CC BY
50
контроль
УдК 663.432
Тонкослойная
гель-хроматография в анализе некоторых низкомолекулярных растительных белков
Е. В. Гурковская, канд. хим. наук, профессор; Е. В. Грузинов, д-р хим. наук, профессор Московский государственный университет технологий и управления им. К Г. Разумовского
Ключевые слова: лейкозин ячменного зерна; лейкозин ячменного
солода; тонкослойная гель-хроматография; эдестин.
Keywords: leikosin barley-corn; leikosin barley-molt; edestin; thing-layer chromatography.
Качественный и количественный состав белков ячменя сложен и непостоянен. Изменения его в процессе солодоращения и сушки приводят к обогащению солода азотистыми веществами с различной молекулярной массой, роль которых неоднозначна в пищевых технологиях.
Несмотря на то что белковые вещества образуют только незначительную часть экстракта сусла (от 3,1 до 5,6%), в ходе технологических процессов пивоварения они оказывают чрезвычайно большое влияние на экстрактивные вещества ячменя и солода, которые можно рассматривать как важнейшие составные части ячменя, влияющие на производственные процессы и качество конечного продукта.
Следовательно, пивоварение предъявляет особые требования как к общему содержанию белковых веществ, так и к соотношению отдельных азотсодержащих соединений. Ячмени с содержанием менее 9% белка дают пиво с низкой пенистостью, а более 12% согреваются при солодораще-нии. Поэтому в пивоваренных ячменях содержание белка должно быть от 9 до 12%. В последнее время требования к качеству пивоваренных ячменей указывают на прямую связь между фракционным содержанием белков в сырье и качеством готового продукта.
Степень белкового растворения, оцениваемая числом Кольбаха, также ухудшается с повышением содержания в ячмене белковых веществ. При неудовлетворительном белковом растворении ухудшается пенообразова-ние. Перерастворенный солод резко ухудшает пеностойкость пива и обе-
дняет его вкус. Содержание белков в солоде ниже 7,5% может привести к недостаточному сбраживанию сусла, плохой пенистости и стабильности пива, а также получению пива с пустым вкусом. Белковые фракции с молекулярной массой (ММ) в интервале 12 000-60 ООО коррелируют с пенным числом пива (г +0,93 или г +0,95), белковые фракции, имеющие молекулярную массу выше 60 000, коррелируют со стабильностью пены (-0,92) [1].
В настоящее время добиться точного разделения белковых веществ очень сложно, поскольку их внутренние химические структуры изучены недостаточно.
Молекулярная масса как физико-химическая константа белка
Предложенный метод тонкослойной гель-хроматографии (ТСГХ) позволяет изучить факторы, влияющие на молекулярно-массовое распределение (ММР) белков, выявить зависимость молекулярно-массовых соотношений и установить возможность прогностической оценки качества ячменного зерна, муки и солода по составу образующих их белков с позиций современных требований промышленных технологий и условий производства.
В данном случае молекулярная масса служит для идентификации белка, проявления его функциональной активности и суждения о его чистоте. Возможности определения молекулярных характеристик белков существенно расширяются при наличии линейной зависимости удерживаемого объема V. от логарифма ММ
биополимера ^ М.. В отличие от нелинейной такая связь позволяет рассматривать хроматограмму как зеркальное отображение молекулярно-массового распределения анализируемого образца в логарифмическом масштабе. В результате упрощается и ускоряется обработка хромато-графических данных и появляется возможность калибровки хромато-графической системы, что улучшает интерпретацию хроматограммы в ММР. В варианте ТСГХ вместо объема выхода V. длину пробега исследуемого вещества относят к пути, пройденному стандартным веществом, а точность определения ММ (по сравнению с анализом на колонках) компенсируют статистической обработкой повторных результатов ряда параллельных опытов [2, 3].
