CC BY
150
А СТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 1 (35) 2016. с. 28-35.
УДК 582.232
ТОКСИНЫ И ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИЯМИ В ВОДОЕМАХ ЛЕНИНГРАДСКОЙ
ОБЛАСТИ
Людмила Николаевна Волошко Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
l:vol.osh.ko@.in.box.ru
Ленинградская область, водоемы, «цветение» воды, цианобактерии, биологически активные вещества, токсины.
Анализ экстрактов биомассы «цветение» воды в водоемах(Ленинградской обл. с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) выявил высокое разнообразие гепатотоксичных циклических пептидов (микроцистинов) и ингибиторов ферментов (цитотксинов). Микроцистины вызывают острое отравление животных и людей. Полученные результаты указывают на антропогенную эвтрофикацию водоемов и опасное снижение качества воды.
CYANOBACTERIAL TOXINS AND THE OTHER BIOACTIVE COMPOUNDS IN WATER BODIES OF THE LENINGRAD REGION
Ludmila N. Voloshko Komarov Botanical Institute RAS l.voloshko@inbox.ru
Leningrad region, waterbodies, water blooms, cyanobacteria, bioactive compounds, toxins
HPLC of the extractsin selected samples from the lake revealed a high diversity of toxins, including hepatotoxic cyclic peptides (microcystins) and inhibitors of enzymes (cytoxins). Microcystins cause acute poisoning of animals and humans and act as tumor promoters. The results specify on anthropogenic eutrophication of the lake and dangerous decrease in quality of the water.
В последние десятилетия в водоемах северо-запада России наблюдаются резкие изменения состава водных биоценозов, в том числе массовое развитие цианобактерий [13, 14, 15]. Как правило, цианобактериальное цветение воды сопровождается выделением и накоплением биологически активных веществ и токсинов, представляющих опасность для человека и животных [3, 5]. В Англии, Норвегии и Финляндии токсические цветения озер рассматривают в качестве национальной проблемы; здесь созданы специальные центры для их изучения и контроля. Изучение массового развития цианобактерий в водоемах Ленинградской области еще в 1990-х гг. показало, что токсические цветения цианобактерий в этом регионе широко распространены и исследование степени их опасности перспективно [14, 15].
Методы исследований
Выполнение исследований базируется на значительном опыте работы в области культивирования цианобактерий и исследования их роли в биоценозах водоемов [1; 3; 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 26, 27, 28, 29, 30].
Отбор проб. В 2000-х гг. сбор материала проводился в Нижнем Суздальском, Ладожском и Красном озерах, а также в Невской губе Финского залива Балтийского моря [4, 6, 28, 29,.] с помощью планктонной сетки (газ №78) во время цветения воды. Для сбора
биомассы профильтровывался слой воды с глубины 1 м до поверхности. Концентрированную биомассу лиофильно высушивали при -70 °С.
Выделение культуры цианобактерий. Чистые культуры Planktothrix agardhii CALU 1306 из Нижнего Суздальского озера и Microcystis aeruginosa CALU 1018 из Невской губы выделили из проб воды методами предельного разведения и истощающего мазка.
Экстракция токсинов. Лиофилизированная биомасса цветений и лабораторного штамма (200 мг) экстрагировалась 70 %-ным водным метанолом (6 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Экстракт центрифугировали при 4000 g в течение 1 мин и затем использовали для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Результаты
Микроцистины. HPLC экстрактов лиофилизированной биомассы планктонных проб и культивируемых штаммов Planktothrix agardhii CALU 1306 и Microcystis aeruginosa CALU 1018 выявил 9 структурных вариантов микроцистинов с LD50 обычно от 50 до 300 мкг кг-1 (Табл.). Особенно токсичным считается микроцистин LR и LA с ЛД50 =50 мкг-кг-1 веса мышей. Наименее токсичен микроцистин RR c ЛД50 =1000 мкг кг-1. По патологическому эффекту и химическим свойствам микроцистин близок к термостабильному токсину бледной поганки [10, 11].
Большинство структурных вариантов микроцистинов высоко токсичны. Однако в природе встречаются и нетоксичные варианты, у которых изменено пространственное или химическое строение аминокислот, обеспечивающих связь с каталитическим центром фосфатаз. В молекуле микроцистина LR аминокислоты Adda, Masp и глютамат ответственны за ингибирование фосфатазы, а аминокислота Mdha необходима для вторичного ковалентного связывания с ферментом. Стереохимическое изменение аминокислоты Adda и ацилирование глютамата молекулы токсинов делает их практически нетоксичными [23]. Линейные микроцистины и нодулярины в 100 раз менее токсичны по сравнению с их циклическими эквивалентами. Возможно, они являются продуктами бактериального разрушения токсинов. Всемирная организация здоровья (ВОЗ) установила допустимую концентрацию микроцистинов в воде — 1 мкг-л-1 [20].
