Токсикодинамика оксида бериллия при накожном воздействии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

В.Е. Жуков, И.Г. Фролова, И.П. Скалич, З.В. Бабаева

Токсикодинамика оксида бериллия при накожном воздействии

ФГУП «НИИ институт гигиены, токсикологии и профпатологии» ФМБА России, г. Волгоград

V.E. Zhukov, I.G. Frolova, I.P. Skalich, Z.V. Babaeva

Beryllium oxide toxicodynamics in cases of skin exposure

FSUE «Research Institute for Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology»

FMBA Russia, Volgograd

Ключевые слова: оксид бериллия, накожное воз- Keywords: beryllium oxide, skin exposure, threshold

действие, порог однократного действия, порог of one-time exposure, threshold chronic effect,

хронического действия, токсикодинамика. toxicodynamic.

Цель исследования — изучение токсических свойств оксида бериллия (ВеО) при накожном воздействии различной продолжительности. Установлено, что однократные аппликации ВеО сопровождались как изменениями в структуре эпидермиса, так и резорбтивными проявлениями. Использование комплекса интегральных показателей выявило наличие зависимости «доза — эффект», на основе которой были определены пороги однократного (Ыта'п'е!;г) и хронического (Ытс™'е!;г) действия соединения. Длительное применение ВеО сопровождалось нарушениями функций ЦНС, сердечнососудистой и иммунной систем, а также обмена веществ. Установлена стадийность ответной реакции организма при многократных аппликациях ВеО.

The goal of the research was to study toxic effects of beryllium oxide (BeO) in contacts with skin, various in duration. It was proven that a single contact with BeO caused changes in epidermis structure and had absorbtion manifestations. Complex of integral indicators revealed dose — effect correlation, that helped to determine a single time (Limacintegr) and chronic (LimJntegr) exposure thresholds for the compound. Prolonged contact with BeO causes dysfunctions of central nervous system, cardiovascular and immune systems, along with the metabolic imbalance. The study allowed to classify Stages of body response to repeated dermal exposure of beryllium oxide.

Известно, что на предприятиях по производству и применению оксида бериллия (ВеО) наиболее частыми причинами обращений работников за медицинской помощью помимо заболеваний легких является поражение кожных покровов, приводящее к поступлению вещества в кровеносное русло [1; 5; 6; 13—15]. Однако в изученной литературе сведения о резорбтивных свойствах ВеО при накожном воздействии весьма ограничены, что обусловливает актуальность исследования токсикодинамики вещества при данном пути поступления.

Цель настоящей работы — изучение токсических свойств ВеО при накожном воздействии различной продолжительности.

Материалы и методы

Объектом исследования был оксид бериллия. Поскольку ВеО — практически нерастворимое соединение, в качестве «растворителя» использовали подсолнечное масло, что позволяло получать достаточно однородную взвесь. Вещество равномерно наносили на выстриженный участок кожи спины белых беспородных крыс-самцов (площадь аппликации — 16 см2). Время однократной экспозиции — 4 часа. Продолжительность хронического эксперимента составляла 4 месяца, 5 раз в неделю по 4 часа в день с последующим восстановительным периодом 1 месяц. Особям контрольных групп апплициро-вали подсолнечное масло [10].

Учитывая, что бериллий обладает по-литропным действием, при изучении токсических свойств соединения применяли комплекс показателей (физиологические, гематологические, биохимические, иммунологические тесты, а также патоморфологические исследования), отражающих состояние различных органов и систем [3; 4; 7—9; 11; 13].

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Microsoft Excel с использованием /-критерия Стъюдента, статистически достоверными считали отклонения при р<0,05. При выявлении вредного действия вещества руководствовались общепринятыми критериями.

Организацию работы с животными осуществляли в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (приказ Мин-здравсоцразвития России от 23.08.2010 г. № 708н).

Результаты исследования и их обсуждение

Однократное применение BeO в дозе 500,0 мг/кг не сопровождалось гибелью животных, но вызывало изменения кожных покровов в виде точечного рассеянного гиперкератоза, которые появились через 2—3 суток и полностью нивелировались к 9-му дню наблюдения. Гистологически на месте аппликации отмечалось наличие истонченного эпидермиса. Кроме того, в печени крыс наблюдались массивные скопления лимфогистио-цитарных элементов в области портальных трактов, в селезенке — небольшое увеличение лимфоидных фолликул за счет расширения маргинальной зоны.

