Трансплантат лимбальных эпителиальных стволовых клеток на биорезорбируемом носителе Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

НА Б

ТРАНСПЛАНТАТ ЛИМБА. ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ СТ

.П. Понятовская, инженер-исследователь отдела молекулярно-клеточных технологий ,ентральной научно-исследовательской лаборатории1;

.А. Коротченко, младший научный сотрудник отдела молекулярно-клеточных технологий нтральной научно-исследовательской лаборатории1; „.В. Давыденко, научный сотрудник группы патологической анатомии патологоанатомического отделения2;

A.В. Юдинцев, старший преподаватель кафедры биофизики Института биологии и биомедицины3;

B.И. Михайлова, врач-офтальмолог4; А.А. Шипунов, младший научный сотрудник4; И.А. Николаев, врач-ординатор4;

Н.А. Поздеева, д.м.н., зам. директора по научной работе4;

Е.Н. Батьков, к.м.н., зам. директора по организационно-клинической работе4;

И.В. Мухина, д.б.н., профессор, зав. ЦНИЛ1; зав. кафедрой нормальной физиологии им. Н.Ю. Беленкова1; профессор кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины3; руководитель Центра трансляционных технологий3

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603005, пл. Минина и Пожарского, 10/1;

2Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр Минздрава России, Н. Новгород, 603155, Верхне-Волжская набережная, 18;

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23;

"Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. академика С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Чебоксарский филиал, Чебоксары, 428028, пр. Тракторостроителей, 10г

Цель исследования — разработать метод культивирования лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК) с последующей их пересадкой на скаффолд на основе биорезорбируемого фибринового клея для аутотрансплантации на глаз реципиента с лимбальной недостаточностью.

Материалы и методы. Применялись два метода культивирования ткани лимба: 1) с ее предварительной ферментативной и механической диссоциацией; 2) высаживание на пластик цельного биоптата лимба. В качестве скаффолда использовался биоре-зорбируемый клей Ивисел (Johnson&Johnson, Россия). Иммуноцитохимическое фенотипирование проводилось на маркеры дифференцированных клеток роговицы, лимба и конъюнктивы и на маркеры стволовых клеток.

Результаты. Иммуноцитохимические исследования подтвердили наличие клеток, профиль маркеров которых характерен для ЛЭСК. Применяемый метод позволяет создать трансплантат культуры ЛЭСК на биорезорбируемом носителе.

Заключение. Культивирование биоптата лимба без предварительной диссоциации клеток позволяет сохранить клеточный состав, пролиферативный потенциал и значительно увеличить скорость наращивания клеточной массы лимбальных стволовых клеток.

Ключевые слова: лимбальные эпителиальные стволовые клетки; недостаточность лимбальных стволовых клеток; трансплантат; скаффолд.

Как цитировать: Ponyatovskaya A.P., Korotchenko S.A., Davydenko D.V., Yudintsev A.V., Mikhailova V.l., Shipunov A.A., Nikolaev I.A., Pozdeeva N.A., Bat'kov E.N., Mukhina I.V. Transplant of limbal epithelial stem cells on bioresorbable scaffold. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(4): 44-50, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.4.05

Для контактов: Понятовская Анастасия Петровна, e-mail: [email protected]

//////////////////////^^^^

44 СТМ J 2017 — том 9, №4 А.П. Понятовская, С.А. Коротченко, Д.В. Давыденко, А.В. Юдинцев, В.И. Михайлова.....И.В. Мухина

Transplant of Limbal Epithelial Stem Cells on Bioresorbable Scaffold

A.P. Ponyatovskaya, Engineer-Researcher, Department of Molecular and Cell Technologies, Central Research Laboratory1;

S.A. Korotchenko, Junior Researcher, Department of Molecular and Cell Technologies, Central Research Laboratory1;

D.V. Davydenko, Researcher, Pathological Anatomy Group, Department of Pathological Anatomy2; A.V. Yudintsev, Senior Lecturer, Department of Biophysics, Institute of Biology and Biomedicine3; V.I. Mikhailova, Ophthalmologist4;

A.A. Shipunov, Junior Researcher4;

I.A. Nikolaev, Physician-in-Residency4;

N.A. Pozdeeva, MD, PhD, Deputy Director in Charge of Research4;