Табл. 1.
Состав токсинов, синтезируемых цианобактериями в водоемах Ленинградской обл.
Молекулярная масса аддукта [М+И]+ Токсины фект Водоемы
1 2 3 4
Гепатотоксичные циклические пептиды (микроцистины)
909 Микроцистин ЬА ЛДз0 =50 мкг кг-1 Т - - + +
967 ^-АБр3, БИа] микроцистин ЬЯ Т - + - -
969 dMeLW микроцистин Т - + + -
972.5 Микроцистин УБ Т - + - -
981 [DMAAdda5] микроцистин-ЬЯ ЛД50 =90-100 мкг кг-1 Т + - + -
987.5 Микроцистин ЬБ Т - - - +
992 Микроцистин N15dMeLR Т - + - -
995.4 Микроцистин ЬЯ ЛД50 =50 мкг кг-1 Т + + + -
1007 [d-Asp3,ADMAdda5] микроцистин LR ЛДз0 =160 мкг кг-1 Т - - + -
1037 Микроцистин ЯЯ ЛД50 =300 мкг кг-1 Т - + - -
Прочие низкомолекулярные биологически активные пептиды (цитотоксины)
Линейные пептиды
605.6 Эругинозин 298-A Т1; ТЫ + - - -
609 Микрогинин 91-В Р1 - - - +
714 Микрогинин БЯ1 Е1 - - + -
917 Микрогинин 51-A Р1 - + - -
Циклические пептиды
609 Микроцин 8Б608 Р1 - + - -
315 Калотриксин AT - - + -
742 Ностогинин BN741 Р1 - - - +
828.4 Анабенопептин Б Р1 + - -
837 Анабенопептин В Р1 + -
844.6 Анабенопептин A Е1 + - - +
851.6 Анабенопептин Б Р1 + + - +
858.5 Осцилламид У Р1 + + - -
915 Нодулапептин В Р1 - + - -
981 Сциптолин A Е11 - - + -
884 Микропептин 88^ СИТ1 + + - -
909.5 Микропептин 8Б 909 Р1 + - -
1011 Микропептин Т-20 СИТ1 - + + -
1028 Осциллапептилид 97-В Р1 + - -
1046 Осциллапептилид 97-A Р1 + + - -
1062 Планктопептин ВЬ 1061 Р1 - + - -
1073 Эругинопептин 917S-A Р1 - + - -
Все цианобактер ии Эндотоксины Липоплисахариды Б + + + +
Обозначения: 1— Невская губа Финского залива, 2 — Ладожское оз., 3 — Красное оз., 3 — Нижнее Суздальяское оз.; Т - токсин, Р1 -ингибитор протеазы, СИТ1 - ингибитор химотрипсина, Е1 - ингибитор ферментов, Е11 - ингибитор эластазы, Т1 — ингибитор трипсина, ТЫ — ингибитор тромбина, АТ — антиканцерогенный эффект; Б — воспалительные агенты кожи и желудочно-кишечного тракта; [Ы+И]+— молекулярная масса аддукта (протонированного пептида); — токсин отсутствует.
Канцерогенное действие токсинов цианобактерий
Микроцистины разрушают клетки печени и в тяжелых случаях приводят к раку. В гепатоцитах и клетках печени крыс микроцистин-LR и нодулярин активируют экспрессию протоонкогенов (генов «раннего ответа») c-jun и c-fos, c-H-ras гена, а также фактора некроза опухоли а (TNF-а) - цитокина, играющего решающую роль в процессе опухолеобразования [21]. Гепатотоксины, ингибируя действие фосфатаз, нарушают в гепатоцитах баланс процессов фосфорилирования, осуществляемых киназами, и дефосфорилирования, осуществляемых фосфатазами. Поскольку баланс процессов фосфорилирования и дефосфорилирования регулирует функции структур цитоскелета (промежуточных филаментов и микрофиламентов), то нарушается и система формирования и диссоциации цитоскелетного каркаса гепатоцитов. Токсины действуют таким образом, что в клетке начинают преобладать процессы гиперфосфорилирования, т.е. диссоциации структур цитоскелета. В итоге в клетках печени разрушается цитоскелет, гепатоциты сморщиваются, теряют контакт друг с другом и с синусоидальными капиллярами, и отделяются друг от друга. Отходят друг от друга и клетки сосудов, что приводит к кровоизлиянию внутрь печени. Скопление крови в межклеточных пространствах печени может вызвать смерть через несколько часов или несколько дней из-за развившейся печеночной недостаточности [10, 11].
