CC BY
34УДК 575.23-024.1
О.Л. Серов
ТРАНСГЕНЕЗ КАК ЭффЕКТИВНЫЙ СПОСОБ МОДИфИКАЦИИ
геномов животных
Обзорная статья
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук Российская Федерация, 630090, г. Новосибирск, пр-т ак. Лаврентьева, 10
Клетки животных и растений постоянно контактируют с чужеродной ДНК эукариот других видов при питании и прокариотической ДНК бактерий, грибов, вирусов при инфекции. Как правило, цитоплазма клетки «справляется» с этим потоком чужеродной ДНК, поступающей с продуктами питания или при инфекции, расщепляя ее до нуклеотидов в специализированных структурах, таких как лизосомы. В результате чужеродная ДНК не доходит до ядра клеток и, следовательно, лишена возможности «включиться» в ее геном. Исключением являются ретровирусы, способные проникать через клеточные мембраны и достигать ядра клетки и даже встраиваться в ее геном, становясь его об-лигатным наследуемым компонентом [13, 14]. Это результат длительной эволюции взаимоотношений геномов вирусов и клеток животных и растений, в ходе которой выработался специальный механизм, позволяющий чужеродной ДНК встраиваться в геном клеток-мишеней, вызывая его генетическую модификацию.
Немногим более 30 лет назад, исследователи разработали способ переноса генов чужеродной ДНК от одного вида животных к другому [2, 4]. Учитывая решающую роль цитоплазмы в «охране» генома от чужеродной ДНК, авторы разработали метод прямой микроинъекции
рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус (на стадии Р3-Р4 по [1]) (рис. 1) зигот мыши. Пронуклеус - аналог ядра - практически не содержит ферментов, деградирующих ДНК, потому инъецированная ДНК может сохраняться по крайней мере в течение одного клеточного цикла, но в реальности сохраняется даже после 3-5 делений.
Сама процедура инъекции в пронуклеус осуществляется под микроскопом с помощью микроманипулятора (рис. 2). Считается оптимальной инъекция пронуклеус 2000-4000 копий рекомбинантной ДНК в объеме 1-2 пкл [5]. После такой микроингъекции пронуклеус увеличивается в объеме, что является свидетельством успешности процедуры. Поскольку процедура травматична, экспериментальные зиготы после инъекции кратковременно культивируют (от 2-х до 4-х часов), визуально идентифицируются и удаляются поврежденные зиготы [5]. Неповрежденные экспериментальные зиготы трансплантируют хирургическим путем в воронку матки суперовулированных (псевдобеременных) самок (рис. 3). Несмотря на сложность процедуры микроинъецирования ДНК в зиготы, квалифицированный оператор способен инъецировать 50-70 зигот за один опыт и затем трансплантировать приемным матерям.
Рис. 1 Схема развития одноклеточного эмбриона мыши по [1]. Хроматин мужского (отцовский) и женского (материнский) пронуклеусов представлены черным и серым цветами, соответственно. РШ - небольшие пронуклеусы расположены по периферии эмбриона; РШ - пронуклеусы увеличиваются в размерах и начинают двигаться в центру эмбриона; РШ - пронуклеусы продолжают увеличиваться в размерах и сближаться; РЖ - большие пронуклеусы находятся рядом в центре эмбриона; РЮ - пронуклеусы сливаются и одновременно вступают в митоз
Сложнее дело обстоит с зиготами большинства сельскохозяйственных животных: коров, овец, коз, пушных зверей и т.д. Цитоплазма зигот этих животных содержит липидные гранулы и включения и поэтому практически не прозрачна. С целью визуализации пронуклеу-сов исследователи используют кратковременное центрифугирование, в результате чего происходит визуализация пронуклеусов.
Судьба инъецированной ДНК в зиготах складывается различным образом. В небольшом объеме ядра введенная ДНК присутствует в высокой концентрации, что приводит к образованию конкатенатов, то есть комплексов из нескольких молекул рекомбинантной ДНК, связанных нековалентными связями. Как отмечалось выше, введение рекомбинантной ДНК осуществляется на стадии Р3-Р4 (рис. 1), то есть в тот период, когда идет активная репликация ДНК в пронуклеусах реципиентного эмбриона. Именно в момент репликации, образования репликационных вилок, создаются условия физического контакта хромосомной и экзогенной ДНК через образование нековалент-ных связей благодаря частичной комплементар-ности. Следствием такого контакта является «вовлечение» экзогенной ДНК в репликацию хромосомной ДНК и встраивания, интеграции чужеродной ДНК в хромосому реципиентного генома. Интегрированную чужеродную ДНК в реципиентном геноме принято называть транс-ген, так как она становится компонентом генома и, следовательно, способна наследоваться в последующих клеточных поколениях. Важно подчеркнуть, что, как правило, интеграция происходит случайным образом и только в одно место реципиентного генома. Наглядным примером может служить рис. 4, показывающий локализацию трансгена у 4-х трансгенных животных.