Предложена и разработана методика анализа низкомолекулярных белков лейкозина и эдестина ячменного зерна, муки и солода, определяющая качество исходного сырья и конечного продукта. Для ячменей получены рекомендации моделирования технологического процесса производства пива соответственно белковому составу, что позволяет повышать экономичность процесса пивоварения и улучшает ор-ганолептические показатели качества готовой продукции.
Вопросы пробоподготовки и идентификации исследуемых веществ
Выбранная система пробоподготовки обеспечивает хорошую воспроизводимость и селективность результатов (%). Обсуждение большого материала по аналитическому исследованию белков основывается на том выводе, что все исследованные образцы одинаковы по фракционному составу в качественном отношении. Различия заключаются в количественном соотношении фракций.
Фракционные белки ячменя и муки экстрагировали по модифицированной схеме Осборна: дистиллированной водой (6 мл); 10%-ным раствором хлорида натрия или 5%-ным раствором сульфата калия (3,5 мл); 70%-ным раствором этанола с предшествующей обработкой 40%-ным раствором этанола (по методу Полло-ка) с целью удаления антоцианогенов (3,0 мл) и 0,2%-ным раствором едкого натра (2 мл).
Фракционные белки солода экстрагировали: дистиллированной водой
40 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2012
Чонтроль КАЧЕСТВА
(5 мл); 10%-ным раствором хлорида натрия (3,5 мл); 70%-ным раствором этанола (3,5 мл); 0,2%-ным раствором едкого натра (3 мл) или 4 мл концентрированной аскорбиновой кислоты (10%-ный раствор).
Время экстракции на каждом этапе — 30-40 мин при температуре 22...50 °С (при получении фракций эдестина температуру повышали до 70 °С).
Суммарные белки экстрагировали 0,2%-ным раствором едкого натра в 50%-ном этаноле.
Для калибровки исследуемых белков по значению логарифма их ММ применяли белки-маркеры: инсулин цепи Б (6000), рибонуклеаза (13 700), химотрипсин (25 000), альбумин яичный (43 000), сывороточный бычий альбумин (68 000). Белки-маркеры растворяли в дистиллированной воде (0,2 мг белка в 0,05 мл воды) с добавлением 0,1н. НС1. Применяемые сорбенты — Сефадекс G-50, G-75, G-100, G-150, G-200 «суперфайн». В качестве элюирующих систем использовали дистиллированную воду (рН 7,0), слабые солевые растворы (8% №С1); фосфатно-буферные растворы (рН 9,1; рН 8,5; рН 8,0; рН 6,8; рН 5,8; рН 4,5) [4]. Результаты разделения переснимали на хроматографическую бумагу Filtrak FN PN 7, Filtrak FN PN 3 (Германия), Watman 3 ММ с последующим детектированием белков 0,02%-ным раствором «Амидочерный 10Б в смеси этанол : уксусная кисло-
та : вода (5 : 4 : 1). Бумажные реплики высушивали в сушильном шкафу при температуре 120 °С в течение 5-10 мин, а затем отмывали в той же смеси без красителя.
Количественную оценку осуществляли на денситометре «Ден-Скан 1», сканнерах «Shimadzy CS-920», «Са-та^2» [1, 2].
Лейкозины и эдестины ячменя
До настоящего времени исследование ячменя методом ТСГХ не проводили, хотя отмечена необходимость изучения фракционного белкового состава зерна в процессе пивоварения, так как ТСГХ имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами анализа и достигает большой чувствительности при оптимизации условий разделения, что исключительно важно в контроле за технологическим процессом [1, 4].
Следует отметить, что при разделении эдестинов (глобулинов) с помощью электрофореза на четыре компонента наблюдаются большие различия по ММ: а-глобулин 26 000, Р-глобулин 100 000, у-глобулин 166 000, 5-глобулин 300 000. Особое значение в технологии изготовления пива придают р-глобулину, непосредственно влияющему на биологическую стабильность пива (холодное помутнение). То, что глобулины имеют очень низкую изоэлектрическую точку (рН 4,9), которая при варке сусла обычно не достигается, а также высокое со-
_р_ш.
