Токсико-фармакологические исследования лекарственных средств на основе гидрогелевых полимерных матриц, содержащих мирамистин и гентамицин Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

Ю.Г. Чернецкая1, А.И. Жебентяев2, Б.В. Дубовик3, П.Т. Петров3

ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЕВЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИЦ, СОДЕРЖАЩИХ МИРАМИСТИН И ГЕНТАМИЦИН

1РУП «Белмедпрепараты», г. Минск 2Витебский государственный медицинский университет 3ГУ Научно-производственный центр «Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси», г. Минск

В работе представлены результаты доклинических медико-биологических исследований лекарственных средств для наружного применения на основе гидрогелевых полимерных матриц.

Установлено, что гидрогелевые матрицы нетоксичны для организма животных, не обладают отрицательными эффектами на функциональные системы организма (ЦНС, сердечно-сосудистую систему, функцию печени и почек), не оказывают цитотоксического и местно-раздражающего действия на раневую поверхность, слизистые, серозные и эпителиальные ткани, являются биологически безопасными.

Гидрогелевые матрицы с антисептиком группы четвертичных аммониевых соединений мирамистином и антибиотиком группы аминогликозидов гентамици-ном в экспериментах in vitro и в условиях целостного организма не обладают гемолитическим, цитотоксическим и местно-раздражающим действием. Вытяжки из гидрогелевых матриц с активными субстанциями не токсичны для организма животных при субхроническом парентеральном введении, не обладают раздражающим действием на брюшину, не индуцируют спаечного процесса.

При нанесении на раневую поверхность гидрогелевые матрицы с действующими веществами не оказывают ингибирующего действия на рост грануляционной ткани, препятствуют развитию нагноительного процесса, высыханию раневой поверхности и в совокупности обеспечивают эпителизацию и заживление раны.

Ключевые слова: гидрогелевые матрицы, мирамистин, гентамицин, острая токсичность, хроническая токсичность, специфическая активность.

ВВЕДЕНИЕ

Гидрогелевые матрицы (ГМ) представляют собой новую аппликационную лекарственную форму в виде полупрозрачных бесцветных эластичных пластин толщиной 2-3 мм, которые применяют в качестве лекарственных средств для местной терапии ран и ожогов. Аппликационные лекарственные средства в форме гидрогелевых пластин получают по оригинальной радиационно-химической технологии [1]. Под воздействием ионизирующего излучения на раствор полимерной композиции происходит процесс радиационного сшивания и формирование трехмерной полимерной структуры гидрогелевых матриц.

Гидрогелевые матрицы обладают эластичностью, механической прочностью, воздухопроницаемостью, сорбционными свойствами по отношению к раневому экссудату, препятствуют вторичному инфицированию, нормализуют обменные и стимулируют репаративные процессы в ране. Включение в состав гидрогелей антибиотика группы амино-гликозидов гентами-цина и антисептика группы четвертичных аммониевых соединений мирамистина придает им выраженные противомикроб-ные свойства [2].

ГМ могут содержать остаточные количества исходных компонентов или низкомолекулярные продукты, образующиеся при радиационной обработке водных рас-

творов полимеров и активных субстанций. Низкомолекулярные соединения способны диффундировать в рану, проникать во внутренние среды организма и оказывать системное фармакологическое и токсическое действие.

Главным медико-биологическим требованием к лекарственным средствам для наружного применения является отсутствие местно-раздражающего и аллергизи-рующего действия, а также отрицательного влияния на процессы регенерации.

Целью исследований являлось экспериментальное изучение токсикологической безопасности и общей фармакологической активности лекарственных средств на основе гидрогелевых полимерных матриц.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили гидрогелевые матрицы, содержащие 0,1 % гентамицина, и гидрогелевые матрицы, содержащие 0,05 % мирамистина. В качестве образцов сравнения использовали гидрогелевые матрицы, не содержащие действующих веществ. Также были исследованы вытяжки из гидрогелевых матриц, не содержащих активных субстанций (ВГМ), и вытяжки из гидрогелевых матриц с действующими веществами. Вытяжки вводили животным внутрибрюшинно в соответствующих объемах. Имплантацию гидрогелевых матриц проводили подкожно, дозируя их по массе лекарственной формы.

Программа исследований включала:

1) изучение острой токсичности и системного действия вытяжек ГМ; 2) изучение хронической токсичности вытяжек ГМ при системном введении; 3) изучение местного действия ГМ на ткани, слизистые, серозные оболочки, раневую поверхность; 4) изучение аллергенной опасности ГМ.

Для исследований использовали беспородных и инбредных мышей, крыс линии Вистар, кроликов породы Шиншилла и беспородных, белошерстных морских свинок.

