CC BY
132
е
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ И ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ АУТОЛОГИЧНЫХ И АЛЛОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
Лазебник Л. Б., Сагынбаева В. Э.
ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова»
IMMUNOLOGIC AND ONCOLOGICAL SAFETY OF AUTOLOGOUS AND ALLOGENIC MESENCHYMAL BONE MARROW STROMAL CELLS
Lazebnik L. B., Sagunbaeva V. E.
State Budget Educational Institution of Higher Professional Education (SBEIHPE) «A. I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry Ministry of Healthcare of Russia»
Лазебник Леонид Борисович д.м.н., Профессор ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова», кафедра терапии, гериатрии и профилактики
Сагынбаева Венера Эссенбаевна д.м.н, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова», кафедра терапии, гериатрии и профилактики
Lazebnik Leonid, Head of Department Internal medicine, geriatrics and prevention at the A. I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry
Sagunbaeva Venera, senior lecturer at the Department of Internal medicine, geriatrics and prevention at the A. I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry
Лазебник Леонид Борисович Lazebnik Leonid B. E-mail:
Резюме
Несомненно, что золотым стандартом клеточной терапии является аутологичная трансплантация мезенхи-мальных стромальных клеток (МСК), тем не менее, представляет интерес и изучение возможностей аллоген-ной трансплантации МСК, в связи с их особой ролью в лимфопоэзе, в частности, в положительной селекции Т-лимфоцитов
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 107 (7):67-71
Summary
It is indubitable that autologous transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) is the golden standard for cell therapy. But also it is still in interest to explore the possibilities of allogeneic MSCs transplantation, because of their special role in lymphopoiesis, particularly in the positive selection of T-lymphocytes
Keywords: transplantation, mesenchymal stromal cells, allogeneic stromal cells, T-lymphocytes, lymphopoiesis. Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 107 (7):67-71
Аутологичные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга
Впервые клиническое применение МСК, полученных путем экспансии ex vivo, было продемонстрировано в пилотном исследовании 15 добровольцев и показало безопасность экспансии ex vivo и последующего внутривенного (в/в) введения аутоло-гичных МСК [2]. В исследовании были включены больные со злокачественными гематологическими заболеваниями, которые на момент сбора и культивировании МСК находились в стадии ремиссии, и которым не проводилась полихимиотерапия. Не отмечено никакой токсичности при в/в введении аутологичных МСК в дозе от 1х106 до 50х106.
В I—II фазе клинических испытаний были оценены безопасность, выполнимость и гематопоэти-ческие эффекты после в/в введения аутологичных МСК у больных раком молочной железы, перенесших высокодозную химиотерапию с введением гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [3]. Относительно маленькие объемы костного мозга (25мл) получали при пункции гребня подвздошной кости. При в/в введении аутологичных МСК больным в дозе от 1х106 до 2,2х106 никаких побочных эффектов не зафиксировано. У 13 из 21 больного культивированные аутологичных МСК были обнаружены в крови в течение 60 мин. после введения, что указывало на выживаемость МСК и короткое персистирование в кровяном русле. Восстановление гемопоэза у этих больных было быстрым (нейтрофилы >500 на 8 день, тромбоциты >20 000 на 8,5 дня). Но из-за того, что всем больным вводились CD34+-клетки периферической крови, роль аутологичных МСК в восстановлении гемопоэза точно подтверждена не было.
Впоследствии для оценки роли аутологичных МСК в восстановлении гемопоэза были предприняты рандомизированные исследования. Выделили 2 группы больных: те, кому после проведения высокодозной химиотерапии вводились аутологичных МСК в дозе 2х106/кг, и те, кому МСК не вводились. Предварительные данные показали, что аутологичные МСК ускоряют гематологическое приживление [3].