в 1Г& ЦШг ж-
^ г I ^
№
*
Щ
- § *
'Ж--
III
л ■'й-'.'
Рис. 1. Хроматограммы:
а — эдестинов ячменного зерна сортов
Р — Рудик, Ю — Юбилант, Б — Биос-1, К — Крона; б — суммарных белков пива сортов
П — Пльзень, Ж — Живец, М — Московское; в — лейкозинов (муки, солода, зерна)
держание серы, может явиться причиной появления мути в разлитом в бутылки пиве. С помощью ТСГХ на G-50 в лейкозине зерна обнаружили 7 низкомолекулярных фракций с ММ от 3500 до 36 000, а в лейкозине муки — 5 фракций с ММ от 6000 до 30 000. В лейкозине солода — 8 фракций (в зависимости от рН элюента) с ММ соответственно от 2600 до 27 000, в эдестине — 7 фракций с ММ от 3300 до 31 000. На G-75 получено 10 фракций лейкозина зерна с ММ от 4600 до 6800; 9 фракций лейкозина ячменной муки с ММ от 5600 до 7500 и 7 фракций лейкозина солода с ММ от 3600 до 24 000 [1, 4].
На рис. 1 представлены хромато-граммы низкомолекулярных белков — эдестинов сортовых ячменей, суммарных белков пива и лейкозинов зерна, муки и солода.
Данные хроматографического анализа эдестинов позволили выявить сортовые особенности зерна ячменя. Сорт Юбилант показал присутствие всего одной белковой фракции с ММ 18 000, тогда как для других сортов оказалось характерным наличие как минимум двух фракций белка с ММ > 10 000. Все сорта показали не менее двух фракций в диапазоне ММ 26 000-28 000, а это отвечает определенному методом центрифугирования а-компоненту эдестина с ММ 26 000 [5].
Результаты разделения ^-200, элюент — фосфатный буфер, рН 8,5, р = 20°, t = 180 мин) показали: шесть-восемь фракций эдестина с ММ от 7000 до 17 000 для сорта Биос-1; шесть фракций с ММ от 6800 до 12 400 для сорта Рудик; семь фракций с ММ от 6400 до 18 000 для сорта Юбилант и восемь фракций с ММ от 6600 до 16 600 для сорта Крона. Фракции эдестинов с ММ > 20 000 для этих сортов обнаружены не были (рис. 2).
Анализируя полученные результаты, можно сказать, что присутствие низкомолекулярных фракций белков и пептидов характерно для солода. С целью изучения высокомолекулярных фракций солерастворимых белков зерна ячменя — глобулинов, носящих видовое название эдестинов, известных в литературе как р-, у-, и 5-компоненты (ММ > 10000) [4, 6], непосредственно влияющих на биологическую стабильность пива, проводили разделение исследуемых сортов в оптимальных условиях элюирования ^-200, элю-
б
а
в
5 • 2012 ПИВО и НАПИТКИ 41
контроль КАЧЕСТВА"
ент — фосфатный буфер, рН 8,0, Р = 20°, t = 180 мин) по величине молекулярных масс (рис. 3).
Результаты показали: наличие восьми фракций эдестина с ММ от 7000 до 17 000 для сорта Биос-1; шести фракций с ММ от 6800 до 12 400 для сорта Рудик; семи фракций с ММ от 6400 до 18 000 для сорта Юбилант и восьми фракций с ММ от 6600 до 166 000 для сорта Крона. Фракции эдестинов с ММ > 20 000 для этих сортов обнаружены не были.
При анализе эдестинов в нейтральной и слабощелочной средах была обнаружена хроматографическая зона в виде яркого пятна на стартовой линии для каждого из сортов ячменя, что позволяет предположить наличие высо-кополимеризованных эдестинов в исследуемых нами образцах, известных в литературе как нативные эдестины с ММ в пределах 15 000-20 000 [5].