E.N. Bat'kov, PhD, Deputy Director in Charge of Clinics and Administration4;

I.V. Mukhina, DSc, Professor, Head of the Central Research Laboratory1; Head of the Department of Normal Physiology named after N.Y. Belenkov1; Professor, Neurotechnology Department, Institute of Biology and Biomedicine3; Head of the Center for Translational Technology3

1Nizhny Novgorod State Medical Academy, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russian Federation;

2Privolzhsky Federal Medical Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, 18 Verkhne-Volzhskaya Naberezhnaya St., Nizhny Novgorod, 603155, Russian Federation; 3Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod, 23 Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation;

4The Academician S.N. Fyodorov Intersectoral Research and Technology Complex "Eye Microsurgery", Ministry of Health of the Russian Federation, Cheboksary branch, 10 g Traktostroiteley pr., Cheboksary, 428028, Russian Federation

The aim of the study was to develop a method to culture limbal epithelial stem cells (LESC) including their subsequent transplantation onto a scaffold based on bioresorbable fibrin glue for further autotransplantation into the eye of a recipient with limbal insufficiency.

Materials and Methods. Two methods of limbal tissue cultivation were used: 1) with preliminary enzymatic and mechanical tissue dissociation; 2) with planting the entire limbal specimen on a plastic base. Bioresorbable glue from Evicel (Johnson & Johnson, Russia) was used as a scaffold. Immunocytochemical phenotyping was performed using the markers of differentiated cells of the cornea, limbus and conjunctiva and the markers of stem cells.

Results. Immunocytochemical studies have confirmed the presence of cells whose marker profile was characteristic for LESC. The developed method resulted in a transplant based on LESC cultured on a bioresorbable scaffold.

Conclusion. Culturing a limbus biopsy specimen without preliminary dissociation allows one to preserve cell composition and proliferative potential; the method significantly increases the growth of limbal stem cells.

Key words: limbal epithelial stem cells; limbal stem cells deficiency; transplant; scaffold.

English

Заболевания, ведущим фактором развития которых является недостаточность лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК), характеризуются помутнением роговицы различной степени интенсивности, хроническим воспалением поверхности глазного яблока, неоваскуляризацией, образованием конъюн-ктивального паннуса, рецидивирующими эрозиями, что в итоге ведет к значительному снижению остроты зрения [1]. К лимбальной недостаточности могут приводить ожоги, синдром Стивенса-Джонсона, рубцо-вый пемфигоид, трахома, ионизирующие излучения, ультрафиолетовое излучение, генетические заболевания, в том числе такое заболевание, как врожденная

аниридия, а также различные кератиты и кератопатии [2, 3].

Существует несколько вариантов патогенетического лечения лимбальной недостаточности с помощью стволовых клеток в зависимости от ее типа (полная или частичная, врожденная или приобретенная) [4-6]:

1) аутотрансплантаты лимба со здорового глаза или от близких родственников. Недостатком метода является вероятность развития лимбальной недостаточности на ранее интактном глазном яблоке, также данный метод невозможно использовать при двустороннем поражении и при наследственных генетических заболеваниях;

2) трансплантаты аллогенного лимба от доноров-трупов. Основным недостатком метода является длительная иммуносупрессивная терапия;

3) аутологичные лимбальные клетки, культивированные на различных носителях (амниотическая мембрана, коллагеновый скаффолд и др.). Применение данного способа ограничено технической сложностью и стоимостью.

Разработанные на сегодняшний день способы культивирования и трансплантации лимбальных клеток не обеспечивают стойкой регенерации роговичного эпителия и не позволяют добиться достаточно длительного поддержания регенераторных свойств роговичного эпителия для успешного выполнения пересадки роговицы.