Начато клиническое исследование эффективности трансплантации аутологичных CD133+ клеток костного мозга для стимуляции регенерации печени при её обширных резекциях у онкологических больных и продемонстрировало техническую
выполнимость и безопасность процедуры аутоло-гичной трансплантации [4]. Успех высокодозной иммуносупрессивной терапии с трансплантацией аутологичных МСК при системной красной волчанке [5], рассеянном склерозе [6], ревматоидном артрите [7,8], апластической анемии, аутоиммунной тромбоцитопении [9] и ряде других аутоиммунных заболеваний [10] привел к тому, что в ведущих медицинских центрах Европы и США в конце 90-х годов были начаты исследования эффективности этого метода у больных ЯК и БК [11].
Наиболее впечатляющий исход был у больного, страдавшего болезнью Крона с 9-летнего возраста и непрерывно нуждавшемся в терапии на протяжении 7 лет. После аутологичной трансплантации костного мозга по поводу неходжкинской лимфомы у него не было клинических и лабораторных признаков активности БК все последующие годы [12].
Недавно были опубликованы результаты второго открытого исследования по применению аутологичных МСК у больных рефрактерной формой БК [13]. В этом исследовании больным трансплантировали аутологичные МСК, полученные после трех пассажей. У четырех больных индекс Беста снизился с 334 до 226 через шесть недель после введения МСК. Эндоскопическая ремиссия была достигнута у больных колитом, но не с поражением подвздошной кишки. Никаких неблагоприятных побочных эффектов не отмечено.
В 90-х годах начаты исследования эффективности трансплантации аутологичных МСК у больных с БК и ЯК (США). С 2008 г трансплантация МСК рассматривается как потенциально новое стратегическое направление в терапии ВЗК (рекомендации ECCO — the European Crohn's and Colitis Organization 2011, 2012г).
Следовательно, МСК могут рассматриваться как кандидаты не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточной терапии, что может быть более предпочтительно именно при аутоиммунных заболеваниях, так как МСК собственного организма не всегда способны купировать иммунопатологический процесс.
В дальнейшем с учетом иммунологической инертности МСК предприняты попытки к использованию для введения больным аллогенных донорских МСК.
Аллогенные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга
В Ирландском Раковом Центре (Ireland Cancer Center) были начаты исследования по введению больным с лимфомами аллогенными МСК, полученных от донора. В некоторых центрах Европы и США изучали введение аллогенных МСК больным с онкологическими и генетическими заболеваниями при проведении аллогенной трансплантации костного мозга или введении периферических стволовых клеток. Предварительные данные свидетельствуют о положительном эффекте от введения МСК по сравнению с контрольной группой. Исследования в этой области продолжаются [14].
Показано, что при аутоиммунных заболеваниях аллогенная трансплантация МСК чаще, чем аутоло-гичная заканчивается долгосрочной ремиссией [15]. Это связано со способностью трансплантируемого материала к нормальному воссозданию иммунной системы или способностью иммунной системы, произведенной донорскими клетками, развивать реакцию трансплантата против аутоиммунных клеток. Последнее предположение подтверждается развитием ремиссии болезни Крона у пациента, которому проведена аллогенная, а не аутологичная трансплантация МСК [16]. За последующее десятилетие существенный терапевтический эффект был
зарегистрирован при проведении именно алло-генной трансплантации МСК для лечения многих резистентных форм воспалительных заболеваний, также не отмечено развитие концерогенеза.
В США в группе из 5 больных болезнью Крона, получивших лечение аллогенной трансплантацией по поводу лейкоза, у 3 достигнута ремиссия различной продолжительности вплоть до 10 лет [17]. В Германии из 11 больных ВЗК (7 больных болезнью Крона и 4 с ЯК), которым была проведена аллоген-ная трансплантация, вышли в ремиссию 10 человек [18]. В обоих исследованиях, после трансплантации аллогенных МСК никаких образования опухолей не вывялено.