Подопытные и контрольные группы формировали из особей обоего пола методом рандомизации по массе тела в качестве ведущего признака. Перед экспериментом животных выдерживали в течение

2 недель в карантинных условиях на стандартном пищевом рационе.

Острая токсичность и переносимость гидрогелевых матриц. Оценку острой токсичности и системного действия вытяжек ГМ проводили на экспериментальных животных двух видов: 30 самцах и самках мышей массой 23-26 г и 60 самцах и самках крыс массой 140-160 г. Вытяжки готовили, выдерживая ГМ в растворе 9 г/л натрия хлорида в течение 24 часов. Полученные вытяжки вводили внутрибрюшин-но в объеме 0,3 мл на 10 г массы тела для мышей (30 г/кг); 0,5 мл на 100 г массы тела для крыс (5 г/кг). В качестве биологического контроля использовали животных той же партии, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (плацебо).

Наблюдение за животными проводили непрерывно на протяжении первого дня после введения лекарственных средств. В последующем состояние животных отмечали дважды в сутки в течение 14 дней. Общее действие изучаемых средств оценивали по совокупности визуально идентифицируемых изменений общего статуса и поведения животных, состоянию нервно-мышечных и вегетативно-сосудистых реакций животных; регистрировали состояние шерстного покрова, поедание корма, потребление воды и динамику массы тела при ежедневном взвешивании. Для объективной характеристики состояния животных проводили исследование двигательной активности и эмоционального статуса на мышах в открытом поле актометра Op-to-Varimex. По истечении 14 суток у подопытных и контрольных животных оценивали неврологический статус (пробы на нейротоксичность) и проводили заключительную актометрию. Патоморфологические проявления токсичности определяли на аутопсии в конце эксперимента при макроскопическом изучении внутренних органов животных. Влияние на ЦНС и вегетативные функции исследовали по методике Irvin в модификации Morpurgo.

Субхроническая токсичность гидрогелевых матриц. Изучение субхрониче-ской токсичности вытяжек ГМ проводили на 90 рандомбрендных крысах линии Ви-стар обоего пола. Вытяжки ГМ, приготовленные как описано ранее, вводили ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно. Подопытные группы получали вытяжки однократно в сутки 6 дней в неделю в объеме 0,3 мл/100 г веса (3 г/кг). Контролем

служили группы крыс самок и самцов, содержавшихся в аналогичных условиях вивария, которым внутрибрюшинно вводили в эквивалентном объеме физиологический раствор. Продолжительность исследования составляла 1 месяц.

В ходе опыта оценивали интегральные показатели (выживаемость, прирост массы тела, потребление пищи, поведение и неврологический статус животных, общее состояние, ректальную температуру), проводили физиологические исследования (тест «открытое поле», спонтанная двигательная активность, исследовательский рефлекс, электрокардиография), гематологические исследования (гематокрит, содержание гемоглобина, количество эритроцитов, цветовой показатель, скорость оседания эритроцитов, средний объем эритроцитов, количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула), биохимические исследования сыворотки крови.

После отмены введения средства (31-е сутки) проводили патологоанатомическое исследование при аутопсии, определяли весовые коэффициенты внутренних органов - сердца, легкого, печени, селезенки, почек и надпочечников. Исследовали биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние печени и почек: общий белок и белковые фракции, общий холестерин сыворотки крови, содержание глюкозы в сыворотке крови, активность щелочной фосфотазы и транс-аминаз, уровень мочевины в сыворотке крови, исследовали гематологические показатели. Проводили морфологические исследования внутренних органов.

Биологическая безопасность гидрогелевых матриц (цитотоксические, раздражающие и аллергезирующие свойства). Испытания гемолитической активности вытяжек ГМ проводили in vitro в соответствии с требованиями к доклиническому изучению лекарственных средств и биоматериалов [3].

Оценку раздражающего действия проводили ХЕТ-КАМ (НЕТ-САМ) тестом на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона с целью первичной оценки раздражающего действия и цитотоксичности. В экспериментах использовали вытяжки ГМ и развивающиеся эмбрионы яиц домашних кур породы белый леггорн в возрасте 9-10 дней. Яйца инкубировали при температуре 37,8 °С и влажности 62,5 %.

Перед опытом инкубированные яйца выдерживали в течение 24 часов в стационарном положении тупым концом вверх в условиях термостатирования (37,8 °С). На хориоаллантоисную оболочку наносили

0,3 мл исследуемого раствора или раствора 9 г/л натрия хлорида с помощью дозатора, после чего наблюдали за состоянием оболочки под каплей раствора в течение 100 секунд через бинокулярный микроскоп. Каждый эксперимент выполняли в пяти повторностях.