Важно отметить, что зачастую интеграция осуществляется в нескольких копиях, благодаря образовавшимся контатенатам до интеграции, о чем упоминалось выше. Например, при анализе числа копий двух трансгенов у восьми трансгенных мышей, было установлено, что у трех из четырех исследованных было 2-4 копии, а у одного достигало 200 копий из расчета на гаплоидный геном, а в другой группе 7 из восьми исследованных трансгенных животных имели 1-3 копии, а один - 48 копий трансгена (Burkov et а1. 2013).
Рис. 2. Момент введения микропипетки с раствором ДНК (справа) в пронуклеус зиготы козы, удерживаемой пипеткой-присоской. Справа в зиготе, хорошо виден мужской пронуклеус (показан стрелкой), а слева женский. х 300 [8]
Скрещивание
Рис. 3. Схема получения трансгенных животных путем инъекции чужеродной ДНК в зиготы [5]
Рис. 4. Хромосомная локализация трансгена pGoatcasGMCSF у 4-х трансгенных мышей #3, #9, #11 и #20, ставших основателями линий (Burkov et al. 2013). Видно, что у трансгенных #3 и #20 мышей интеграция трансгена произошла в хромосомы 6 (Chr. 6) и 7 (Chr. 7), а у двух других интеграция прошла в хромосому 9 (Chr. 9), но в разные ее районы. Справа представлены последовательности ДНК (выделены серым цветом) в местах инсерций трансгена (выделены черным цветом) на физической карте мыши
Идентификация трансгенных животных среди родившихся особей из инъецированных зигот проводится с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по присутствию фрагментов ДНК ожидаемого размера. Поскольку, как правило, последовательности ДНК трансгенов не имеют гомологичных последовательностей в геноме-реципиента, то трансгенных животных можно надежно идентифицировать подбором прайме-ров. В качестве примера на рис. 5 показаны результаты идентификации трансгенных мышей, несущих конструкцию с геном hG-CSF человека.
Выше рассматривалась ситуация когда чужеродная ДНК интегрируется на одноклеточной
стадии. Однако если интеграция чужеродной ДНК не произошла на одноклеточной стадии, она может осуществиться на более поздней стадии, например, на двух- или четырех клеточной стадии. В этом случае развивающийся эмбрион будет мозаиком, состоящим из двух типов клеток: те, которые содержат трансген, и клеток, в которых он отсутствует, поскольку они являются потомками трансгенных и не-трансгенных бластомеров.
Другим важным последствием мозаициз-ма является, то, что и гаметы трансгенного животного будут представлены также двумя типами - с трансгеном и без трансгена. В ре-
K- K+L100 83 80 79 78 60 59 58 57 K- K+L100 83 80 79 78 60 59 58 57
Рис. 5. Идентификация трансгенных животных с помощью ПЦР и с использованием праймеров, комплементарных к 5'- последовательности промотора трансгена и последовательности внутри гена кО-СБЕ (кодирует гранулоцит-колониестимулирующий фактор человека) (слева) и к правой части гена кО-СБЕ и 3'- нетрансли-руемой области трансгена (справа) [12]. Видно, что среди восьми исследованных животных, четыре (#83, #78, #60 и #58) позитивны по присутствию фрагментов ДНК ожидаемого размера, 705 п.о. (слева) и 530 п.о. (справа), соответственно. Позитивный контроль (К+) - рекомбинантная ДНК трансгена; негативный контроль (К+) - отсутствует ДНК; L100 - фрагменты маркерной ДНК разного молекулярного веса с шагом 100 п.о.