Известно, что аллогенные мехенхимальные стромальные клетки (МСК) не обладают иммуно-генными свойствами in vitro: они не индуцируют пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов и не являются мишенями для действия NK-кле-ток, в связи отсутствием антигена гистосовме-стимости II класса (HLA — II) и низким уровнем экспрессии антигена гистосовместимости I класса (HLA — I) [19]. Так как, комплекс HLA — II главная антигенная система, определяющая выживаемость неродственного трансплантата. Антитела к антигенам HLA I и II класса могут появляться в организме после трансплантации аллогенных гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ГСК) или аллогенных МСК, полученных от неродственных доноров. Это, в свою очередь, может привести к формированию антител, неприживлению или отторжению перелитых МСК, особенно если они водились неоднократно. При появлении антител к антигенам HLA I и II класса после системной трансплантации аллогенных ГСК происходит разрушение клеток, в связи с развитием «реакции трансплантат против трансплантата» и увеличивается риск осложнений. [20,21,22]. Так как, аллогенные МСК не экспрессируют антигены HLA II класса на своих мембранах, таких осложнений не развиваются.
В последние время аллогенные МСК широко используется в трансплантологии при онкогемато-логических заболеваниях для подавления «реакции трансплантат против хозяина» после пересадки гемопоэтических стволовых клеток [23].
Проведено исследование, оценивающее безопасность метода клеточной терапии [24]. Данные, указывающие на безопасность местной трансплантации МСК, полученные авторами, очень важны, поскольку в эксперименте было показано, что клетки костного мозга, мигрирующие в очаг хронического воспаления желудочно-кишечного тракта, могут стать причиной возникновения аде-нокарциномы. Катамнестические данные и морфологические исследования биоптатов отрицают образования опухолей у больных через год после проведения процедуры. Слияние клеток костного мозга (ККМ) с клетками кишечного эпителия не инициирует развитие опухоли. По-видимому, ККМ при этом не становятся стволовыми клетками опухоли, а интегрируются с уже развитой опухолью. Это предположение отличается от теории, выдвинутой группой Houghton в модели рака желудка и предполагающей функционирование слившихся клеток как стволовых клеток опухоли [25].
Что касается возможности спонтанной трансформации МСК (онкогенность) in vitro, то этот феномен отмечается только при длительном их культивировании (более 2-х месяцев) в 50 % образцов [26]. Длительное культивирование in vitro может закончиться спонтанной трансформацией МСК, в результате чего они приобретут онкоген-ный потенциал, которые в дальнейшем могут дать начло опухолевым клеткам [27, 28]. Таким образом, длительное культивирование МСК нецелесообразно, так как оно ассоциировано с высоким риском концерогенеза. Поэтому все культуры МСК, предназначенные для клинического применения, необходимо кариотипировать на предмет исключения хромосомных мутаций. Однако тщательнее изучение этого процесса показало, что спонтанная трансформация для МСК, получаемых из клеток костного мозга взрослого пациента, по частоте ниже, а по срокам наступления позднее, чем у стандартных диплоидных культур клеток человека.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) практически никогда не отторгаются после трансплантации и не вызывают так называемый «реакции трансплантат против хозяина», так как они не экс-прессируют молекулы HLA I и II класса. Однако, трансплантации ЭМК может спровоцировать рост доброкачественных и злокачественных новообразований [29]. Следует, отметить, что не удалось получить роста опухолей при трансплантации МСК в различные ткани иммунодефицитных мышей, что в единичном случае наблюдаются и при трансплантации МСК, полученных при культивировании костного мозга взрослых больных.
С 2008г по 2010г нами в отделении патологии кишечника ЦНИИГ 59 больным проводилась трансплантация аллогенных МСК. Полученные данные показали, что использование аллогенных МСК, выращенных из костного мозга человека-донора у больных ВЗК за 2 года наблюдения не приводило к развитию опухолевого процесса кишечника, что подтверждалось регулярными эндоскопическими исследованиями с проведением множественных биопсий слизистой оболочки кишечника и нормальным уровнем онкомаркеров: СА 19-9, СА 242 и раковой эмбриональный антиген (РЭА) [30].