Оценку алгогенной и флогогенной активности ГМ при контакте с брюшиной проводили в опытах на белых мышах-сам-цах массой 20-28 г и крысах - самках Ви-стар массой 120-150 г. Вытяжки ГМ вводили в объеме 0,3 мл на мышь и 0,5 мл на крысу. В течение 3 часов после инъекции регистрировали общее состояние и поведение животных, а также болевую реакцию по симптому спонтанно возникающих «корчей» или реакции на взятие животных в руки. Часть животных подвергали аутопсии через 3 часа после введения лекарственных средств для оценки экссудации жидкости и миграции клеток воспаления в перитонеальную полость; остальных животных вскрывали через 14 суток для выявления спаечного процесса в брюшной полости. В качестве плацебо контрольным мышам и крысам вводили стерильный раствор 9 г/л натрия хлорида в эквивалентных объемах. В каждую группу входило по 5 экспериментальных животных.

Местно-раздражающее действие вытяжек лекарственных средств на основе ГМ изучали в опытах на 8 кроликах по влиянию на слизистую оболочку глаза. Лекарственные средства наносили на роговицу правого глаза, в левый глаз в качестве плацебо закапывали стерильный физиологический раствор. Реакцию учитывали по состоянию конъюктивы правого и левого глаза на протяжении 48 часов.

Аллергизирующие свойства вытяжек ГМ изучали на белошерстных морских свинках, которых однократно сенсибилизировали интраперитонеальным введением исследуемых средств в дозе 0,5 мл/ кг. Через 12 дней тем же животным на наружную поверхность правого уха и выстриженный участок правого бока наносили исследуемые лекарственные средства. Аналогично левое ухо и кожу левого бока обрабатывали дистиллированной водой

(плацебо). Лекарственные средства и плацебо оставляли на месте применения до высыхания. Состояние кожи оценивали на протяжении суток по З-балльной шкале, характеризующей легкую (+), средне выраженную (++) и резко выраженную (+++) воспалительно-аллергическую реакцию. Отсутствие реакции оценивали нулевым баллом (О).

Специфическая активность гидрогелевых матриц: влияние на раневой процесс. Для оценки влияния ГМ на раневой процесс и динамику заживления ран провели четыре серии исследований на крысах:

1) прямое действие ГМ на рост и формирование грануляционной ткани; 2) влияние на процесс заживления асептических кожных ран в условиях аппликации ГМ на раневой дефект в кольце, препятствующем сокращению раны; З) влияние ГМ на спонтанно протекающее заживление кожного дефекта; 4) влияние ГМ на заживление открытых инфицированных и гнойных ран.

Эксперименты проводили на крысах-самцах весом 200-250 г. Материалом для исследования прямого действия ГМ на раневой процесс служила грануляционнофиброзная ткань, полученная с помощью колец по методу Слуцкого [4]. В контрольной серии использовали физиологический раствор, а также препарат сравнения Сап^^оЛ M Freeze-Dried Gel (USA), применяемый в хирургической практике для местного лечения ран с малым и средним экссудативным компонентом.

Динамику процесса заживления ран изучали планиметрически и с применением полуколичественной балльной шкалы по следующим показателям, характеризующим состояние раневого поля: расчетная площадь; глубина, захват нижележащих структур; состояние краев раны (гладкие, нерегулярные, рваные, заходящие вглубь с раневыми карманами); состояние дна раны (наличие некротических тканей, характеристики некротической ткани: закрытые, черные некрозы, струпья, ткани с налетом, загрязнения, включения инородных тел, чистые); качество экссудата (геморрагический, серозно-геморрагический, гнойный, засохший); степень микробного заражения/признаки инфекции.

Динамику биохимических изменений в ране изучали по содержанию в грануляционной ткани оксипролина, гексозами-нов, уроновых кислот и нейтрально-соле-

растворимой фракции коллагена. Ткань, взятую для анализа, обезжиривали смесью хлороформа с метанолом в соотношении 2:1 и в количестве 1:20 по отношению к сырому весу. Содержание оксипролина, гексозаминов и уроновых кислот определяли стандартным методом [5].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью статистических программ Statgraf, Statistica и др., используя для оценки различий параметрические и непараметрические критерии. Уровень статистической значимости различий был принят равным 0,05.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Острая токсичность и переносимость гидрогелевых матриц. Испытания на мышах показали, что вытяжки ГМ не вызывают гибели животных и не оказывают обнаруживаемого системного действия. Непосредственно после введения экстрагируемой фракции ГМ отмечалось некоторое повышение спонтанной двигательной активности и стимуляция исследовательского поведения. Мыши при этом сохраняли нормальную координацию движений, болевую чувствительность и адекватные реакции на внешние стимулы. Не отмечалось расстройств дефекации, других вегетативных симптомов и признаков нейротоксичности. На протяжении последующих двух недель наблюдения изменений в общем состоянии и поведении животных, как и случаев гибели, не отмечено.