Прочие низкомолекулярные биологически активные пептиды (цитотоксины)
Цианобактерии синтезируют биологически активные вещества, токсичные для других бактерий, водорослей и зоопланктона, которые в то же время могут быть основой медицинских препаратов с антиопухолевым, антивирусным, антибиотическим и антифунгальным эффектом [23]. Среди них можно отметить депсипептиды (пептиды со сложной эфирной связью), циклические и линейные пептиды. Хотя некоторые из них являются ингибиторами протеаз, биологическая активность большинства из них еще неизвестна (Рис. 1-2; Табл.).
В экстракте биомассы цветений были зафиксированы 7 вариантов циклических депсипептидов (криптофицинов), содержащих 3-амино-6-гидрокси-2-пиперидон (Ahp). Они были выделены из токсичных и нетоксичных штаммов Microcystis, Oscillatoria, Anabaena и Nostoc. Ряд соединений этого класса не являются биологически активными, но некоторые из них оказывают ингибирующие воздействие на сериновые протеазы и тирозиназы [18]. Идентифицированный нами в биомассе цветения в Красном оз. [6]. криптофицин Калотрипсин A, ранее изолированный из Nostoc sp., перспективен в качестве антиракового препарата [25]. К числу циклических пептидов, найденных в водоемах Ленинградской обл., относятся анабенопептины A, B, D, F — девятнадцатичленные циклические пептиды синтезируемые токсичными штаммами Anabaena, Oscillatoria, Nodularia spumigena и Microcystis [18]. Так, например, Anabaena flos-aquae NRC 525-17 синтезирует анабенопептины А и В (843 и 836 Да) наряду с микроцистинами и анатоксином-а(с). Уникальной структурной чертой анабенопептинов является наличие уреидо-группы и -амидной связи между D-лейцином и С-терминальным L-фенилаланином [18]. Из циклических пептидов в экстракте биомассы цветений отмечены также ингибиторы неизвестных ферментов — Микроцин SF608, Ностогинин BN741, Осцилламид Y и Нодулапептин (Табл.).
Линейные депсипептиды, эругинозины, с уникальным аминокислотным участком (2-карбокси-6-гидрокси-октагидроиндол). В настоящее время известны семь вариантов эругинозинов (1022-1149 Да) [18], которые продуцируют токсичные и нетоксичные штаммы Microcystis. В экстракте биомассы цветений и штаммов зафиксирован эругинозин 298-A, который ингибируют сериновые протеазы, трипсин и тромбин.
Кроме того, в экстракте биомассы цветений отмечены три структурных варианта микрогининов (91-B; FR1; 51-A) — линейных пептидов, впервые выделенных из нетоксичного штамма M. аeruginosa (574-930 Да). Микрогинины ингибируют различные ферменты — протеазы и ангиотензиназу (ЛК50 =7 мкг-мл-1).
Рис. 1. Низкомолекулярные биологически активные циклические пептиды (криптофицины): А — депсипептид с ЛИр-участком; Б — девятнадцатичленный циклический пептид (анабенопептин А) [18].
Рис. 2. Низкомолекулярные биологически активные линейные пептиды: А - линейный депсипептид (эругинозин 298-А); Б — линейный пептид (микрогинин) [18].
В биомассе цветений несомненно содержатся липополисахариды цианобактерий (ЛПС), которые являются эндотоксинами [12]. Они пирогенны и токсичны, могут вызывать кожные раздражающие и аллергические реакции у человека и животных. Ирритантный эффект дает жирная кислота, входящая в состав липида А, входящего в ядро (кор) молекулы ЛПС. Зарегистрированы случаи вспышек воспалительных реакций и гастроэнтеритов в ответ на воздействие цианобактериальных ЛПС. После отмирания цианобактерий наружная мембрана клеточной оболочки разрушается и липополисахариды попадают в воду. ЛПС всех грамотрицательных бактерий входят в состав экзоплазматичеческого полумембранного листка внешней мембраны и имеет общую структуру из четырех ковалентно связанных сегментов: поверхностного углеводородного полимера [9]. (О-специфичная цепь) внешнего олигосахаридного кора, внутреннего олигосахаридного кора и ацилированного гликолипида (гликолипида А) (Рис. 3). О-специфичная цепь наиболее вариабельна и отвечает за серологическую специфичность, в то время как липид А, который закрепляет молекулу ЛПС во внешней мембране, отвечает за их биологическую активность. При снижении в липиде А остатков жирных кислот с 6 до 5, при укорочении и появлении в его ацилированных цепях ненасыщенных связей, токсичность ЛПС снижается или пропадает.