При изучении кожно-резорбтивных свойств с применением комплекса интегральных показателей BeO использовали в нескольких дозах: 50,0 мг/кг (1-я группа животных), 5,0 мг/кг (2-я группа) и 0,5 мг/кг (3-я группа). Вещество наносили также однократно в виде масляной взвеси объемом 0,1 мл. Каждая группа (включая контрольную) насчитывала по 8 особей. Тестирование подопытных крыс осуществляли в динамике: через 3, 7 и 14 суток. На основе установленной взаимосвязи между выявленными отклонениями исследуемых показателей и уровнями воздействия испытанные дозы BeO были

классифицированы следующим образом: 50,0 мг/кг — действующая, 5,0 мг/кг — пороговая (Хгтас'п1е®г), а наименьшая (0,5 мг/кг) — недействующая.

На уровне действующей дозы у подо-пыггныгх крыс на протяжении всего эксперимента отмечали нарушения в белково-азотистом обмене (перераспределение соотношения белковыгх фракций в сторону увеличения уровня глобулинов, колебание концентраций мочевины и креатинина в сыворотке крови). Влияние на иммунную систему (максимум изменений приходился на 7-е сутки) проявлялось повышением пролиферативной активности лимфоцитов селезенки, «несвязанного» комплемента и бактерицидных свойств крови, снижением содержания иммуноглобулинов, стойкими лейкоцитозом и лимфопе-нией. Патоморфологическими исследованиями, проведенными при каждом сроке тестирования, выявлены отклонения только в поверхностном слое коже: очаги атрофии клеток базального слоя эпидермиса появились на 3-е сутки, распространившиеся на 7-е сутки до шиповатого и зернистого слоев. Параллельно наблюдалось увеличение митотической активности клеток росткового слоя, что привело к полному восстановлению структурных нарушений кожи к 14-м суткам.

При длительном (4-месячном) воздействии ВеО применяли в дозах: 0,05 мг/кг —

1-я группа животных, 0,01 мг/кг — 2-я группа и 0,002 мг/кг — 3-я группа, 4-я группа служила контролем. Все экспериментальные группы, включая контрольную, насчитывали по 24 особи; максимальные различия в массе тела составляли не более 10%. Помимо ежедневного осмотра оценку состояния подопытных крыс осуществляли ежемесячно с использованием физиологических и гематологических тестов. Кроме того, по окончании

2-го, 4-го месяцев эксперимента и по завершении восстановительного периода дополнительно определяли ряд биохимических и иммунологических показателей, а также проводили патоморфологические исследования.

Статистически достоверные изменения (р<0,05) исследованных показателей представлены в таблице. Анализ приведенных данных свидетельствует о том, что при длительном накожном нанесении ВеО количе-

