цирроза печени, почечной недостаточности, травм костей, заболеваний опорно-двигательного аппарата, повреждений поджелудочной железы. Перспективным является направление, когда трансплантация МСК осуществляется с введенными в клетки генами, что может послужить основой для нового и успешного направления в генотерапии различных заболеваний, включая и злокачественные новообразования.
Таким образом, экспериментальное изучение возможности использования трансплантаций ал-логенных МСК и их частично дифференцированного потомства для стимуляции репаративных процессов в самых различных органах и тканях стало актуальной задачей современной биологии и медицины.
Цель нашей работы оценить репаративный потенциал МСК костного мозга при остром и хроническом воспалении кишечника, индуцированном натрий декстран-сульфатом (ДС) у крыс.
Материалы и методы
Опыты проводились на взрослых половозрелых крысах линии Вистар, самцах, в возрасте в начале опыта 2.5 месяца, массой 120-140 г. На каждую
Модель поражения кишечника
Для получения острой формы поражения кишечника у крыс, животным вместо воды давали 10 % водный раствор ДС в течение недели. Для получения хронической
Дизайн исследования
Сформировано 5 групп по 12 животных в группе:
1. интактные животные;
2. животные с острым поражением слизистой оболочки;
3. животные с хроническим поражением;
Получение аутогенных МСК
Под нембуталовым наркозом в стерильных условиях у крыс брали клеточный материал. После получения исходного пунктата костного мозга и отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре, отбирали супернатант. Выделенные клетки отмывали в среде 199 («Sigma», USA), центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин. Извлекали осадок, конечный материал 107 клеток помещали в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл). В качестве начальной ростовой среды служила среда RPMI-1640 (фирма "Sigma", USA), содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ (фирма "Sigma", USA), 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (фирма "Sigma", USA). Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля ("Sigma", USA) c площадью дна 25 см2, в которые вносили 5х106-107 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. В случае необходимости определить эффективность клон образования (ЭКО) посеянных клеток во флаконы вносились меньшие количества
Тестирование эффекта
Для оценки эффекта использовались данные о выживаемости в течение 2-х месяцев после введения МСК, динамике массы тела и кишечника, гистологической картины слизистой оболочки
Проведение опыта
Формирование групп, затравка ДС, введение МСК, наблюдение, забой и фиксация материала, анализ хемилюминесценции ПМ 0проводил-ся в Медицинский радиологический научный центр им. А. Ф. Цыба - филиал федерального
временную точку для проведения определенных тестов бралось по 6-8 животных.
формы поражения кишечника крысы получали 10 % водный раствор ДС в течение недели, затем следовал перерыв 2 недели и процедура еще дважды повторялась.
4. животные с острым поражением и введением МСК;
5. животные с хроническим поражением и введением МСК.
клеток, чтобы иметь возможность подсчитать число выросших колоний. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5 % углекислого газа и 95 % воздуха, и помещали их в обычный термостат при 37оС. При достижении сливного (конфлюентно-го) монослоя, клетки пересевали с использованием 0,25 % раствора трипсина ("Sigma", USA) в новые флаконы в начале с той же площадью дна (25 см2), а впоследствии при нарастании клеточной массы -в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2 ("Sigma", USA). Образцы культивируемых клеток проходили проверку на флуоресцентном клеточный сепараторе (FACSAria, Becton-Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) для определения экспрессии антигенов мезенхимальных стволовых клеток с использованием анти- CD 29, CD 90, CD 45 and CD 11bFACSAria, Becton-Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA). МСК вводили в/в в количестве 2х106 клеток в 0,5 мл физиологического раствора однократно после завершения приема ДС.
толстой кишки, динамике хемилюминесцентной активности перитонеальных макрофагов у крыс. Аутопсию проводили через 1 и 2 недели после введения МСК.
государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации; морфологический анализ данных - в ГБУЗ «Московский клинический
трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.
I transplantation of mesenchymal stromal cells of bone marrow.
научно-практический центр Департамента здравоохранения Москвы». Все крысы эксперимента имели сквозную нумерацию в соответствии с последовательностью забоя.
При выполнении эксперимента мы руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также руководством учреждения по содержанию и использованию лабораторных животных.