Актометрические исследования, проведенные с целью объективизации эффектов изучаемых лекарственных форм на психомоторное поведение животных, показали, что лекарственные средства не оказывали достоверного влияния на спонтанную двигательную (горизонтальную) активность мышей (таблица 1).

Установлено, что на протяжении всего периода наблюдения также не обнаружено существенного влияния изучаемых вытяжек на поведение, неврологический статус и состояние вегетативных функций у крыс. Сразу после введения у крыс вытяжки вызывают кратковременное снижение спонтанной двигательной активности животных. В последующем состояние и поведение крыс не отличалось от нормы по всему комплексу поведенческих тестов. У подопытных крыс отмечался нормальный

весовой прирост (таблица 2), не выявлено существенных изменений гематологических показателей (таблица 3) и диуреза, признаков нейротоксичности по моторнокоординационному тесту, не отмечено отклонений в состоянии печени.

Результаты изучения острой токсичности и переносимости вытяжек ГМ, полученные в опытах на мышах и крысах, позволили заключить, что водные извлечения матриц не токсичны при внутри-брюшинном введении и не обладали обнаруженным системным токсическим действием в дозах, предельных для инъекций животным. Отдаленных токсических эффектов вытяжек после однократного введения также не обнаружено. Достоверных

различий действия гидрогелевых матриц с мирамистином и с гентамицином не выявлено.

Субхроническая токсичность. Исследование системной токсичности ГМ при субхроническом введении их вытяжек проведено с целью определения биологической безопасности субстанций, способных диффундировать из гидрогелевого покрытия в рану и оказывать системное действие на организм человека.

Ежедневное введение вытяжек гидрогелевых матриц внутрибрюшинно на протяжении 1-го месяца не вызывало видимых изменений вегетативных функций, поведения, двигательной активности, нервно-мышечной координации, болевой

Таблица 1 - Параметры горизонтальной двигательной активности мышей при 10-минутной экспозиции в актометре Opto-Varimex в различные сроки после однократного

Группа Сроки исследования

Фон 40 мин 1 сут. 4 сут. 7 сут. 14 сут.

Самцы

Плацебо 100,0±5,8 76,2±11,5 79,6±4,8 76,7±4,9 96,4±4,8 91,1±5,0

ВГМ 100,0±6,1 84,1±12,1 89,3±7,6 78,3±11,6 93,1±8,0 95,6±6,2

ВГМ с ге нтамицином 100,0±12,6 95,4±12,7 98,9±10,1 94,0*±12,8 89,9±8,6 92,5*±6,5

Самки

Плацебо 100,0±10,3 64,0±12,1 100,4±19,7 94,7±12,9 96,0±9,8 94,0±9,3

ВГМ 100,0±12,6 115,4± 11,7 168,9*±10,1 134,3*±8,0 94,0± 11,6 90,5±4,5

ВГМ с ге нтамицином 100,0±10,8 91,4*±2,2 104,2±15,2 113,9±16,3 109,9±20,7 106,0±20,0

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с фоном

Таблица 2 - Острая токсичность вытяжек гидрогелевых матриц для крыс при внутрибрюшинном введении и влияние однократного введения вытяжек

на прирост массы тела

Группа Число* животных Летальность на указанные сутки Прирост массы тела на 14-е сутки, %

1 7 14 Самцы Самки

Плацебо 10 0 0 0 35,9±2,9 30,0±3,2

ВГМ 10 0 0 0 37,0±3,6 30,2±3,1

ВГМ с гентамицином 10 0 0 0 36,1±3,4 29,9±3,8

Примечание: * - в группы входило по 5 самцов и 5 самок

Таблица 3 - Клеточный состав периферической крови у крыс (М±т) на 14-е сутки после однократного внутрибрюшинного введения вытяжек гидрогелевых матриц

Группа Эритроциты, 1012/л Лейкоциты, 109/л Нейтрофилы, 109/л Тромбоциты, 1012/л

Плацебо 8,0±0,2 7,6±0,5 1,5±0,4 0,74±0,05

ВГМ 7,9±0,1 7,2±0,4 1,4±0,5 0,83±0,06

ВГМ с гентамицином 8,1±0,1 8,0±0,5 1,6±0,4 0,80±0,06

Примечание: в группы входило по 5 самцов и 5 самок

чувствительности и эмоциональной реактивности подопытных животных. Подопытные животные потребляли обычное количество корма и на протяжении 1 месяца при взвешивании 2 раза в неделю не отличались от контрольных по динамике массы тела (таблица 4).

Таким образом, при введении вытяжек ГМ общетоксических эффектов у крыс не обнаружено.