Рис. 3. Схема общей структуры липополисахаридов грамотрицательных бактерий [24].
Таким образом, эвтрофикация водоемов и массовое развитие цианобактерий привели к повышению содержания токсинов в водоемах Ленинградской обл. В экстракте биомассы
цветений исследованных водоемов идентифицированы 9 структурных вариантов опасных биотоксинов-микроцистинов. Определен также состав цитотоксинов — ингибиторов ферментов, которые могут вызывать воспалительные явления у человека. В тоже время, цитотоксины могут быть источником ценных лекарственных средств, в том числе и против рака. Для того, чтобы минимизировать последствия цветения воды необходим эффективный экологический мониторинг водоемов региона, в том числе контроль факторов среды, вызывающих эвтрофикацию.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственного задания согласно тематическому плану Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН» по теме № 0120125605 и программы Президиума РАН: программа РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития». Подпрограмма «Биоразнообразие: состояние и динамика».
Литература
1. Волошко Л.Н., Титова Н.Н., Гаврилова О.В., Бедягина О.М., Громов Б.В. Исследование Oscillatoria agardhii Gom. в культуре // Альгология. — 2002. — Т. 12, №1. — С. 24—33.
2. Волошко Л.Н. Токсины и другие биологически активные вещества цианобактерий / Экологическая школа в г. Петергофе — Наукограде Российской Федерации: Проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения // Матер. регион. молод. научн. конф. СПб, Старый Петергоф, СпбГУ: Золотое сечение. — 2007. — С. 19—30.
3. Волошко Л.Н., Плющ А.В., Титова Н.Н. Токсины цианобактерий Cyanophyta, Cyanobacteria) // Альгология. — 2008. — Т. 18, № 1. — С. 3—20.
4. Волошко Л.Н., Пиневич А.В., Копецкий И., Титова Н.Н., Хроузек П., Зелик П. Продуцируемые цианобактериями токсины в период «цветения» воды в Нижнем Суздальском озере (Санкт-Петербург, Россия) // Альгология. — 2010. — Т. 20, №2. — С. 210—233.
5. Волошко Л.Н., Пиневич А.В. Разнообразие токсинов цианобактерий // Астраханский вестник экологического образования. — 2014 а. — № 1 (27). — С. 68—80.
6. Волошко Л.Н., Копецкий И., Хроузек П. Токсичные цианобактериальные «цветения» в Красном озере (Ленинградская обл., Россия) // Астраханский вестник экологического образования. — 2014 б. — № 2 (28). — С. 24—36.
7. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В. Цианобактериальные «цветения» в Финском заливе Балтийского моря // Астраханский вестник экологического образования. — 2015 а. № 2 (32). С. 65—73.
8. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В. Экология золотистых водорослей (Chrysophyta) и «цветение» воды // Астраханский вестник экологического образования. — 2015 б. — № 3 (33). — С. 23—27.
9. Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов: Учебник. В 3 т. Том 1. — СПб.: Изд. СПбГУ. — 2006. — 352 с.
10. Carmichael W.W. The toxins of cyanobacteria // Sci. Amer. — 1994. — 270, No 1. — P. 78—86.
11. Carmichael W.W. The cyanotoxins // Adv. Bot. Res. — 1997. — 27. — P. 211—256.
12. Codd G.A., Lindsay J., Young F.M., Morrison L.F., Metcalf J.S. From mass mortalities to management measures // Harmful Cyanobacteria. — Netherlands: Springer, 2005. — P. 1-25.
13. Drabkova, V., Rumyantsev, V., Sergeeva, L. V., Slepukhina, T.D.. Ecological problems of Lake Ladoga, causes and solutions // Hydrobiologia, — 1996. — V. 322 — P. 1—7.
14. Gromov B.V., Vepritsky A.A., Mamkaeva K.A., Voloshko L.N. A survey of toxicity of cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and adjacent water bodies // Hydrobiologia. — 1996. — V. 322. — P. 149—151.