Именно в процессе солодоращения белки расщепляются ферментными комплексами до низкомолекулярных
1,61,41,2-
сорт Биос-1 (восемь фракций) сорт Рудик (восемь фракций)
4,5 5,0 [og ММ
сорт Юбилант (девять фракций) сорт Крона (девять фракций)
R г;.™ 1,8
Рис. 2. Фракционный состав лейкозинов сортовых ячменей,
определенный по логарифму ММ зависимости от относительной длинны пробега R на G-200, рН 8,5, р = 20°, t=180 мин
■ сорт Биос-1 (шесть фракций) сорт Юбилант (четыре фракции) • сорт Рудик (пять фракций) • сорт Крона (шесть фракций)
Рис. 3. Фракционный состав лейкозинов эдестинов ячменей,
определенный по логарифму ММ зависимости от относительной длинны пробега R на G-200, рН 8,5, р = 20°, t=180 мин
компонентов и аминокислот, которые служат строительным материалом для развивающегося зародыша и отвечают за стабильность пива и полноту вкусовых качеств. Полученные результаты обладают надежностью, воспроизводимостью и качественной значимостью, позволяющей использовать их в исследованиях белков при оценке их ММ, отвечающих за качество продукции [4].
В табл. 1 представлены сравнительные данные разделения лейкозина и эдестина ячменя методом ТСГХ и физико-химического анализа. Анализ данных позволяет утверждать, что, применяя ТСГХ, можно достичь разрешения, сопоставимого с результатами совместного действия колоночной ГПХ и электрофореза по отношению к водорастворимым фракциям белка зерна ячменя (определено до 23 фракций). В дальнейших исследованиях было установлено, что ТСГХ позволяет определить ММ высокомолекулярных фракций эдестина, гордеина и глютелина, что вызывало затруднения в колоночной ГПХ и осуществлялось исключительно электрофоретическим методом (гордеин). Как показали эксперименты, удачная комбинация ТСГХ и материаловедческих тестов подчеркнула выгодную особенность предлагаемого метода [4].
Количество низкомолекулярных фракций в солоде (ММ < 15 000) увеличивается в 3-4 раза. Заметно снижается содержание высокомолекулярных гордеинов, которые в ячменном зерне определяли в диапазоне ММ 30000-100000, а в солоде с преобладающим значением ММ до 30 000 [4].
Количественная характеристика фракционных белков ячменя, ячменной муки и солода
Полученные результаты качественного и количественного анализа белковых комплексов ячменя, муки и солода показывают перспективные возможности метода тонкослойной гель-хроматографии для изучения, контроля и управления биохимическими и технологическими процессами пивоварения [6]. Сопоставление результатов анализа фракционного разделения позволяет утверждать, что при прорастании зерна качественное соотношение белковых фракций смещено в сторону низкомолекулярных фракций. В ячменном зерне установлено наличие фракций пептидов с ММ от 2500 до 3600 [5].
42 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2012
г
Таблица 1
Метод исследования Лейкозины Эдестины
Количество фракций Молекулярная масса Количество фракций Молекулярная масса
Осаждение сульфатом аммония; электрофорез и ультрацентрифугирование (Квенцель) — — 4 а-Глобулин 26 000 р-Глобулин 100 000 у-Глобулин 166 000 5-Глобулин 300 000
Изоэлектрофокусировка Радола, Драверт, Голикова 20 Определение вели в градиенте плотностей в области значений рН 3-10. ММ не указаны
Колоночная гель-фильтрация с последующим определением оптической плотности (Нарцисс) 5 2600 4600 12 000 30 000 60 000 — —
Ультрацентрифугирование (Лундин, Сведберг) 3 35 000 — 21 500
Гель-хроматография (колоночный вариант) (Колчин) 6* <20000 20 000-40 000 40000-80000 80000-160000 >160000 — —
Метод ТСГХ G-50 (наши данные) 10 < 6000 6000-15000 15000-30000 > 30 000 6 < 6000 6000-15000 15000-30000 >30000
G-75 (наши данные) 16 < 6000 6000-15 000 15000-30000 30 000-60 000 > 60000 6 6000-15000 15000-30000 30 000-60 000 >60000
G-100 (наши данные) 16 < 6000 6000-15 000 15000-30000 30000-60000 60 000-100 000 > 100 000 9 6000-15000 15000-30000 30000-60000 60 000-100 000 > 100 000
G-200 (наши данные) 14 < 6000 6000-15 000 15000-30000 30000-60000 60 000-100 000 > 100 000 Макс. ММ 180 000 10 6000-15000 15000-30000 30000-60000 60 000-100 000 > 100 000 Макс. ММ 290 000
"Дальнейшее разделение проводили по величине изоэлектрической точки.