Рис. 6. Мозаичный тип наследование трансгена в потомстве F1 трансгенной самки #78 от скрещивания его с 2-мя нетрансгенными самками. Серый и черный цвета обозначают трансгенных и нетрансгенных потомков соответственно. Наблюдается значительное отклонение от ожидаемого 1:1 у потомков F1 , однако в последующих поколениях имеет место менделевское расщепление, близкое к 1:1
58
-о-
шшиш
"Л
>
ШТШ1
-о
® - нетрансгенная самка О - трансгенная самка ■ - нетрансгенный самец И - трансгенный самец
шшш
>-
Рис. 7. Менделевское наследование трансгена в F1 и трансгенной самки #58 от скрещивания с нетрансгенными
животными. Обозначения те же, что и в рис. 6
зультате этого мозаицизма гамет, в потомстве таких трансгенных животных от скрещивания с нетрансгенными животными будет наблюдаться отклонение от менделевского расщепления 1:1 (рис. 6) в пользу увеличения числа нетрансгенных потомков. Рис. 6 и 7 иллюстрируют мозаичное и менделевское наследование трансгенов у двух трансгенных животных. Частота мозаицизма варьирует от 10 до 20% среди трансгенных животных так называемого поколения Б то есть родившихся и развившихся из инъецированных зигот.
Как отмечалось выше, интеграция трансгена происходит случайным образом, то есть транс-ген попадает в разное хромосомное окружение, контекст. Следствием этого является достаточно выраженная вариабельность в экспрессии трансгена у разных трансгенных животных от полного отсутствия экспрессии до уровня, сопоставимого с таковым аутентичного гена. В работах первых десятилетий такая вариабельность объяснялась именно влиянием хромосомного окружения трансгена. По мере накопления знаний о регуляции генов стало очевидно, что
первоначальное упрощенное представление о достаточности так называемого «минимального» промотора для обеспечения надежной экспрессии трансгена экстраполировалось избыточно широко. Поводом послужило исследование трансгенных мышей, несущих конструкцию, включающую ген гормона роста человека, «слитого» с промотором гена эластазы крыс размером 213 п.о. [10]. От^ et а1. [10] наблюдали экспрессию гена гормона роста человека только в ацинарных клетках поджелудочной железы, то есть в клетках, в которых активен ген эластазы. Однако, большинство генов, особенно характеризующиеся ткане-специфичной или стадио-специфичной экспрессией, регулируются многими транскрипционными факторами, сайты которых могут располагаться на протяженных 5-фланговых последовательностях промоторов, нередко превышающих 10 и более
тыс. п.о. С учетом этого, при создании конструкций непременным условием является сохранение ключевых регуляторных элементов в промоторах, контролирующих экспрессию гена «интереса» (любой ген, кодирующий белок, либо малоизученный относительно функции, или представляющий интерес в прикладном аспекте). В качестве примера можно рассмотреть создание конструкции, в которой 5-фланговый район гена альфа-8^казеина козы был «слит» с полноразмерным геном G-CSF (кодирует гранулоцит-колониестимулирующий фактор) человека и 3'-нетраслируемым районом гена альфа-8^казеина коровы ([12]; рис. 8). Присутствие 3409 п.о. фрагмента промотора альфа-S1-казеина козы в конструкции достаточно для корректной экспрессии гена G-CSF человека у трансгенных мышей в молочной железе и только в период лактации (рис. 9).
5' 3409 пн 1504 пн 1513пн 3'
АТС
I фланкирующая последовательность гена а81-казеина козы [" фланкирующая UTR последовательность гена а81-казеина козы | экзоны 1,18 и 19 гена а81-казеина | интроны 1 и 18 гена а81-казеина ^Нполноразмерный ген G-CSF человека
Рис. 8. Схема организации трансгена, содержащего 5ч-фланкирующую последовательность вместе с промотором гена альфа-81-казеина козы размером 3409 п.о., ген G-CSF человека и 3-фланкирующая последовательность гена альфа-81-казеина коровы [12]
277 / - 32В
200— -100— «м». — тшшшттт*^ = 200— —— 100----
58 60 78 83 К к- М00 58 60 78 83 К к- М00 в-ОЭР р-эоИп
Рис. 9. Анализ транскриптов гена G-CSF человека (слева) и гена р-аейп (справа) в молочной железе у лакти-рующих трансгенных самок мышей: #58, #60, #78 и #83 и нетрансгенной самки (К) (8е1^а е! а1. 2011). Видно, что транскрипт гена G-CSF человека ожидаемого размера (277 п.о.) присутствует у трансгенных самок, отсутствует у нетрансгенной, тогда как транскрипт (328 п.о.) гена Р-асйп (активен во всех клетках) определяется у всех анализируемых самок. К - отрицательный контроль ОТ-ПЦР (не добавлена мРНК); L100 - маркер
молекулярных весов
Тем не менее, до сих пор не существует способов предотвращения эктопической экспрессии трансгенов, то есть предсказуемый профиль экспрессии трансгена по органам и тканям, может в реальности наблюдаться в тканях и клетках, в которых используемый промотор в норме неактивен. Большинство исследователей полагает, что причиной эктопической экспрессии является то, что в конструкции трансгена не представлены регуляторные последовательности, в норме расположенные за десятки тысяч пар оснований от самого гена. Действительно, такие отдаленные системы регуляции показаны для ряда генов, хотя для большинства генов это нехарактерно.