Результаты и обсуждение
Наиболее выраженные изменения при острой затравке ДС наблюдались в слизистой оболочке подвздошной кишки: отмечалось резкое уменьшение высоты кишечных ворсин, в ряде случаев кишечные ворсины вовсе отсутствовали, глубина крипт резко увеличивалась, наблюдалось увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление лимфо-плазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки (рис. 1 на цветной вклейке). В толстой кишке наблюдались картины выраженной дистрофии и де-сквамации клеток поверхностного эпителия и нарушение архитектоники крипт. У отдельных животных наблюдалась дилатация сосудов подслизистого слоя, клетки эпителия крипт находились в состоянии выраженной дистрофии и некробиоза. В просвете крипт встречались скопления лейкоцитов (рис. 2).
Введение МСК в серии с острой затравкой существенно улучшало гистологическую картину слизистой подвздошной кишки: высота кишечных ворсин хотя и была в ряде случаев снижена, однако в целом соответствовала их состоянию в контрольной группе. В слизистой оболочке толстой кишки, нормализовалась архитектоника крипт. Тем не менее, изменения клеток эпителия были заметны: отсутствовала щеточная кайма энтероцитов, сохранялась лимфоцитар-ная инфильтрация собственной пластинки (Рис. 3).
В серии опыта с хронической затравкой декстран-сульфатом, по сравнению с острой, через 2 месяца после введения МСК гистологическая картина значительно улучшилась. Практически восстанавливалась нормальная структура кишечных ворсин и крипт в подвздошной кишке. Высокие ворсины были выстланы хорошо дифференцированными клетками с чётко выраженной щёточной каймой. В базальных отделах крипт встречались панетовские клетки. (Рис. 4).
Введение МСК резко активизировало проли-феративные процессы в слизистой оболочке толстой кишки за счёт гиперплазии клеток эпителия крипт. Наблюдалось усиление образования мелких и крупных лимфатических фолликулов как в слизистой оболочке, так и в подслизистом слое. Увеличивалось количество бокаловидных клеток как в эпителии крипт, так и среди клеток поверхностного эпителия. (Рис. 5 а, б, в, г).
Хотя точные механизмы иммуннорегуляторного действия аутологичных и аллогенных МСК и, как следствие, стимуляция процессов регенерации, до конца не известны, большинство исследований показывают, что они осуществляются с помощью растворимых факторов. К этим факторам относят: TGF-p1, фактор роста гепатоцитов (HGF), простагландин Е2 (PGE 2) и индоламин 2,3-диоксигеназу. МСК КМ также экспрессируют высокий уровень фактора стромальных клеток-1 (SDF-1). К настоящему времени установлено, что МСК в условиях in vitro и in vivo
могут выделять в окружающую среду следующие биологически активные продукты: сосудистый эн-дотелиальный ростовой фактор (VEGF, возможно, что вариант VEGF-D); гепатоцитарный ростовой фактор (HGF); адреномедулин; инсулиноподобный ростовой фактора 1 (IGF-1); трансформирующий фактор роста ß3 (TGF-ß3); плацентарный ростовой фактор (PGF); тромбоцитарный ростовой фактор-A (PGF-A); ростовой фактор соединительной ткани; молекула-1 адгезии нейральных клеток; колоние-стимулирующий фактор 1 для предшественников В-клеток (PBEF1); гепарин-связывающий EGF-подоб-ный ростовой фактор (HB-EGF); матричная метал-лопротеиназа-9 (MMP-9) и, по-видимому, есть еще ряд других, еще не идентифицированных агентов [12]. Данные биологически активные соединения обладают ангиогенным, антиапоптотическим, анти-оксидантным и митогенным эффектом, что позволяет активировать репаративные процессы на самых различных уровнях, в том числе, и на уровне, так называемых, резидентных стволовых клеток, к которым относятся недавно обнаруженные стволовые клетки сердца. Еще меньше известно о механизмах реализации репаративного эффекта у МСК. Имеющиеся немногочисленные публикации в основном только констатируют наличие репаративного эффекта без анализа вопроса о механизмах его реализации. Как уже было отмечено ранее, для МСК характерны высокие дифференцировочные потенции как в условиях in vitro, так и в системах in vivo.