Анализ электрокардиограмм показал, что у крыс контрольной и опытных групп на протяжении всего времени проведения исследования при периодическом определении не отмечалось нарушений сердечного ритма и существенных различий частоты сердечных сокращений.

При исследовании морфологической картины крови установлено, что в динамике наблюдения за животными в период введения средств нет значимых отличий между подопытными и контрольными группами со стороны клеточного состава периферической крови и содержания гемоглобина (таблица 5).

Сопоставление весовых коэффициен-

тов внутренних органов показало, что на протяжении всего опыта относительная масса сердца, легкого, селезенки, печени, почек, надпочечников, семенников и яичников животных, которым вводили вытяжки ГМ в изучаемых дозах, и контрольных животных существенно не различались. Результаты патоморфологиеского исследования свидетельствовали о том, что лекарственные формы на основе ГМ при субхроническом введении не вызывают видимых макроскопических и гистомор-фологических изменений внутренних органов экспериментальных животных.

Проведенные исследования позволили заключить, что компоненты гидрогелевых матриц, способные диффундировать в водные среды при местном применении матриц для лечения ран, не обладают системной токсичностью.

Биологическая безопасность гидрогелевых матриц (цитотоксические, раздражающие и аллергезирующие свойства). В результате исследования гемолитической активности водных вытяжек ГМ с мира-мистином и гентамицином in vitro уста-

Таблица 4 - Влияние хронического введения вытяжек гидрогелевых матриц на динамику массы тела у крыс (р>0,05)

Недели введения Самцы Самки

Плацебо БГМ Плацебо ЬГМ

Исходная масса, г 146±6,2 141±5,4 140±2,4 1З5±З,З

в % к исходной

1 105±1,З 114± 1,8 10З±0,98 11З±1,7

2 11З±2,4 116±2,5 110±1,6 113±1,6

3 125±2,4 121±З,2 115±2,4 114± 1,8

4 125±2,7 127±З,9 119±2,6 115±1,7

Таблица 5 - Влияние субхронического введения вытяжек гидрогелевых матриц на содержание лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови у крыс (п=10)

Группа Сроки исследования Лейкоциты 109/л Нейтрофилы Лимфоциты Тромбоциты 109/л

% %

Самцы

Исходные данные 11,0±1,6 22,0±2,2 78,0±2,2 727±51

Плацебо 1 месяц 9,9±2,7 25,0±1,6 75,0±1,6 689±44

ЬГМ 1 месяц 9,6±1,7 29,0±2,7 71,0±2,7 774±4З

ЬГМ с гентамицином 1 месяц 10,2±1,2 28,0±1,8 72,0±1,7 6З4±57

Самки

Исходные данные 9,8±1,6 21,0±2,4 79,0±2,4 698±44

Плацебо 1 месяц 10,З±0,9 25,0±4,З 75,0±4,З 648±44

ЬГМ 1 месяц 11,2±1,4 22,0±2,2 78,0±2,2 747±З8

ЬГМ с ге нтамицином 1 месяц 10,0±1,4 28,0±2,1 72,0±2,1 689±З6

новлено, что процент гемолиза, индуцированного экспозицией вытяжек лекарственных средств на основе ГМ, не превышал

3 %, что свидетельствовало об отсутствии цитотоксического действия испытуемых средств в гемолитическом тесте.

Оценка раздражающего действия показала, что вытяжки лекарственных средств на основе ГМ не оказывали раздражающего действия на хориоаллантоисную оболочку куриного эмбриона в ХЕТ-КАМ тесте. При экспозиции вытяжек ГМ на хо-риоаллантоисной оболочке отсутствовали сосудистые проявления и тканевая реакция (не нарушенная прозрачная тонкая оболочка с нормально функционирующей сетью кровеносных сосудов и капилляров). Полученные результаты позволили заключить, что ГМ не содержат компонентов, обладающих раздражающим действием на слизистые оболочки, не проявляют местных гистотоксических свойств и могут быть отнесены к 1 классу веществ по

местно-раздражающим свойствам.

Местно-раздражающее действие лекарственных средств на основе ГМ и их вытяжек изучено при контакте с тканями, серозными и слизистыми оболочками животных in vivo. Установлено, что вну-трибрюшинная инстилляция исследуемых средств не индуцировала ирритантной реакции брюшины, не вызывала болевой реакции (корчей), экссудации жидкости и миграции клеток воспаления в перитонеальную полость, превышающей миграцию на введение стерильного изотонического раствора натрия хлорида. При вскрытии через 2 недели у животных, получивших ЛС, спаечных явлений в брюшной полости не обнаружено (таблицы 6, 7). Полученные данные свидетельствовали об отсутствии местно-раздражающего, флогоген-ного и спаечного действия лекарственных средств на основе ГМ при контакте с брюшиной.