Статистически достоверные изменения показателей (р<0,05) подопытных крыс-самцов

при перкутанном хроническом воздействии ВеО

Показатели, ед. измерения Срок тестирования Доза, мг/кг

контроль 0,05 0,01

Частота сердечных сокращений (ЧСС), 1-й месяц 430,0±19,64 505,0±7,32* -

уд./мин. 2-й месяц 460,0±7,56 520,0±15,12** -

3-й месяц 405,71±20,34 473,33±6,67* 480,0±17,89*

Норковый рефлекс, усл. ед./мин. 1-й месяц 1,50±0,27 0,50±0,19* 0,13±0,13*

2-й месяц 1,14±0,14 0,25±0,16* -

Гематологические показатели

Гемоглобин, г/л 1-й месяц 142,49±2,33 156,26±5,03** 151,04±3,0*

2-й месяц 139,09±6,21 158,71±3,21* -

3-й месяц 155,96±2,78 136,33±3,85** 135,73±3,91**

Восст. пер. 143,81±2,31 104,89±2,84** -

Эритроциты, 1012/л 2-й месяц 7,06±0,05 7,50±0,20** 8,09±0,09**

3-й месяц 6,98±0,14 6,09±0,18** 6,19±0,27*

4-й месяц 5,21±0,18 4,58±0,14* -

Восст. пер. 7,39±0,12 5,43±0,10** -

Лейкоциты, 109/л 1-й месяц 14,03±0,20 15,73±0,21** -

2-й месяц 12,68±0,17 13,88±0,31** 13,33±0,22*

3-й месяц 13,50±0,14 14,53±0,17** 14,55±0,24**

4-й месяц 12,93±0,20 14,18±0,28** 13,94±0,37*

Восст. пер. 12,69±0,10 13,73±0,26** -

Нейтрофилы сегментоядерные, % 1-й месяц 14,63±2,12 7,88±0,85* -

3-й месяц 14,0±1,46 - 20,0±1,36*

Восст. пер. 8,43±1,91 17,63±1,47* -

Лимфоциты, % 1-й месяц 75,0±2,76 85,13±0,74* 83,38±1,39*

2-й месяц 80,63±1,52 74,75±2,16* -

3-й месяц 78,57±1,62 68,75±3,26** 71,29±1,27*

Восст. пер. 76,14±1,91 68,38±3,76* -

Показатели свертывания крови, сек.

Протромбиновое время (ПВ) 3-й месяц 16,43±1,20 25,11±0,75** -

4-й месяц 21,40±0,77 19,34±0,42* 18,65±0,36*

Восст. пер. 20,10±0,42 17,96±0,67* -

Активированное частичное тромбопластиновое 3-й месяц 23,28±0,99 37,55±1,60** 33,79±1,22**

время (АЧТВ) Восст. пер. 21,20±0,89 18,69±0,50* -

Биохимические показатели

Общий белок, г/л 2-й месяц 70,77±3,81 81,58±1,30* -

Восст. пер. 77,28±1,65 69,53±1,04* -

Альбумины, г/л 2-й месяц 32,13±1,16 37,52±1,28* -

Тимоловая проба, ед. помутнения 2-й месяц 5,39±0,41 4,41±0,14* -

4-й месяц 4,51±0,23 5,34±0,26* 5,36±0,21*

Восст. пер. 4,95±0,23 5,62±0,17* -

Креатинин, мкмоль/л 2-й месяц 202,28±16,92 117,43±7,25* -

Восст. пер. 126,84±2,21 135,13±2,52* -

Иммунологические показатели

Интенсивность спонтанной фагоцитарной 2-й месяц 23,50±2,70 35,60±4,10* 33,10±3,20*

активности нейтрофилов, усл. ед. 4-й месяц 24,53±2,90 37,10±3,20* -

Восст. пер. 22,34±1,40 29,70±2,13* -

Титр антител к Уьантигену в РПГА, усл. ед. 2-й месяц 2,09±0,08 1,68±0,05* 1,79±0,08*

Пролиферативная активность лимфоцитов 4-й месяц 0,87±0,06 0,68±0,06* -

в тесте БеЬРТ, усл. ед. Восст. пер. 1,12±0,10 0,68±0,10* -

Общее количество прореагировавших тестов 1-й месяц 2-й месяц 3-й месяц 4-й месяц Восст. пер. 4*/2** 9*/3** 1*/6** 5*/1** 9*/3** 3* 3*/1** 4*/3** 3*

Примечания:

* показатели, статистически значимо отличающиеся от контроля (р<0,05);

** показатели, статистически значимо отличающиеся от контроля (р<0,05) и выходящие за пределы физиологических колебаний (М±2о).

ство прореагировавших тестов зависело от уровня воздействия.

Статистически достоверные изменения показателей (р<0,05) подопытных крыс-самцов при перкутанном хроническом воздействии BeO

Так, при апплицировании максимальной дозы (0,05 мг/кг — 1-я группа животных) проявления вредного действия регистрировались на всех сроках тестирования. Сдвиги по 7 тестам (из 37 использованных) были статистически достоверными (р<0,05) и выходили за диапазон физиологических колебаний (М±2а) параллельного контроля. Кроме того, изменения по 6 показателям, хотя и находились в пределах физиологической нормы, сохранялись по окончании восстановительного периода. Таким образом, о проявлении вредного действия BeO свидетельствовали отклонения 13 параметров. Морфологические нарушения (у половины животных в группе) характеризовались появлением через 2 месяца эпителиоцитов округлой формы с просветленной цитоплазмой и пикнотическими ядрами в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, отеком, огрубением и уплотнением коллагено-вых волокон сосочкового слоя дермы, а также очаговыми скоплениями дермальных макрофагов. Через 4 месяца отмечались застойные явления в отдельных дольках печени и лимфогистиоцитарные инфильтраты в пери-портальных полях.