Расположенные в складках палисадов Фогта ЛЭСК составляют особый пул стволовых клеток в области базального эпителия лимба [7, 8], благодаря которым происходит восстановление роговицы при различных повреждениях. Деление ЛЭСК выполняется асимметричным способом, при котором одна дочерняя клетка позволяет поддерживать «стволовость» и сохранять пул стволовых клеток, а другая становится транзиторной амплифицирующейся клеткой и далее может дифференцироваться в крыловидные клетки, а они затем в свою очередь трансформируются в терминально дифференцированные роговичные эпителиальные клетки [9]. ЛЭСК по сравнению с другими соматическими стволовыми клетками имеют свои особенности: небольшие размеры самой клетки, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, отсутствие экспрессии маркеров дифференцировки. Кроме того, для этих клеток характерно наличие а-энолазы, рецепторов EGF, пигмента, присутствие виментина и цитокератина 14, 15, 19 [10, 11]. Основными положительными их маркерами являются фактор p63, субъединица G-2 белка ABCG2 [12, 13]. Среди наиболее используемых в качестве отрицательных маркеров — цитокератин 3 (CK3) и цитокератин 19 (CK19), а также белок коннексин 43, которые типичны для дифференцированных клеток. СК3 является маркером окончательной дифференцировки, он «окрашивает» все дифференцированные клетки роговичного и лимбаль-ного эпителия, но не «окрашивает» клетки конъюнкти-вального эпителия. СК19 присутствует во всех конъ-юнктивальных и лимбальных эпителиальных клетках, а также в периферических базальных клетках роговицы. К сожалению, до настоящего времени не найдено одного конкретного маркера ЛЭСК, поэтому комбинация положительных и отрицательных маркеров является наиболее надежным способом фенотипирования предполагаемых ЛЭСК в лимбальном эпителии.

Цель исследования — разработать метод культивирования лимбальных эпителиальных стволовых клеток для дальнейшей их пересадки на скаффолд из фибринового клея и последующей трансплантации реципиентам с недостаточностью лимбальных стволовых клеток.

Материалы и методы

Клеточная культура. Забор лимбальных клеток осуществляли у взрослого кролика в условиях операционной. Выкраивали участок лимба протяженностью 2-3 мм, толщиной 200 мкм, захватывая по 1,5 мм роговицы и конъюнктивы. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с нормативами, указанными в руководстве «Guide for the Care and Use of Laboratory Animais (ILAR publication, 1996, the National Academy Press)»; с национальным стандартом РФ ГОСТ 330442014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НижГМА.

Всю работу по обработке ткани и культивированию клеток выполняли в асептических условиях в ламинарном боксе. Ткань лимба предварительно несколько раз отмывали в растворе Хэнкса («ПанЭко», Россия) с антибиотиком — 100 мкг/мл гентамицина (КРКА, Словения).

При посадке культуры использовали два метода: 1) механическая и ферментативная диссоциация ткани лимба и высаживание на пластик суспензии клеток; 2) высаживание на пластик ткани лимба без предварительной диссоциации.

Метод 1. Выделенная ткань лимба механически и ферментативно дезагрегировалась: измельчалась при помощи двух скальпелей до размеров 1 мм3, затем обрабатывалась 0,25% раствором трипсина (Invitrogen, США) в течение 15 мин с экспозицией в термостате при 35,5°С. Для инактивирования трипсина к суспензии добавляли избыток среды Dulbecco's modified Eagle's medium и Ham's F12 — DMEM-F12 (Invitrogen, США) с 10% фетальной бычьей сыворотки («ПанЭко», Россия). Затем суспензию центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде: DMEM-F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки. Суспензию клеток, полученную от одного био-птата, в 3 мл среды заливали в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм. Клетки прикреплялись к пластику и активно пролиферировали.

Метод 2. Ткань лимба механически при помощи двух скальпелей разобщали на части по 5-8 мм и помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм в ростовой среде DMEM-F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки.

Органотипические культуры (биоптаты) и диссоциированные клетки культивировали при 35,5°С и 5% СО2 в инкубаторе для культур клеток МСО-18А1С (Sanyo, Япония) до достижения монослоя культуры 90-100% конфлюэнтности. Замену 1 мл среды производили каждые 3 дня.

Структуру и динамику развития культур оценивали с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Leica Microsystems, Германия). Для оценки скорости

//////////////////////^^^^

46 СТМ J 2017 — том 9, №4 А.П. Понятовская, С.А. Коротченко, Д.В. Давыденко, А.В. Юдинцев, В.И. Михайлова.....И.В. Мухина

развития культур использовали показатель времени достижения монослойной культурой 90-100% кон-флюэнтности.