15. Gromov B.V., Mamkaeva K.A., Voloshko L.N. Several cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and adjacent waters // In: Proceed. Second Intern. Lake Ladoga Symposium. — Joensuu: Joensuu yliopisto, Finland. — 1997. — P. 120—122.
16. Hrouzek P., Tomek P., Lukesova A., Urban J., Voloshko L., Pushparaj. B., Stefano V., Lukavsky J., Stys D., Kopecky J. Cytotoxicity and secondary metabolites production in terrestrial Nostoc strains, originating from different climatic/geographic regions and habitats: Is their cytotoxicity environmentally dependent? // Environmental Toxicology. — 2011. — Т. 26, №4. — P. 345—358
17. Hrouzek P., Kapuscik A., Vacek J., Vorácová K., Paichlová J., Kosina P., Voloshko L., Ventura S., Kopecky J. Cytotoxicity evaluation of large cyanobacterial strain set using selected human and murine in vitro cell models // Ecotoxicology and Environmental Safety. — 2016. — V. 124. — P. 177—185.
18. Namikoshi M., Rinehart K.L. Bioactive compounds produced by cyanobacteria // J. Industr. Microbiol. Biotechn. 1996. — 17. — P. 373-384.
19. Pinevich A.V., Mamkaeva K.A., Titova N.N., Gavrilova O.V., Ermilova E.V., Kvitko K.V., Pljusch A.V., Voloshko L.N., Averina S.G. St. Petersburg culture collection (CALU): four decades of storage and research with microscopic algae, cyanobacteria, and other microorganisms // Nov Hedw. 2004. — 79 (1-2). P. 115—126.
20. Rantala, A., Fewer, D.P., Hisbergues, M., Rouhiainnen, L., Vaitomaa, J., Börner, T. and Sivonen, K. Phylogenetic evidence for the early evolution of microcystin synthesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2004. — 101, No 2. — P. 568—573.
21. Suganuma M., Okabe, S., Marino, M., Sakai, A., ant Fujiki, H. // Cancer Res. — 1999. — V. 59. — P. 4516—4518.
22. Sivonen K. Cyanobacterial toxins and toxin production // Phycologia. — 1996. — 35. — P. 12—24.
23. Sivonen K., Jones G. Cyanobacterial toxins // Toxic Cyanobacteria in water - a guide to their public health consequences, monitoring and management. — London: E & F.N. Spon, 1999. — P. 41—111.
24. Stewart I. Recreational exposure to freshwater cyanobacteria: epidemiology, dermal toxicity and biological activity of cyanobacterial lipopolysaccharides. A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy at the University of Queensland. Springer. — 2004. — 418 p.
25. Trimurtulu G., Ogino J., Helsel C.E., Husebo, Jensen C.M., Larsen L.K., Patterson G.M.L., Moore R.E., Mooberry S.I., Corbett T.H., Valeriote F.A. Structure determination, conformational analysis, chemical stability studies, and antitumor evaluation of the cryptophycins. Isolation of 18 new analogs from Nostoc sp. strain GSV 224 // J. Amer. Chem. Soc. — 1995. — V. 117. — P. 12030—12049.
26. Voloshko L.N., Mamkaeva K.A., Gromov B.V. Characterization of Mastigocladus laminosus var. indica (Cyanophyceae, Stigonematales) in culture // Archiv für Hydrobiologie, Algological studies, Beiheft. — 1996. — V. 80. — P. 123-128.
27. Voloshko L.N., Plushch A.A., Titova N.N. Toxins of cyanobacteria (Cyanophyta) // Intern. J. on Algae.
— 2008 a. — V. 10, No 1. — P. 14—33.
28. Voloshko L., Kopecky J., Safronova T., Pljusch A., Titova N., Hrouzek P., Drabkova V. Bioactive compounds produced by cyanobacteria in Lake Ladoga // Estonian J. of Ecology. — 2008 b. — No 57/2. — P. 100— 110.
29. Voloshko. L.N., Pinevich A.V., Kopecky J., Titova., N.N., Hrouzek P., Zelik P. Water Blooms and Toxins Produced by Cyanobacteria in the Lower Suzdalskoe Lake (Saint-Petersburg, Russia) // Intern. J. on Algae. — 2010. — V. 12, Iss. 2. — P. 129—141.
30. Zelik P., Lukesova A., Voloshko L.N., Stys D., Kopecky J. Screening for acetylcholinesterase inhibitory activity in cyanobacteria of the genus Nostoc // J. of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. — 2009.
— Iss. 2. — P. 531—536.