С 2009 по 2011 гг. там же нами было обследовано 25 больных с ВЗК после трансплантации аллогенных МСК для изучения эффективности и безопасности, полученных от HLA-несовме-стимых доноров). IgG антител к антигенам HLA- I и II класса в сыворотке крови определяли имму-ноферментным методом. Среди 25 больных ВЗК после системной трансплантации аллогенных МСК через 6,12 мес и 2года в образцах крови ни в одном случае не были выявлены IgG антитела к антигенам HLA I-II класса, что коррелировало с улучшением клинической картины (уменьшением или купированием болевого синдрома, нормализация стула и др.) и уменьшением индекса эндоскопической активности. Полученные результаты показали, что отсутствие антител к антигенам HLA I и II класса после системной трансплантации аллогенных МСК свидетельствует не только об эффективности, но и о безопасности трансплантации аллогенных МСК, в связи, с чем
специального подбора доноров при трансплантации аллогенных МСК не требуется [31].
В работах, которые проводились в отделении клеточной и экспериментальной лучевой терапии МРНЦ РАМН в рамках утвержденной Президиумом РАМН программы «Новые клеточные технологии — медицине», этот вопрос был изучен для культур МСК, полученных у человека и крыс линии Вистар, на экспериментальных моделях, позволяющих выявить возможное мутагенное, канцерогенное и тератогенное действие [32].
Было показано, что эти эффекты при введении животным МСК в дозах, превышающих принятые для человека (порядка /3-5/х106 клеток на кг массы тела) в 5-10 раз, не индуцируются. Основываясь на этих данных, а также на литературных сведениях, Росздравнадзор Минздравсоцразвития РФ в 2006 году выдал МРНЦ РАМН лицензию ФС-2006/206 на методику получения культур МСК, приготавливаемых для проведения научных исследований в области клеточной терапии различных заболеваний человека.
Можно отметить, что в ряде зарубежных стран такие лицензии для проведения медицинских испытаний в области клеточной терапии также выданы, например, в США в рамках разрешения FDA для проведения 2 и 3 фазы изучения эффективности аллогенных МСК человека при лечении
Литература
1. Noort W. A. Kruisselbrink A. B., Anker P.s. et al. Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34+cells in NOD/SCID mice. Exp Hematol 2002; 30: 870-8.
2. Lazarus H., Haynesworth S., Gerson S. et al. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow -derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. // Bone Marrow Transplant 1995: 16: 557-64
3. Koc O, Gerson S., Cooper B. et al. Rapid hematopoietic recovery after co-infusion of autologous culture -expanded human cells (hMSCs) and PBPCs in breast cancer patients receiving high dose chemotherapy // J Clin Oncol. 2000; 18: 307-16
4. Esch J. S., Knoefel W. T., Klein M., Ghodsizad A., Fuerst G., Poll L. W., Piechaczek C., Burchardt E. R., Feifel N., Stoldt V., Stockschlader M., Stoecklein N., Tu-stas R. Y., Eisenberger C. F., Peiper M., Haussinger D., Hosch S. B. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells. 2005 Apr;23 (4):463-70
5. Jayne D., Passweg J., Marmont A., Farge D., Zhao X., Arnold R., Hiepe F., Lisukov I., Musso M., Ou-Yang J., Marsh J., Wulffraat N., Besalduch J., Bingham S. J., Emery P., Brune M., Fassas A., Faulkner L., Ferst-er A., Fiehn C., Fouillard L., Geromin A., Greinix H., Rabusin M., Saccardi R., Schneider P., Zintl F., Grat-wohlA., TyndallA. European Group for Blood and Marrow Transplantation; European League Against Rheumatism Registry. Autologous stem cell transplantation for systemic lupus erythematosus. Lupus 2004; 13; 3: 168-176
6. Tyndall A., Matucci-Cerinic M. Haematopoietic stem cell transplantation for the treatment of systemic sclerosis and other autoimmune disorders. Expert Opin Biol Ther. 2003 Oct; 3 (7):1041-9
стероидустойчивых форм БК (Компания Osiris, препарат промышленного производства Prochimal). В Японии МСК испытываются как агент ослабляющий реакцию «трансплантат против хозяина», развивающуюся у больных лейкозом после высокодозной химиотерапии и пересадки костного мозга [33]. Полученные данные расширяют возможности клинического применения МСК костного мозга человека.