Для того чтобы преодолеть эктопическую экспрессию трансгенов было предложено использовать большие фрагменты геномной ДНК (размером от 100 до 500 тысяч пар оснований), включающей ген интереса. С этой целью предлагается использовать вектора на основе BAC клонов или искусственных хромосом (YAC клоны). Однако, как показали более поздние исследования, при инъекции гигантских молекул геномной ДНК имеет место их физическая «поломка» или перестройки при интеграции в хромосому реципиентного генома [3, 7].
На протяжении более 30 лет с момента разработки технологии трансгенеза животных, этот подход эффективно и активно используется как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях. Наиболее популярным методом анализа функции гена является маркировка его экспрессии в клетках в ходе развития трансгенных животных. Стратегия такого подхода основана на создании конструкций, в которых промотор разного размера анализируемого гена «слит» с геном-репортером, например, lacZ (кодирует бета-галактозидазу E.coli) (рис. 10) или GFP (кодирует «зеленый флуоресцентный белок» green fluorescent protein) (рис. 12).
Keratin К5
ехоп 1
Рис. 10. Структура трансгена K5Z, в которой промотор гена кератина коровы размером 5300 п.о. «слит» с геном-репортером lacZ Е.соН вместе с сигнальной последовательностью полиаденилирования SV40 (рА) [11]
Будучи введенным в геном животных, такой трансген позволяет визуализировать клетки, в которых активен анализируемый ген, путем гистохимического окрашивания клеток на активность бета-галактозидазы (в геноме млекопитающих такого фермента нет) (рис. 11).
Другой пример с использованием GFP, позволяющий визуализировать клетки позитивные по экспрессии трансгена - рис. 12, на котором показана конструкция, несущая ген GFP под контролем промотора бета-актинового гена, активного в клетках любого типа.
Трансгенные мыши, несущие такой транс-ген в своем геноме, содержат клетки, меченые зеленым флуоресцентным белком.
Визуализация экспрессии трансгена позволяет оценивать функцию промоторов, используя в конструкциях разные их размеры и наблюдая экспрессию гена-репортера у трансгенных животных. Такая стратегия позволила выявить функциональные регуляторные сайты у многих генов, имеющих клеточно- или тка-неспецифическую экспрессию.
Разработанные экспериментальные подходы по получению трансгенных животных неизбежно привели к использованию таких животных в прикладных целях, в качестве «биореакторов»-продуцентов биологически ценных белков человека. Наиболее популярными и продвинутыми технологиями являются получение трансгенных животных (козы, овцы, коровы и т.д.), в геном которых введены конструкции, находящиеся под контролем промоторов «молочных генов», как это показано на рис. 8. «Молочные гены» -это группа генов, которые экспрессируют-ся исключительно в эпителиальных клетках молочной железы, причем особенно активно в период лактации. Белки молока млекопитающих представлены главным образом альфа-Sj-, S2- , бета- и каппа-казеинами (более 70% всех белков молока), а также лактальбу-минами и лактаглобулинами. У грызунов активен в молочной железе еще один ген, acid whey, кодирующий кислый белок. В качестве примера можно рассмотреть конструкцию, представленную на рис. 8, в которой 5'-флан-кирующая последовательность, включающая промотор, гена альфа^-казеина козы, «слита» с полноразмерным геном G-CSF человека и 3'-фланкирующей последовательностью
Рис. 11. Сравнение экспрессии эндогенного гена keratin 5 в клетках пищевода (крайний слева, окраска с мечеными антителами против кератина 5) и трансгена K5Z в двух трансгенных линиях мышей в клетках пищевода (в середине и крайний справа, гистохимическая окраска на бета-галактозидазу E.coli). Видно, что у одного трансгенного животного экспрессия трансгена K5Z (крайний справа) напоминает таковую эндогенного гена, тогда как у другого только часть клеток эпителия пищевода экспрессирует трансген K5Z (в центре), то есть имеет место
мозаичный тип экспрессии [11]
Seal 8266
Рис. 12. Конструкция tauGFP с геном-репортером «зеленый белок» (tauGFP) под контролем промотора бета-актинового гена курицы (CBA) и селектируемым геном устойчивости к пуромицину (Puro)
гена альфа^-казеина коровы. При создании этой конструкции предусматривалось, что при введении ее в геном мышей или коз, она будет обеспечивать экспрессию гена G-CSF человека в молочной железе трансгенных животных. Анализ экспрессии гена G-CSF человека у трансгенных мышей показал присутствие транскриптов этого гена только в молочной железе (рис. 9). Более того, им-мунофлуоресцентный анализ с использованием меченых антител против гранулоцит-колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) человека показал, что только в эпителиальных клетках молочной железы присутствует этот белок.