Таким образом, в эксперименте было продемонстрировано, что МСК обладают способностью усиливать пролиферативную активность и ускорять дифференцировку клеток кишечного эпителия, а следовательно характеризуются большим репа-ративным потенциалом. Введение МСК приводило к полному восстановлению и уменьшению воспаления слизистой оболочки толстой кишки - происходит активизация пролиферативных процессов: гиперплазия эпителия толстой кишки и усиленное образование мелких и крупных фолликулов в слизистой оболочке и в подслизистом слое, увеличение количества бокаловидных клеток в эпителии, увеличение высоты и числа кишечных ворсин в слизистой оболочке подвздошной кишки, по сравнению с контрольной группой животных. Наиболее выраженные пролиферативные процессы отмечаются в серии опыта с хронической затравкой через 2 месяца после введения МСК.
Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в данном эксперименте продемонстрировала перспективность данного метода в области медицинского использования клеток стволового типа, направленного на повышение эффективности терапии хронических воспалительных заболеваний кишечника.
Литература
1. Peyrin-BirouletL, Deltenre P, de Suray N, Branche J, Sandborn WJ, Colombel JF. Efficacy and safety of tumor necrosis factor antagonists in Crohn's disease: meta-analysis of placebo-controlled trials. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6: 523-644.
2. Timothy J., Nelson, M.D., Ph.D., Atta Behfar, M.D., Ph.D., and Andre Terzic, M.D., Ph.D. Strategies for Therapeutic Repair: The "R 3" Regenerative Medicine Paradigm. Clin Transl Sci. 2008 September 10; 1(2): 168-171.
3. Князев О. В., Парфенов А. И., Щербаков П. Л., Хомери-ки С. Г., Ручкина И. Н., Конопляников А. Г. Эффективность и безопасность мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных с рефрактерными формами болезни Крона. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Том VIII, № 1, 2013, стр. 76-84.
4. Ciccocioppo R, Bernardo ME, Sgarella A, et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in the treatment of fistulising Crohn's disease. Gut. 2011;60:788-798.
5. Doorn J, Moll G, Le Blanc K, et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells: paracrine effects and potential improvements. Tissue Eng Part B Rev. 201218:101-115.
6. Duijvestein M, Vos AC, Roelofs H, et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment for refractory luminal Crohn's disease: results of a phase I study.Gut. 2010;59:1662-1669.
7. Singer NG, Caplan AI. Mesenchymal stem cells: mechanisms of inflammation. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2011;6:457-478.
8. DelaRosa O, Lombardo E, Beraza A, et al. Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells. Tissue Eng Part A. 2009;15:2795-2806.
9. Maccario R, Podest'a M, Moretta A, et al. Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD 4 + T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype. Haematologica. 2005;90:516-525.
10. Meisel R, Zibert A, Laryea M, et al. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation. Blood. 2004;103:4619-4621.
11. Griffin MD, Ryan AE, Alagesan S, et al. Anti-donor immune responses elicited by allogeneic mesenchymal stem cells: what have we learned so far? Immunol Cell Biol. 2013; 91:40-51.
12. Ceron W, Lozada-Requena I, Ventocilla K, Jara S, Pinto M, Cabello M, Aguilar JL. Mesenchymal stem cells: definitions, culture and potential applications. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2016 Oct-Dec;33(4):758-771. doi: 10.17843/rpmesp.2016.334.2563.
К статье
Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на модели язвенного колита (стр. 62-66)
Рисунок. 1.
Уменьшение высоты кишечных ворсин,увеличение глубины крипт. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 250.
Рисунок 2.
Дилатация сосудов под-слизистого слоя, клетки эпителия в состоянии выраженной дистрофии и некробиоза. В просвете крипт скопления лейкоцитов Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 250.
Рисунок 3.
Восстановление нормальной структуры слизистой оболочки толстой кишки, но сохраняется лимфоцитарная инфильтрация собственной пластинки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 500.
Рисунок 4.
Восстановление высоты кишечных ворсин через 2 месяца после введения МСК. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 250.
Рисунок 5 а, б, в, г.
Активизация пролифератив-ных процессов: гиперплазия эпителия толстой кишки и увеличение количества бокаловидных клеток в эпителии.
Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 120.