После образования клетками монослоя лимбаль-ные стволовые клетки снимали с поверхности пластика методом трипсинизации и пересаживали на био-резорбируемый носитель — скаффолд. Скаффолд формировали в виде полупрозрачной пленки из фи-бринового клея Ивисел (Johnson&Johnson, Россия) на дне лунки культурального планшета с диаметром 15,4 мм. Клетки на скаффолде культивировали при постоянных условиях 35,5°С, 5% CO2 в увлажненном инкубаторе для культур клеток (MCO-18AIC).

Иммуноцитохимическое фенотипирование клеточных культур. Протокол окрашивания клеток в культуре включал в себя фиксацию 70% этанолом, инкубацию клеток с первичными антителами — мо-ноклональными мышиными антителами к CK19, clon Ks19.1 (Lab Vision Corporation, США) и к CKpan, clon AE1/AE3 (Lab Vision Corporation, США). В случае им-мунофлюоресцентного окрашивания в раствор дополнительно добавляли первичные кроличьи поликло-нальные антитела к белку SOX2 (Abcam, США) или белку виментину [EPR3776] — Cytoskeleton Marker (Abcam, США). Визуализацию комплекса с антителами проводили либо с использованием системы детекции UltraVision Quanto (Lab Vision Corporation, США) и ее протокола (без блокирования пероксидазной активности и протеинового блока) — ядра клеток в этом случае докрашивали гематоксилином Майера, либо с

использованием вторичных козьих антимышиных антител с флюоресцентными зондами Goat Anti-Mouse IgG H&L — Alexa Fluor® 488 (Thermo Fisher, США) и антикроличьих антител Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody — Alexa Fluor® 555 (Thermo Fisher, США) — ядра клеток в этом случае докрашивали красителем Hoechst 33342 (BD Pharmingen, США).

Окрашенные флюоресцентными маркерами клетки просматривали с помощью конфокального флюоресцентного лазерного сканирующего микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Культивирование диссоциированных клеток лимба на пластике до пересадки на скаффолд.

При культивировании диссоциированных клеток лимба и органотипической культуры лимбальной ткани наблюдалась различная динамика роста монослоя стволовых лимбальных клеток.

При культивировании клеток лимба первым методом в 1-е сутки первичная культура была представлена клеточной суспензией (рис. 1, а). Некоторые клетки начинали прикрепляться к пластику на 1-2-е сутки, на 5-е сутки культура диссоциированных клеток лимба состояла из фенотипически разнородных клеток, большинство из которых находилось в суспензии, лишь единичные клетки были прикреплены к дну чашки Петри (рис. 1, б). В дальнейшем прикрепившиеся клетки пролиферировали, образуя скопления клеток в виде клонов на дне чашки Петри. Стадия

Рис. 1. Развитие культуры диссоциированных лимбальных стволовых клеток:

а — 1-е сутки, суспензия клеток сразу после высаживания на дно чашки Петри; б — 5-е сутки, фенотипически разнородные клетки, большинство из которых находится в суспензии; в — 21-е сутки, однородный монослой в виде тонкой пленки

Рис. 2. Развитие тканевого биоптата лимба без предварительной диссоциации:

а — 1-е сутки, тканевой биоптат лимба сразу после помещения на субстрат; б — 3-и сутки, ткань лимба, прикрепленная к пластику, в нижней части образца разнородные по фенотипическому составу клетки активно пролиферируют; в — 5-е сутки, однородный монослой в виде тонкой пленки

Рис. 3. Культура лимбальных стволовых клеток на фибриновом клее:

а — живая культура клеток на субстрате; б — иммуноцитохимическое маркирование клеток лимба на цитокератин PAN; в — окрашивание лимбальных клеток иммуноцитохимическим методом на цитокератин 19

90-100% конфлюэнтности наблюдалась через 3 нед (22,0±2,6 сут) после посадки диссоциированных клеток (рис. 1, в).

При культивировании клеток лимба вторым методом в 1-е сутки первичная культура была представлена тканевым биоптатом лимба размером 5-8 мм (рис. 2, а). На 2-е сутки культивирования ткань лимба прикреплялась к пластику и в нижней части биоптата; клетки, разнородные по фенотипическому составу, активно пролиферировали (рис. 2, б). Разрастаясь, культура закрывала большую часть дна чашки Петри однородным монослоем в виде тонкой пленки, видной невооруженным глазом. Скорость пролиферации клеток и образования монослоя была значительно выше, чем при культивировании диссоциированных клеток (рис. 2, в). Стадия 90-100% конфлюэнтности наблюдалась через 7,5±0,5 сут.