Областями медицины, в которых использование аллогенных МСК прошло полный путь изучения от экспериментальных работ до широкого эффективного клинического применения, являются онкология и онкогематология. Полученные положительные результаты экспериментальных исследований позволили перейти к многоцентровым клиническим испытаниям трансплантации аллогенных МСК в различных отраслях медицины.
До широкого внедрения аллогенных МСК в клиническую практику необходимо будет решать вопрос об определении четких клинических, эндоскопических, иммунологических показаний для данного метода лечения. Накопленный клинический опыт свидетельствует, что аллогенная трансплантация МСК имеет ряд преимуществ перед аутологичной трансплантацией, первоначальные результаты демонстрируют безопасность данного метода терапии.
7. Snowden J. A., Passweg J., Moore J. J., Milliken S., Can-nell P., Van Laar J., Verburg R., Szer J., Taylor K., Joske D., Rule S., Bingham S. J., Emery P., Burt R. K., Lowen-thal R. M., Durez P., McKendry R.J., Pavletic S. Z., Espigado I., Jantunen E., Kashyap A., Rabusin M., Brooks P., Bredeson C., Tyndall A. Autologous hemopoietic stem cell transplantation in severe rheumatoid arthritis: a report from the EBMT and ABMTR. J Rheumatol 2004; 31; 3: 482-488
8. Tyndall A., Walker U. A., Cope A. et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 31 October 2005. Arthritis Res Ther 2007; 9: 301 [published online 29 January 2007, doi:10.1186/ar2103
9. Stasi R., Provan D. Management of immune thrombocytopenic purpura in adults. Mayo Clin Proc. 2004 Apr;79 (4):504-22
10. Popat U., Krance R. Haematopoietic stem cell transplantation for autoimmune disorders: the American perspective. Br J Haematol. 2004 Sep;126 (5):637-49;
11. Krisner J. В. «Nonspecific» inflamatory bowel disease (ulcerative colitis and Crohn's disease) after 100 years — what next?// Ital. J. Gastroenterol. Hepatol.— 1999.—Vol. 31.— Р. 651-658
12. Kashyap A., Forman S. J. Autologous bone marrow transplantation for non-Hodgkin's lymphoma results in long-term remission of coincidental Crohn's disease. Br J Haematol 1998; 103: 651-652
13. Duijvestein M., Verwey M. H., Fidder H. H., et al. Autologous mesenchymal stem cell therapy in patients with refractory Crohn's disease. J Crohns Colitis 2009; 3 (1): S46-7
14. Шаманская Т. В., Осипова Е. Ю., Румянцев С. А. Технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток ex vivo для клинического использования //
Онкогематология. Фундаментальные исследования в практической медицине на современном этапе. —2009.—№ 3. — стр 69-76)
15. Ramiya V.K, Maraist M., ArforsK.E., Schatz D. A., Peck A. B., Cornelius J. G. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nat. Med., 2000 Mar; 6 (3):278-82,85
16. De S. P., Zecca M., Giorgiani G. et al. Resolution of immune haemolytic anaemia with allogeneic bone marrow transplantation after an unsuccessful autograft. Br J Haematol 1999;106:1063-4
17. Lopez-Cubero S.O., Sullivan K. M., McDonald G. B. Course of Crohn's disease after allogenic marrow transplantation. Gastroenterology 1998; 114:433-440
18. Ditschkowski M., Einsele H., Schwerdtfeger R. et al. Improvement of inflammatory bowel disease after allogenic stem cell transplantation.Transplantation 2003; 75: 1745-1747
19. Majumdar M.X., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization 5id functionality of cells surface molecules on human mesenchymal stem cell. J. 5 omed. Sci. 2003; 10: 228-41