При изучении влияния на конъюктиву

Таблица 6 - Частота проявления алгогенного и острого флогогенного действия при инстилляции вытяжек гидрогелевых матриц в брюшную полость мышам и крысам

Группы Дозы и концентрации Болевая реакция Наличие перитонеального экссудата**

Спонтанные «корчи» Болевая реакция при хэндлинге

Мыши

Контроль Плацебо 0/5* 0/5 0/5

ЬГМ 0,3 мл/мышь (суспензия 1:1) 0/5 0/5 0/5

ЬГМ с мирамистином 0,3 мл/мышь (суспензия 1:1) 0/5 0/5 0/5

Крысы

Контроль Плацебо 0/51 0/5 0/5

ЬГМ 0,3 мл/мышь (суспензия 1:1) 0/5 0/5 0/5

ЬГМ с мирамистином 0,3 мл/мышь (суспензия 1:1) 0/5 0/5 0/5

Примечание: * - отношение числа животных с признаками болевого раздражения брюшины к общему числу животных в группе

** - экссудат собирали посредством декантации жидкого содержимого брюшной полости после вскрытия

Таблица 7 - Частота выявления спаечного процесса в брюшной полости у мышей и крыс через 2 недели после внутрибрюшинного введения водных вытяжек гидрогелевых матриц

Группы Мыши Крысы

Плацебо 0/5* 0/5

ЬГМ 0/5 0/5

ЬГМ с мирамистином 0/5 0/5

Примечание: * - отношение числа животных с признаками спаечного процесса в брюшине к общему числу животных в группе

глаз у кроликов установлено, что вытяжки ГМ не отличались от действия стерильного физиологического раствора и не обладали местно-раздражающим действием (таблица 8).

В результате исследования аллерги-зирующих свойств ГМ показано, что вытяжки ни в одном случае из шести не вызывали гиперергической реакции кожи у сенсибилизированных морских свинок (таблица 9).

Результаты проведенных испытаний позволяют заключить, что вытяжки лекарственных средств на основе ГМ не обладают аллергизирующими свойствами.

Специфическая активность гидрогелевых матриц: влияние на раневой процесс. Учитывая, что основным назначением лекарственных средств на основе ГМ является их применение в качестве материала для покрытия ран и ожогов, было изучено влияние испытуемых лекарственных форм на скорость заживления хирургических ран и состояние новообразующейся грануляционно-фиброзной ткани.

В таблицах 10 и 11 представлены результаты, характеризующие динамику заживления открытых хирургических дефектов кожи при аппликации на раневую поверхность ГМ и препаратов сравнения.

Таблица 8 - Частота выявления признаков ирритации конъюктивы у кроликов после _____________________нанесения вытяжек гидрогелевых матриц________________________

Плацебо ЬГМ ЬГМ с мирамистином

* 0/ 0/4 0/4

0/4 0/4 0/4

Примечание: * - отношение числа животных с признаками ирритации к общему числу животных в группе.

Таблица 9 - Частота выявления гиперчувствительности у морских свинок в эпикутанном тесте после внутрибрюшинного введения вытяжек гидрогелевых матриц

Группы Результаты эпикутанного теста (в баллах)

0 + ++

Плацебо 6/6 0/6 0/6

ЬГМ 6/6 0/6 0/6

ЬГМ с мирамистином 6/6 0/6 0/6

Таблица 10 - Динамика заживления ран у крыс при аппликации гидрогелевых матриц и препарата сравнения на раневую поверхность

Группа животных Площадь раны, мм2

0 10 13 15 18 20

Контроль(n=10) З14±5 157±15 78±7 26±З 1З±З Рубцевание

ГМ (n=10) З16±4 142±1З 72±8 2З±З 6±2 Рубцевание

ГМ с мирамис-тином (n=10) З10±4 1З0±17 6З±11 18±5 Рубцевание

Сап^^Л M Freeze-Dried Gel (n=10) З08±6 160±18 68±1З 25±5 10±З Рубцевание

Таблица 11 - Полуколичественная оценка состояния раневого поля у крыс при аппликации гидрогелевых матриц и препаратов сравнения на раневую поверхность

Группа животных Состояние раневого поля

0 10 13 15 18 20

Контроль(n=10) З2±5 26±8 22±7 18±З 11±З Заживление

ГМ (n=10) З1±4 27±7 24±8 17±З 7±2 Заживление

ГМ с мирамистином (n=10) З1±4 22±5 18±5 10±З Заживление

Сarra™Sorb M Freeze-Dried Gel (n=10) ЗЗ±4 29±9 24±6 15±6 6±2 Заживление

Как видно из представленных данных, аппликация ГМ на протяжении 5 суток на 1-2 дня ускоряла заживление ран. Так, в контрольной серии экспериментов заживление ран у животных наступало в среднем на 20-е сутки. Применение гидрогелевых матриц с мирамистином сокращало этот срок до 16-18 дней, соответственно (р<0,05 по непараметрическому критерию и).