Таким образом, оба метода культивирования обеспечивали рост культуры стволовых клеток лимба, достаточный для пересадки на скаффолд из фибрино-

вого клея, но скорость роста культуры была выше при культивировании без проведения предварительной диссоциации ткани лимба.

Пересадка лимбальных эпителиальных стволовых клеток на скаффолд. Клеточная культура после ферментативного снятия с пластика и посадки на скаффолд прикреплялась к фибриновому клею и про-лиферировала на нем (рис. 3, а), образуя монослой в течение 15-17 сут после получения клеток первым способом и в течение 5-6 сут после получения клеток вторым способом.

Фенотипирование культуры лимбальных стволовых клеток. Иммуноцитохимическое и имму-нофлюоресцентное маркирование выявило наличие в культуре единичных дифференцированных клеток с небольшим количеством цитокератинов (рис. 3, б, в). В образце присутствовали мелкие округлые клетки, цитоплазма которых четко окрашена антителами с флюоресцентным красителем к белкам СКрап и СК19 (рис. 4). Также присутствовало небольшое количест-

////////////////ш^^^

48 СТМ J 2017 — ТОМ 9, №4 А.П. Понятовская, С.А. Коротченко, Д.В. Давыденко, А.В. Юдинцев, В.И. Михайлова.....И.В. Мухина

Рис. 4. Экспрессия маркеров лимбальных стволовых клеток в образце:

верхний ряд — наблюдается небольшое количество клеток с SOX2-положительными ядрами (зеленый цвет), также присутствует округлая клетка с положительным маркированием на цитокератин PAN (красный цвет), ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (синий цвет); нижний ряд — положительное маркирование большей части культуры клеток на виментин (зеленый цвет), в нескольких клетках наблюдается его коэкспрессия с цитокератином 19 (красный цвет). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (синий цвет)

во SOX2-nоложительных ядер (рис. 4, верхний ряд). Большую часть культуры (>95%) составляли вимен-тин-положительные клетки (рис. 4, нижний ряд).

Результаты иммуноцитохимического и иммунофлю-оресцентного анализа показали, что в большей части культурального образца присутствовали виментин-по-ложительные клетки с незначительным количеством SOX2-, СКрап- и СК19-позитивных клеток. Отсутствие в большинстве культивируемых клеток экспрессии маркеров дифференцировки (СКрап и СК19) при наличии виментина как маркера «стволовости» свидетельствовало о том, что образец состоял из лимбальных стволовых клеток.

Таким образом, культивирование биоптата лимба без предварительной диссоциации клеток позволяет сохранить клеточный состав, пролиферативный потенциал и значительно увеличить скорость наращивания клеточной массы лимбальных стволовых клеток (стадия 90-100% конфлюэнтности наблюдается через неделю при культивировании биоптата и через 3 нед — при культивировании диссоциированных клеток).

Заключение. Разработанный способ культивирования монослойного трансплантата лимбальных эпителиальных стволовых клеток на основе биоре-зорбируемого фибринового клея Ивисел может быть использован для разработки метода лечения лим-бальной недостаточности с помощью клеточных технологий.

Финансирование исследования. Исследование не финансировалось никакими источниками.

Конфликт интересов не заявляется.

Литература/References

1. Поздеева Н.А., Тонаева Х.Д., Борзенок С.А. Алло-лимбальная трансплантация в лечении пациентов с недостаточностью лимбальных стволовых клеток при врожденной аниридии. Медицинский альманах 2014; 1(31): 74-77. Pozdeeva N.A., Tonaeva H.D., Borzenok S.A. Allolimbal transplantation in the treatment of patients with insufficiency of limbal stem cells in case of congenital aniridia. Meditsinskiy al'manakh 2014; 1(31): 74-77.

2. Кузьменко В.В., Ступникова Т.В., Хейфец Ю.Б., Вавилова Л.М. Применение стволовых клеток в офтальмологии. Разработка и регистрация лекарственных средств 2015; 4(13): 128-133. Kuzmenko V.V., Stupnikova T.V., Kheyfets Yu.B., Vavilova L.M. Application of stem cells in ophthalmology. Razrabotka i registratsiya lekarstvennykh sredstv 2015; 4(13): 128-133.