У подопытных животных 2-й группы (0,01 мг/кг) количество сдвигов с выходом за пределы физиологических колебаний (М±2о) животных контрольной группы было значительно меньше и составило 4 из 37. Патоморфологические изменения (у отдельных особей в группе) наблюдались только в печени и только после 4 месяцев, при этом они соответствовали деструктивным процессам, зарегистрированным при воздействии наибольшей дозы.

Наименьший уровень BeO (0,002 мг/кг) не вызывал каких-либо отклонений в состоянии подопытных особей, отвечающих общепринятым критериям ( как статистическим, так и морфологическим) вредного действия вещества.

Графическая интерпретация динами -ки изменений показателей на протяжении

хронического эксперимента изображена на рисунке. Она не только наглядно отражает отличия в токсикодинамике соединения, но и свидетельствует о наличии определенных стадий в развитии патологического процесса.

В частности, можно выделить фазу первичных реакций с максимальным числом отклонений, которая носила пролонгированный характер и в зависимости от применяемой дозы ВеО продолжалась от 2 до 3 месяцев. Далее следовала компенсаторная стадия, когда в результате включения различных адаптационных механизмов наблюдалось волнообразное снижение количества прореагировавших тестов. В случае аппли-цирования наибольшей дозы (0,05 мг/кг) компенсаторная стадия длилась на протяжении 3-го и 4-го месяцев. По окончании восстановительного периода наблюдался второй пик нарастания числа отклонений, т.е. полного восстановления функционального состояния организма подопытных животных не произошло. Пятикратное снижение уровня воздействия (0,01 мг/кг) сопровождалось обратимостью выявленных отклонений, что является наиболее значимым различием в токсикодинамике ВеО.

Суммируя изложенное, следует констатировать, что при хроническом перкутанном применении ВеО имела место зависимость «доза — эффект», на основе которой в качестве порога хронического перкутанно-го действия (£гтсЬш'е®г) ВеО была определена доза 0,01 мг/кг. С учетом остаточных количеств вещества величина £гтсЬ'п1е®г составила 0,0091 мг/кг, или 1,1х10-4 мг/см2.

Помимо определения токсикометриче-ских характеристик заслуживает внимания и комплексный анализ динамики состояния подопытных крыс, наиболее выраженной при применении ВеО в действующей дозе.

Прежде всего, обращало на себя внимание наличие синхронных отклонений в содержании эритроцитов и гемоглобина, регистрировавшихся на протяжении всего эксперимента. Причем если в начале опыта ( 1-й и 2-й месяцы) значения этих параметров были повышенными (по сравнению с контролем), то начиная с 3-го месяца, вероятно, произошло некоторое исто-

Сроки исследования и дозы вещества 0,05 мг/кг 0,01 мг/кг

■ Количество показателей, изменения которых достоверны при р < 0,05 и выходят за пределы физиологических колебаний контроля (М±2о)

■ Количество показателей, изменения которых статистически достоверны при р < 0,05

Динамика изменений показателей при.

щение механизмов компенсации, что привело к снижению количества клеток красной крови, а соответственно, к дефициту кислорода в организме вплоть до окончания восстановительного периода. Наблюдавшаяся реакция со стороны эритроидного ростка, по-видимому, связана со способностью бериллия оказывать токсическое действие на процессы кроветворения, обмена веществ и энергии в клеточных структурах [1; 5].

Были также зафиксированы стойкие лимфоцитопения и лейкоцитоз за счет увеличения сегментоядерных нейтрофилов. Изменение процентного содержания различных форм лейкоцитов может быть следствием иммунотропного действия ВеО, поскольку помимо этого наблюдались угнетение про-лиферативного ответа лимфоцитов, усиление спонтанного фагоцитоза, а также очаговые скопления лимфогистиоцитарных клеток в перипортальных полях печени [2; 13].

О вовлечении печени в токсический процесс свидетельствовали положительная тимоловая проба (во второй половине эксперимента), изменение концентрации альбумина и общего белка [1; 4; 7]. Колебание содержания креатинина, сохранившееся вплоть до окончания опыта, указывало как на нарушение функции почек, так и на повышенное образование азота. Последнее может быть следствием интенсификации распада белков (тимоловая проба), тогда некоторое повышение уровня общего белка следует рассматривать в качестве компенсаторной реакции.