Разделение фракционных белков зерна на сефадексе G-100 при оптимальных условиях разделения (рН 8,5; Р = 20°) позволило обнаружить девять фракций лейкозина с ММ в пределах от 6700 до 76 000; шесть фракций эде-стина с ММ от 6700 до 16 600; запасные белки зерна разделились: горде-ин — на семь фракций с ММ от 9500 до 170000, глютелин — на пять фракций с ММ от 8000 до 160 000.
В тех же условиях проводили разделение белков ячменной муки. Водо- и солерастворимые белки разделились на восемь и шесть фракций в диапазоне ММ 6800-7200 для лейкозина и 8000-13 500 для эдестина. Гордеин разделился на семь фракций с ММ от 10 000 до 14 000, глютелин — на пять фракций с ММ от 80000 до 120000.
Анализ белковых фракций солода на сефадексе G-75 в оптимуме усло-
вий разделения (р = 15°, время элюи-рования t = 120 мин, элюент — фосфатный буферный раствор, рН 5,8) представил 10 фракций лейкозина с ММ от 4800 до 17 000 и семь фракций эдестина с ММ от 6300 до 38 000. Спирто- и щелочерастворимые белки разделились: гордеин — на шесть фракций с ММ от 25 500 до 86 000; глютелин — на пять фракций с ММ от 46 600 до 78 000 [4, 6].
Процесс солодоращения характеризуется не только увеличением количества низкомолекулярных фракций белка и пептидов, но также распадом высокомолекулярных запасных белков (ММ >100 000), количество которых уменьшается с 14% в зерне до 4% в солоде. Заметно снижается содержание высокомолекулярных гордеинов, которые в ячменном зерне определяли в основном в диапазоне ММ 30 000-
100000, а в солоде определяли гордеи-ны с преобладающим значением ММ до 30000.
Количественные характеристики молекулярного состава фракционных белков ячменя, муки и солода представлены в табл. 2, 3 и 4. Как было сказано выше, при солодоращении полностью исчезают высокомолекулярные фракции эдестина ММ > 100 000, а количество низкомолекулярных фракций с ММ < 150 00 увеличивается в 3-4 раза.
Таким образом, по существу результатов анализа растительных низкомолекулярных белков методом ТСГХ установлена возможность прогностической оценки качества ячменного зерна, муки и солода по составу образующих ее белков, связанных с макромолекулярными компонентами злаков и получаемого из них сырья.
5 • 2012 ПИВО и НАПИТКИ 43
контроль КАЧЕСТВА
Таблица 2
Молекулярная Зерно
масса Лейкозин, % к общ. Эдестин, % к общ. Гордеин, % к общ. Глютелин, % к общ.
< 6000 9,6 — — —
6000-15000 18,2 14,4 5,7 4,7
15000-30000 32,3 38,7 17,4 21,1
30 000-60 000 23,6 14,8 31,6 18,2
60 000-100 000 16,3 23,8 25,7 33,2
> 100 000 — 8,3 19,6 12,8
Таблица 3
Молекулярная Мука
масса Лейкозин, % к общ. Эдестин, % к общ. Гордеин, % к общ. Глютелин, % к общ.