3. Фримен Д.М. Ассоциированная с аниридией кератопатия. Практическая медицина 2015; 1-2(87): 62-69. Freeman J.M. Associated with aniridia keratopathy. Prakticheskaya meditsina 2015; 1-2(87): 62-69.

4. Пасечникова Н.В., Гринь В.К., Дрожжина Г.И., Попан-допуло А.Г, Иванова О.Н., Кавелина А.С. Получение трехмерного трансплантата лимбальных клеток роговицы. Вестник неотложной и восстановительной медицины 2012;

13(1): 99-102. Pasechnikova N.V., Grin V.K., Drozhzhina G.I., Popandopulo A.G., Ivanova O.N., Kavelina A.S. Three-dimensional graft of limbal cornea cells. Vestnik neotlozhnoy i vosstanovitel'noy meditsiny 2012; 13(1): 99-102.

5. Попандопуло А.С., Кавелина О.Н., Иванова Г.И., Дрожжина А.Г Роль лимбальных клеток в регенерации роговицы. Таврический медико-биологический вестник 2013; 1-2(61): 158-160. Popandopulo A.S., Kavelina O.N., Ivanova G.I., Drozhzhina A.G. The role of limbal cells in regeneration of cornea. Tavricheskiy mediko-biologicheskiy vestnik 2013; 1-2(61): 158-160.

6. Гундорова РА., Макаров П.В., Терских В.В., Васильев А.В., Ходжабекян Г. В. Перспективы применения новых биотехнологических методов в регуляции регенерации роговицы. Вестник офтальмологии 2004; 120(6): 49-52. Gundorova R.A., Makarov P.V., Terskikh V.V., Vasil'ev A.V., Khodzhabekyan G.V. Prospects of application of new biotechnology methods in regulation of corneal regeneration. Vestnik oftal'mologii 2004; 120(6): 49-52.

7. Yoon J.J., Ismail S., Sherwin T. Limbal stem cells: central concepts of corneal epithelial homeostasis. World J Stem Cells 2014; 6(4): 391-403, https://doi.org/10.4252/wjsc.v6.i4.391.

8. Joseph A., Powell-Richards A.O., Shanmuganathan V.A., Dua H.S. Epithelial cell characteristics of cultured human limbal explants. Br J Ophthalmol 2004; 88(3): 393-398, https://doi. org/10.1136/bjo.2003.018481.

9. Nieto-Miguel T., Calonge M., de la Mata A., López-Paniagua M., Galindo S., de la Paz M.F., Corrales R.M. A comparison of stem cell-related gene expression in the progenitor-rich limbal epithelium and the differentiating central corneal epithelium. Mol Vis 2011; 17: 2102-2117.

10. Kurpakus M.A., Maniaci M.T., Esco M. Expression of keratins K12, K4 and K14 during development of ocular surface epithelium. Curr Eye Res 1994; 13(11): 805-814, https://doi.org/10.3109/02713689409025135.

11. Yoshida S., Shimmura S., Kawakita T., Miyashita H., Den S., Shimazaki J., Tsubota K. Cytokeratin 15 can be used to identify the limbal phenotype in normal and diseased ocular surfaces. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47(11): 4780-4786, https://doi.org/10.1167/iovs.06-0574.

12. Ksander B.R., Kolovou P.E., Wilson B.J., Saab K.R., Guo Q., Ma J., McGuire S.P., Gregory M.S., Vincent W.J., Perez V.L., Cruz-Guilloty F., Kao W.W., Call M.K., Tucker B.A., Zhan Q., Murphy G.F., Lathrop K.L., Alt C., Mortensen L.J., Lin C.P., Zieske J.D., Frank M.H., Frank N.Y. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature 2014; 511(7509): 353-357, https://doi.org/10.1038/ nature13426.

13. De Paiva C.S., Chen Z., Corrales R.M., Pflugfelder S.C., Li D.Q. ABCG2 transporter identifies a population of clonogenic human limbal epithelial cells. Stem Cells 2005; 23(1): 63-73, https://doi.org/10.1634/stemcells.2004-0093.

///////////////////////^^^^

50 СТМ J 2017 — том 9, №4 А.П. Понятовская, С.А. Коротченко, Д.В. Давыденко, А.В. Юдинцев, В.И. Михайлова.....И.В. Мухина