Независимый Вестерн-блот анализ Г-КСФ в молоке трансгенных мышей показал присутствие белка, причем в двух формах - гликози-лированной и негликозилированной (рис. 13). Важно отметить, что гликозилированная форма Г-КСФ человека функционально соответствует той форме, которая синтезируется в норме у человека, тогда как негликозилиро-ванная менее активна.
Важно отметить, что секретируемый белок Г-КСФ человека в молоке трансгенных мышей (рис. 14) обладает функциональными свойствами, сопоставимыми с нативным Г-КСФ человека.
На рис. 15 показаны результаты колони-еобразующей способности образцов молока стимулировать пролиферацию клеток-предшественников гранулоцитарного ряда на примере пуповинной крови человека. Видно, что колонии содержат клетки гранулоцитарно-го ряда на разных стадиях дифференцировки. Клетки пуповинной крови обработаны молоком трансгенной самки мыши разведенной в 30 000 раз.
Резюмируя результаты, полученные на трансгенных мышах, несущих ген О-СБЕ человека под контролем регуляторной последовательности гена, следует добавить, что продукция белка Г-КСФ человека достигала 1 мг в миллилитре молока. Из этого следует, что молоко с таким содержанием целевого белка может служить источником для его очистки. Вполне понятно, что мыши для этой цели не подходят. Однако полученные данные о параметрах экспрессии данной конструкции привлекательны и могут быть использованы для получения трансгенных коз как продуцентов Г-КСФ человека.
J. 2 3 4.5 6 7
Рис. 13. Результаты Вестерн-блот анализа молока трансгенных мышей с использованием антител против Г-КСФ человека. 1 - маркеры с различными молекулярными весами, в кД; 2, 3 - препараты рекомбинант-ного Г-КСФ человека (негликозилированный -20 кД); 4-7 - молоко трансгенных самок, содержащее как гли-козилированную форму Г-КСФ с молекулярным весом 22 кД, так и негликозилированную форму
Рис. 14. Образец молока трансгенной мыши
Рис. 15. Колония клеток-предшественников грануло-цитарного ряда, полученная из клеток пуповинной крови человека после обработки молоком трансгенной мыши (разведение 30 000 раз)
Такой эксперимент был проведен, и в результате были получены трансгенные козы, несущие такую же конструкцию. Анализ молока трансгенных коз подтвердил, что в период лактации уровень Г-КСФ человека в молоке достигал 2 мл/мл. Это достаточный уровень для использования молока трансгенных коз как источника получения препарата Г-КСФ человека для медицинской практики.
В настоящее время получены различные виды трансгенных животных, секретирую-щих с молоком рекомбинантные белки человека. Некоторые из таких белков находятся на стадии клинических испытаний либо уже представлены на фармацевтическом рынке (см. табл.). Так, например, белок антитромбин-3 человека (торговая марка ATryn, GTC Biotherapeutics, USA), продуцируемый в молочной железе трансгенных коз, успешно прошел все фазы преклиниче-ских и клинических испытаний и в данный момент существует в продаже. В клинике ATryn используется для восстановительной терапии пациентов, перенесших кардио-пульмонарное шунтирование. В настоящее время, с использованием молочных биореакторов, компанией GTC Biotherapeutics получены, по крайней мере, еще 11 различных ценных белков человека. Другая биотехнологическая компания, Pharming BV, наладила выпуск фермента альфа-глюкозидазы человека, продуцируемого в молоке трансгенных кроликов.