< 6000 6,2 — — —
6000-15000 11,3 12,1 3,1 2,0
15000-30000 37,8 30,2 15,2 20,3
30 000-60 000 28,7 19,1 34,3 19,6
60 000-100 000 16,0 27,9 27,3 36,7
> 100 000 — 10,7 20,1 11,4
Таблица 4
Молекулярная Солод
масса Лейкозин, % к общ. Эдестин, % к общ. Гордеин, % к общ. Глютелин, % к общ.
< 6000 29,6 30,4 — —
6000-15000 24,7 16,8 23,1 26,7
15000-30000 26,3 31,2 29,8 38,9
30 000-60 000 11,9 8,8 24,6 16,8
60 000-100 000 7,5 12,8 14,3 23,6
> 100 000 — — 8,2
Исследования белков в пивоваренных ячменях, муке и солоде выявили закономерности сортовых различий, что позволяет контролировать качество исходного растительного сырья и моделировать технологический процесс получения пива соответственно анализу белкового состава и управлять им в зависимости от полученных белковых характеристик. Присутствие белков со значением молекулярных масс в диапазоне от 2800 до 32 000 указывает на закономерность изменения технологического процесса, а выявленные высокомолекулярные белки оказывают существенное влияние на потери в технологическом процессе и в конечном итоге на качество готового продукта.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что ТСГХ можно эффективно применять на всех стадиях товароведения для экспертных оценок растительного сырья, промежуточной и готовой продукции, при хранении и переработке как в зерноперерабатывающей, пивобезал-когольной промышленности, так и в смежных отраслях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гурковская, Е. А. Исследование белков злаков в условиях тонкослойной эксклюзионной хроматографии (Обзор)/Е. А. Гурковская // Сорбционные и хроматографические процессы. — 2006. — Т. 6. — Вып. 4. — С. 503-545.
2. Гурковская, Е. А. Особенности тонкослойной хроматографии полимеров (Обзор)/Е.А. Гурковская // Прикладная химия. — 2008. — № 3. — Т. 81. — С. 374-383.
3. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков // Пер. с англ. Ю. Б. Алахова, Ц. А. Егорова; под ред. Ю. А. Овчинникова. — М.: Мир, 1974.
4. Гурковская, Е. А. Исследование макромо-лекулярных компонентов злаков в тонкослойной эксклюзионной хроматогра-фии/Е. А. Гурковская // Сорбционные и хроматографические процессы. — 2006. — Т. 6. — Вып. 6. — Ч. 4. — С. 1381-1392.
5. Голикова, Н.В. Белки в пивоварении/Н. В. Голикова. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.
6. Гурковская, Е. А. Исследование влияния сортовых особенностей на качественный и количественный состав белков ячменя, муки и солода в ТСЭХ/Е. А. Гурковская // Сорбци-онные и хроматографические процессы. — 2006. — Т. 6. — Вып. 4. — С. 606-611. &
ООО «Корона Поволжья»
Пивоваренная компания ООО «Корона Поволжья» была открыта в городе Волгограде в 2002 г. Завод оснащен современным оборудованием (производитель — фирма из Венгрии), позволяющим варить высококачественное пиво круглосуточно. Весь процесс пивоварения контролируется и управляется автоматическим центральным пультом.
Предоставленная классическая немецкая технология производства пива, высококачественный солод, лучшие сорта чешского, немецкого ароматного и горького хмеля придают пиву легкий насыщенный вкус с приятной легкой хмелевой горечью.
В отличие от других пивоваренных заводов наша компания не использует в приготовлении пива другое сырье, кроме солода, хмеля, дрожжей, что гарантирует высокое качество и чистый вкус выпускаемой нашей компанией продукции.
В 2007 г. на пивоваренном заводе была проведена модернизация оборудования для увеличения производительности и качества выпускаемой продукции.
На предприятии работают квалифицированные технологи, прошедшие обучение и стажировку на европейских пивоваренных заводах.
На заводе имеется оснащенная современным оборудованием лаборатория, которая ежедневно занимается контролем технологического процесса и выпускаемой продукции, следит за микробиологическими и санитарными нормами пива, что гарантирует чистоту и качество продукта, отпускаемого в реализацию.
44 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2012