Результаты исследований влияния ГМ на динамику биохимических процессов в грануляционной ткани обобщены в таблице 12. Из приведенных данных видно, что на 5-й и 10-й дни как в контрольных, так и в опытных образцах ткани на фоне относительно стабильного содержания уроновых кислот отмечалось уменьшение содержания гексозаминов и увеличение количества оксипролина.

Биохимический анализ выявил некоторое снижение содержания суммарного количества оксипролина в грануляционно-фиброзной ткани на 5-е сутки развития, которое далее выравнивалось. Содержание оксипролина в нейтрально-солераствори-мой фракции увеличивалось на 5-е сутки и к 10-м превышало контрольное значение в 2 раза. Содержание уроновых кислот и гексозаминов было близким к контрольным значениям.

Таким образом, показано оптимизирующее влияние аппликационного применения ГМ на биохимические маркеры раневого процесса по влиянию на фибрил-логенез коллагеновых белков в соединительной ткани, отражающие динамику репаративных процессов при заживлении ран.

В следующей серии экспериментов

проведено исследование влияния аппликации ГМ на макроскопическое состояние скарификационной кожной раны и скорость эпителизации раневого дефекта при обработке раневого поля.

На 3-и сутки у крыс контрольной группы отмечалась гиперемия и отечность краев раны, в двух случаях - нагноение подлежащей клетчатки.

Раны, на поверхность которых ап-плицировали ГМ с мирамистином, оставались чистыми, ни в одном случае не отмечалось нагноения. Площадь раневой поверхности минимально отличалась от исходной. На 5-е сутки наблюдения в контрольной группе сохранялась гиперемия краев и их отечность. У двух крыс данной группы под струпом имелись гнойные массы. Раны, на поверхность которых апплицировали ГМ, покрыты сухим тонким струпом. По краям раны появились признаки эпителизации. Струп скудный, расположен преимущественно в центре ран. Уменьшился отек краев ран, сократилась гиперемия. На 7-е сутки эксперимента раны у контрольных животных и группы с аппликацией FDG содержали экссудат и элементы струпа, при надавливании из центра выделялись сливкообразные гнойные массы. Последние, осумковавшись в подкожно-жировой клетчатке, способствовали выбуханию краев раневого дефекта над поверхностью. Площадь ран с аппликацией ГМ к 7-м суткам сокращена, поверхность очищена и покрыта нежным розовым эпидермисом.

На 10-е сутки у животных контрольной группы струп отторгся, раны эпите-лизированы. Площадь ран сократилась

Таблица 12 - Биохимический состав грануляционно-фиброзной ткани при местном

применении гидрогелевых матриц

Группы животных Сутки мг/г сухой обезжиренной ткани

Оксипролин Уроновые кислоты Гексоз- амины

Общий 0,15 М №С1 экстр. 0,45 М NaCl экстр.

Контроль(п=5) 5 18,5±1,5 0,18±0,05 0,15±0,04 5,9±0,5 23,8±3,3

ГМ (п=5) 14,2±2,6 0,15±0,03 0,19±0,05 5,6±0,8 25,3±2,7

ГМ с мирамистином (п=5) 16,3±3,3 0,16±0,02 0,22±0,03 5,5±0,4 27,1±3,6

Контроль(п=5) 10 22,8±2,4 0,15±0,05 0,21±0,05 6,1±0,5 24,1±2,1

ГМ (п=5) 24,7±3,5 0,24±0,03 0,31±0,09 6,3±0,4 23,2±1,4

ГМ с мирамистином (п=5) 23,5±2,8 0,23±0,04 0,36±0,11 5,8±0,9 21,1±1,2

(таблица 13). К этому сроку в подопытной группе животных, на раны которых аппли-цировали ГМ, раневой дефект представлен нежным рубцом. Подкожно-жировая клетчатка свободна от воспалительных инфильтратов. Рубец в контрольной группе сформировался на 12-14 сутки.

Полученные данные свидетельствовали

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате доклинических медико-биологических исследований аппликационной лекарственной формы ми-рамистина и гентамицина показано, что вытяжки из гидрогелевых матриц не обладали системным токсическим действием на организм животных, не оказывали отрицательного влияния на основные функциональные системы организма (ЦНС, сердечно-сосудистую систему, функцию печени и почек), не проявляли гемолитических, цитотоксических и местно-раздражающих свойств. При субхроническом парентеральном введении они не раздражали брюшину, не индуцировали спаечный процесс в перитонеальной полости, не влияли на систему крови, не вызывали патоморфологических изменений внутренних органов и являлись биологически безопасными.