ическом перкутанном применении ВеО

Изучение состояния свертывающей и противосвертывающей систем крови показало, что по окончании 3-го месяца эксперимента преобладали антикоагуляционные свойства крови, через 4 месяца сменивши -еся ростом активности факторов свертывания и сохранившиеся по окончании восстановительного периода. Разнонаправленный характер изменений может также свидетельствовать о функциональном нарушении печени [12].

На фоне перечисленных изменений хроническое действие ВеО в дозе 0,05 мг/кг сопровождалось отклонением и физиологических параметров организма, которое выражалось стойкой тахикардией (в течение первых 3 месяцев), и снижением ориентировочно -исследовательской деятельности (1-й и 2-й месяцы).

Приведенные данные дополняют существующие представления о развитии патологического процесса в условиях низкоуровневого воздействия ВеО. Кроме того, результаты исследования могут быть использованы при обосновании предельно допустимого уровня загрязнения оксидом бериллия незащищенных кожных покровов.

Выводы

1. Оксид бериллия при однократном перку-танном применении (в дозах 500,0, 50,0 и 5,0 мг/кг) вызывал нарушение кожного покрова, степень выраженности которого определялась уровнем воздействия.

2. На основе зависимости «доза — эффект» по изменению интегральных показателей определены пороги однократного (Limacintegr) и хронического (Limchintegr) действия BeO, составившие 5,0 мг/кг и 0,0091 мг/кг соответственно.

3. Хроническая интоксикация веществом характеризуется нарушениями функций ЦНС, сердечно-сосудистой и иммунной систем, а также обмена протеинов.

Литература

1. Бериллий. Токсикология, гигиена, профилактика, диагностика и лечение берилли-евых поражений: Справочник / Под ред. А.И. Бурназяна. М.: Атомиздат, 1980.

2. Васильева Е.В., Иванова Л.А., Соколов В.В. О некоторых механизмах повреждающего воздействия бериллия на организм // Гигиена труда и профессиональные заболевания. 1979. № 2. С. 15—19.

3. Гончаров И.С. и др. Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса: Практикум. Калининград: Изд. КГУ, 1997.

4. Камышников В.С. Клинико-биохими-ческая лабораторная диагностика: Справочник: В 2 т. Минск: Интерпрессервис, 2003.

5. Клиника острых и хронических поражений бериллием / Под ред. А.И. Бурназяна. М.: Медицина, 1983.

6. Крупкин А.Б. и др. Медико-экологические аспекты защиты производственной и окружающей среды при получении и обработке бериллия и изделий из него. СПБ., 2011.

7. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987.

8. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Л.: Медицина, 1969.

9. Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций в токсико-

логических исследованиях для целей гигиенического нормирования: утв. 14.04.80. Рег. № 2166-80. Киев, 1980.

10. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнения кожи: Методические указания: утв. 01.11.79. Рег. № 2102-79. М., 1980.

11. Сперанский С.В. О преимуществах использования нарастающего тока при исследовании способности белых мышей к суммации подпороговых импульсов / / Фармакология и токсикология. 1965. № 1. С. 123-126.

12. Шацкая Н.Н., Орлова А.А. Функциональное состояние свертывающей и противо-свертывающей систем крови при хроническом бериллиозе // Гигиена труда и профессиональные заболевания. 1968. № 11. С. 16-20.

13. Berillium Lymphocyte Proliferation Testing (BeLPT). D0E-SPEC-1142-2001. Washington: U.S. Departament of Energy, 2001.

14. Health effects of beryllium exposure. A literature review / Committee on beryllium alloy exposures. Committee on toxicology. Board on environmental studies and toxicology. Division on earth and life studies. National academy of sciences. USA. 2007.

15. Tinkle S.S. et al. Skin as a route of exposure and sensitization in chronic beryllium disease // Environmental Health Perspectives. 2003. Vol. 111. No. 9. P. 1202-1208.

Контакты:

Фролова Ирина Геннадиевна, старший научный сотрудник ФГУП «НИИ ГТП» ФМБА России. Тел. раб.: (8442) 78-62-57. E-mail: niigtp@rihtop.ru