Интерес представляет также относительно новое направление в трансгенезе сельскохозяйственных животных - продукция в молочной железе особых рекомбинантных белков-антидотов. В частности, это антидоты против фосфорорганических соединений, используемых в химической промышленности и в качестве инсектицидов в сельском хозяйстве. Одним из таких белков является фермент бу-тирилхолинэстераза. К настоящему времени рекомбинантная бутирилхолинэстераза уже получена в молочной железе трансгенных мышей и коз, ее концентрация в молоке составляет до 5 г/л. Резюмируя вышеописанное, можно констатировать, что использование трансгенных животных в качестве биореакторов - реальность с хорошей перспективой развития в будущем.
Перечень белков, получаемых из молока трансгенных животных, отобранных для создания терапевтических препаратов [6, 9]
Препарат Компания Биореактор Стадия подготовки препарата
АПуп (рекомбинантный антитромбин III человека) GTC Biotherapeutics Коза Европа: Одобрено EMEA США: одобрено FDA
Ингибитор С-1-эстеразы Pharming Кролик Фаза 3
ММ-093 (Альфа-фетопротеин) Merrimack and GTC Biotherapeutics Коза Фаза 2
Альфа-глюкозидаза Pharming Кролик США: Фаза 3, Европа: одобрено EMEA.
Гормон роста человека BioSidus Корова Предклиниче ские испытания
Альбумин GTC Biotherapeutics Корова Предклинические испытания
Фибриноген Pharming Корова Предклинические испытания
Коллаген Pharming Корова Предклинические испытания
Лактоферин Pharming Корова Предклинические испытания
Альфа-1 Антитрипсин GTC Biotherapeutics Коза Предклинические испытания
Малярийная вакцина GTC Biotherapeutics Коза Предклинические испытания
Моноклональные антитела CD 137 (4-1ВВ) GTC Biotherapeutics Коза Предклинические испытания
Список использованных источников
1. Differential H4 acetylation of paternal and maternal chromatin precedes DNA replication and differential transcriptional activity in pronuclei of 1-cell mouse embryos / P.G. Adenot [et al.] // Development. - 1997. - Vol. 124. - P. 4615-4625.
2. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs / R.L. Brinster [et al.] // Cell. -1981. - Vol. 27. # 1/pt2. - P. 223-231.
3. Relevance of BAC transgene copy number in mice: transgene copy number variation across multiple transgenic lines and correlations with transgene integrity and expression / K.J. Chandler [et al.] // Mamm. Genome. - 2007. - Vol. 18. - P. 693-708.
4. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA / J.W. Gordon [et al.] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1980. -Vol. 77. - P. 7380-7384.
5. Gordon, J.W. Transgenic Technology and Laboratory Animal Science / J.W. Gordon // LAR J. - 1997. - Vol. 38. - P. 32-41.
6. Kues, W.A. Advances in farm animal transgenesis / W.A. Kues, H. Niemann // Prev. Vet. Med. - 2011. - Vol. 102. - P. 146-156.
7. Le Saux, A. Chromosome integration of BAC (bacterial artificial chromosome): evidence of multiple rearrangements / A. Le Saux, L-M. Houdebine, G. Jolivet // Transgenic Res. -2010. - Vol. 19. - P. 923-931.
8. Pronuclear embryo yield in Caninder and Saanen goats for DNA microinjection/ R.R. Moura [et al.]// Reprod Dom Anim. -2010. - Vol. 45. - P.e101-e106.
9. Niemann, H. Application of transgenesis in livestock for agriculture and biomedicine / H. Niemann, W.A. Kues // Anim. Reprod. Sci. -2003. - Vol. 79. - P. 291-317.
10. Specific expression of an elastase-human growth hormone fusion gene in pancreatic acinar cells of transgenic mice / DM. Ornitz [et al.] // Nature. - 1985. - Vol. 13. - P. 600-602.
11. Sequence and chromosomal context effects on variegated expression of keratin 5/lacZ constructs in stratified epithelia of transgenic mice / A. Ramirez [et al.] // Genetics. - 2001. -Vol. 158. - P. 341-350.
12. A 3,387 bp 50-flanking sequence of the goat alpha-S1-casein gene provides correct
tissue-specific expression of human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) in the mammary gland of transgenic mice / IA. Serova [et al.] // Transgenic Res. - 2011. - Vol. 21. -P. 485-498.
13. Varmus, H. Retroviruses / H. Varmus // Science. - 1988. - Vol. 240. - P. 1427-1435.
14. Retroviruses / Eds. J.M. Coffin, S.H. Hughes, H.E. Varmus. - Cold Spring Harbor (NY), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.
Дата поступления статьи 29 сентбря 2014 г