Результаты изучения местного действия водных вытяжек лекарственных средств на основе гидрогелевых полимерных матриц, проведенного на различных экспериментальных моделях, показали, что изучаемые средства не обладали ал-гогенным, флогогенным и существенным ирритантным действием при прямом контакте с брюшиной, конъюктивой и подкожной клетчаткой. Препараты не вызывали признаков некроза ткани при различ-

в пользу наличия оптимизирующего эффекта аппликации ГМ на скорость заживления раны и профилактики инфекционно-воспалительных осложнений. Применение ГМ с мирамистином и с гентамицином ускоряет заживление полнослойных ран кожи за счет стимуляции репаративных процессов и усиления барьерно-защитной функции кожи.

ных способах системного введения.

При контакте гидрогелевых матриц с раневой поверхностью, слизистыми, подкожной клетчаткой, серозными и эпителиальными тканями не выявлено признаков местной реакции тканей альтернативного, раздражающего или воспалительного характера. При нанесении на раневую поверхность гидрогелевые матрицы не оказывали ингибирующего действия на рост грануляционной ткани, препятствовали развитию нагноительного процесса, высыханию раневой поверхности и в совокупности обеспечивают оптимальные условия для эпителизации и заживления ран.

SUMMARY

Y.G. Chаmetskaya, A.I. Zhebentyaev, B.V. Dubovik, P.T. Petrov TOXICO-PHARMACOLOGICAL DRUG RESEARCH-GOVERNMENTAL FUNDS BASED ON HYDROGEL POLYMERIC MATRIXES CONTAINING MYRAMIS-TIN AND GENTAMICIN

The results of preclinical biomedical research of medicines for external use on the basis of hydrogel polymer matrixes are presented.

It was established that the hydrogel matrixes are non-toxic to the body of animals, have no negative effects on the functional systems of the body (central nervous system,

Таблица 13 - Влияние аппликации гидрогелевых матриц на скорость эпителизации _______________________скарификационной кожной раны________________________

Сроки наблюдения, сутки Площадь раневого поля, мм2

Контроль(n=10) ГМ с мирамистином (n=10) Carra™Sorb M Freeze-Dried Gel (n=10)

0 102±4 106±6 104±8

3 100±1 88±7 95±12

5 95±5 55±4 76±8

7 70±3 14±2 38±7

10 40±6 5±4 18±5

14 18±9 Рубцевание 15±4

15 Рубцевание Рубцевание

cardiovascular system, liver and kidney function) are not cytotoxic and locally irritating to the wound surface, mucous, serous and epithelial tissue and are biologically safe.

Hydrogel matrixes with an antiseptic of the group of quaternary ammonium compounds myramistin and antibiotics of the group of aminoglycoside gentamicin in experiments in vitro and in the whole organism are not hemolytic, cytotoxic and locally irritating. Extracts from the hydrogel matrixes with the active substances are not toxic to the body of animals following subchronic parenteral administration, are not an irritant to the peritoneum, do not induce adhesions and are biologically safe.

When applied to the wound surface hydrogel matrixes with active ingredients have no inhibiting effect on the growth of granulation tissue, and prevent the development of suppurative process, drying of the wound surface and combine to provide epithelization and wound healing.

Keywords: hydrogel matrixes,

мyramistin, gentamicin, acute toxicity, chronic toxicity, the specific activity.

ЛИТЕРАТУРА

1. Противомикробное и ранозаживляющее средство на основе гидрогелевой полимерной матрицы: пат. 11060 Республика Беларусь: МПК (2006) А 61L

15/16 / Петров n.T. [и др.]; заявитель и патентообладатель РУП «Белмедпрепа-раты» (BY); заявл. 21.10.2005; опубл. 30.06.2007 // Афщыйны бюл. / Нац. цэнтр штэлектуал. уласнасщ. - 2008. -№ 4 (63). - С. 62.

2. Противомикробная активность новых лекарственных средств на основе гидрогелевых полимерных матриц / Ю.Г. Чернец-кая [и др.] // Вестник фармации - 2009. -№ 3. - С. 63 - 75.

3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, 2000. - С. 25 - 90.

4. Слуцкий, Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани / Л.И. Слуцкий. - Л.: Медицина, 1969. - 237 с.

5. Chandrasekaran, E.V. Methods in Carbohydrate Chemistry / E.V. Chandrasekaran, J.N. BeMiller. - 1980. -Vol. 90, № 8. - Р. 25-30.

Адрес для корреспонденции:

220007, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Фабрициуса, 30,

РУП «Белмедпрепараты», тел./факс 8(017)220 31 42 e-mail: nfc@belmedpreparaty. com Чернецкая Ю.Г.

Поступила 08.07.2011 г.