20. Apanius V., Penn D., Slev P.R // Crit. Rev. Immu-nol.—1997.— Vol. 17, N2.— P. 179-224.
21. Mackay I., Rosen F. S. // N Engl. J. Med.—2000.— Vol. 343, N 11.— P. 782-787. 19. Retersdorf E. W., Hasen J. A., Martin P. J. et al. // N. Engl.J. Med.—2001.— Vol.345, N 25.— P. 1794-1800.
22. Fouillard L., Chapel A., Bories D. et al. Infusion of alloge-neic-related HLA mismatched mesenchymal stem cells for the treatment of incomplete engraftment following autologous haematopoietic stem cell transplantation // Leukemia 2007; 21: 568-70.
23. Rius J., Nessim A., Nogueras J. J., Wexner S. D. Gracilis transposition in complicated perianal fistula and unhealed perineal wounds in Crohn's disease. Eur J Surg 2000; 166: 218-222
24. Houghton J., Stoicov C., Nomura S. et al. Gastric cancer originating from bone marrow-derived cells. Science 2004;306 (5701):1568-71
25. Daniel Rubio., Javier Carcia- Castro., Maria C. Martin., Ricardo de la Fuente., Juan C. Cigudosa., Alison C., Lloyd
and Antonio Bernad. Spontaneous human adult stem cell transformation // Cancer Res 2005; 65: 3035-3039
26. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M. C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. // Cancer Res 2005; 65: 3035-9.
27. Ruhnke M., Nussler AK, Ungefroren H, Hengstler JG, Kremer B, Hoeckh W, Gottwald T, Heeckt P, Fandrich F. Human monocyte-derived neohepatocytes: a promising alternative to primary human hepatocytes for autologous cell therapy. Transplantation. 2005 May 15;79 (9):1097-103
28. Erdo F, Buhrle C, Blunk J, Hoehn M, Xia Y, Fleischmann BK, Focking M, Kustermann E, Kolossov E, Hescheler J, Hossmann K-A, and Trapp T. // Host-dependent tu-morogenesis of embrionic stem sell transplantation in experimental stroke. Journal of Cerebral Bloob Flow and Methabolism. 2003, 23:780-785.
29. Князев О. В. Лечение воспалительных заболеваний кишечника аллогенными мезенхимальными стромальными клетками // Докторская диссертация.—2010.—стр 292.
30. Сагынбаева В. Э., Лазебник Л. Б., Князев О. В., Ефремов Л. И. Антитела к инфликсимабу и к антигенам HLA-I и II класса как свидетели иммунного ответа на биолгическую терапию воспалительных заболеваниях кишечника // Экспер. и клинич. гастроэнтер. 2011. № 12.— с.—49-53.
31. Konoplyannikov A. G., Lepechina L. A., Kalsina S. S. e.al. Development of methods for medical application of autologous mesenchymal stem cells (MSC), produced from their cardiomyoblast, and also conditioned media of MSC for therapy ofvarious diseases. In: «Proceedings of the British-Russian workshop in association with the European Commission «Stem cells: policy, research and innovations. European Union — Russian Federation Perspectives», 2007: 86-90
32. Unger C., Skottman H., Blomberg P. et al. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Human Molecular Genetics. 2008; 17 (1): 48-53
33. Taupin P. 0TI-010 Osiris Therapeutics/JCR Pharmaceuticals. Curr Opin Investig Drugs. 2006; 7 (5): 473-481
