Трансфекция экзогенной ДНК клеток яйцевода кур Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

46

ТЕЗИСЫ

МАТЕРИАЛЫ XI ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЙ..

-------------1--------------1---------1-------------2---------------------------------------------

А.В. Самойлов , Н.В. Кирбаева , А.З. Кесян , Н.М. Сураева

ТРАНСФЕКЦИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК КЛЕТОК ЯЙЦЕВОДА КУР

1НИИ Биологии развития им. Н.А. Кольцова РАН, Москва 2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Трансгенная птица с тканеспецифичной экспрессией рекомбинантного белка в яйце является потенциальным продуцентом для широкомасштабного производства терапевтических препаратов. При этом в качестве тест системы генной конструкции по эффективности продукции рекомбинантного белка возможно использовать in vitro трансфецированные клетки яйцевода курицы.

Цель исследования. Отработка метода культивирования и трансфекции экзогенным геном первичных клеток яйцевода кур.

Материалы и методы. Из участка яйцевода курицы выделяли эпителиальные клетки. Для культивирования клеток яйцевода использовали культуральную среду DMEM с добавками. Трансфекцию клеток проводили, используя препарат для трансфекции «Lipofectamin® 2000», (Invitrogen, США). Для трансфекции клеток яйцевода применяли генную конструкцию на основе вектора pIRES EGFP2 (фирмы Clontech, США).

Результаты. Было изучено три способа выделения первичных клеток яйцевода кур. Хороший рост клеток отмечался только при получении клеток методом инкубации кусочка яйцевода курицы в растворе Трипсина-Версена при 38°С. При культивировании клетки представляли собой однослойную культуру, с четкими границами клеток, вытянутой формы, без выраженного ядра. Клетки пассировались кратно на протяжении 5 пассажей, при этом фенотипических свойств, клетки не меняли. После проведения трансфекции клеток было отмечено высокая эффективность экспрессии экзогенного гена в виде зеленого свечения гранул белка в клетках в ультрафиолетовом свете.

Выводы. В результате проведенных исследований впервые получена оригинальным методом и охарактеризована культура клеток яйцевода курицы. Подобраны условия условия трансфекции, с применением препарата для трансфекции - «Lipofectamin® 2000» полученной культуры, а также продемонстрирована экспрессия белка GFP в культуре трансфецированных клеток. Полученные результаты и разработанные подходы позволяют использовать культуру клеток яйцевода курицы для тестирования генных конструкций, применяемых для получения трансгенной птицы.

Е.В. Санарова, А.П. Полозкова, О.Л. Орлова, А.В. Ланцова, Н.А. Оборотова

РАЗРАБОТКА ПЛАНА ВАЛИДАЦИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ

ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ТИОСЕНСА

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН разрабатывается лиофилизированная липосомальная лекарственная форма (ЛЛЛФ) фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии - Тиосенса. Переход от лабораторного к серийному производству требует разработки плана валидации технологического процесса получения ЛЛЛФ.

Задачи исследования. Цель валидации технологического процесса получения ЛЛЛФ Тиосенса -подтвердить, что технологический процесс в пределах установленных технологическим регламентом параметров обладает повторяемостью и надежно производит готовый продукт, соответствующий требованиям ФСП.

Материалы и методы. При освоении новых технологий применяется перспективная валидация, состоящая из 4 этапов. На 1 этапе разрабатываются планы проведения экспериментов по стадиям процесса для определения критических параметров на каждой из них. 2 этап включает в себя согласование критических параметров стадий процесса и составление заключений. Проведение 3 этапа состоит из утверждения программы валидации процесса и производства не менее 3-х серий продукта в пределах установленных на 2 этапе исследования. Составление и утверждение протокола о валидации процесса происходит на 4 этапе валидации.

Результаты и выводы. На 1 этапе валидации составлен план эксперимента, включающий описание: стадий процесса/эксперимента, состава рабочей группы по валидации, контролируемых переменных, исходного сырья и материалов, контролируемых характеристик и свойств продукта/полупродукта, времени проведения экспериментов. На 2 этапе сформированы - план с заполненными формами, данные анализа и принятые значения параметров, изменения. На 3 этапе нарабатывали 3 серии ЛЛЛФ Тиосенса. 4 этап включал составление протокола валидации процесса, проведение оценки полученных данных и сравнение их с ожидаемыми, корректировку и формирование схемы постадийного контроля, принятие решения о статусе процесса производства (валидировано/не валидировано).

Работа выполнена в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» при финансовой поддержке Правительства г. Москвы.

№ 2/том 11/2012

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