CC BY
69
УДК 591.145.3:598.126.3
ТОКСИЧНОСТЬ ЯДА ОБЫКНОВЕННОЙ ГАДЮКИ VIPERA BERUS ДЛЯ ОЗЕРНЫХ ЛЯГУШЕК PELOPHYLAXRIDIBUNDUS
© 2013 А.Л. Маленев, P.A. Горелов, А.Г. Бакиев
Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук, г. Тольятти
Поступила 10.12.2013
В статье приведены результаты определения среднесмертельной дозы (ЛД50) яда обыкновенных гадюк Vípera berus из Волжского и Донского бассейнов для сеголетков озерной лягушки Pelophylax ridibundus. Яд из популяций с преобладанием признаков V. b. berus имеет более высокие значения ЛД50, чем из популяций с преобладанием признаков V. b. nikolskii.
Ключевые слова: обыкновенная гадюка Vípera berus, ядовитый секрет, токсичность, средне-смертельная доза ЛД5о, озерная лягушка Pelophylax ridibundus.
В настоящее время мы полагаем, что в Волжском бассейне обыкновенная гадюка представлена двумя подвидами - номинативным Vípera berus berus и лесостепным, или гадюкой Никольского V. b. nikolskii. По морфологическим данным, зона интерградации двух подвидов занимает значительную часть бассейна Волги: наиболее «чистые» популяции номинативного подвида известны для отдельных регионов Верхнего Поволжья, а в других поволжских популяциях обнаруживаются морфологические признаки обеих форм, при этом подвидовые признаки V. b. nikolskii наиболее выражены у водораздела с Донским бассейном. Районы Донского бассейна, прилегающие к Волжскому бассейну, населяют популяции с преобладанием признаков V. b. nikolskii [1,2, 8, 10-12, 14, 15].
Одним из диагностических признаков гадюки Никольского является бесцветный яд, у номинативного подвида он желтого цвета [15]. По характерному пептидному составу яда к V. b. nikolskii относится часть гадюк из популяций у границы речных бассейнов Волги и Дона, остальные гадюки из Волжского бассейна имеют пептидный состав яда, характерный для V. b. berus [1, 2, 10]. Кроме различий в пептидном составе, у двух подвидов гадюк в ядовитом секрете были отмечены статистически значимые различия в активности ферментов - протеазы и оксидазы L-аминокислот
[7].
В то же время, токсичность яда (среднесмер-тельная доза ЛД50), ранее определенная нами на белых лабораторных мышах при подкожном введении, для данных подвидов гадюк не различается [9] - в яде гадюк номинативного подвида ЛД50 составляет 3,0-4,7 мкг/г, а в яде гадюки Никольского - 2,9-4,1 мкг/г. В.Г. Старков и соавторы
Маленев Андрей Львович, кандидат биологических наук, malenyov@mail.ru; Горелов Роман Андреевич, аспирант, gorelov.roman@mail.ru; Бакиев Андрей Геннадьевич, кандидат биологических наук, herpetology@list.ru
[16] также не обнаружили значительных различий в токсичности яда вышеуказанных подвидов для банановых сверчков Gryllus assimilis: среднесмер-тельная доза яда номинативного подвида равна 81,9 мкг/г, а яда гадюки Никольского - 84,8 мкг/г.
В данной работе на сеголетках озерной лягушки были определены значения среднесмертельной дозы ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк разной подвидовой принадлежности и из различных популяций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные животные. Все эксперименты по токсикометрии ядов обыкновенной гадюки были проведены на сеголетках озерной лягушки Pelophylax ridibundus. Сеголетков озерной лягушки отлавливали в пойме р. Ахтуба (Красноярский район Астраханской области, окрестности ст. Досанг) в конце августа - начале сентября 2013 г. В опытах использовали лягушат массой 2,0-3,5 г за исключением тех случаев, когда нужны были лягушки другой массы. После отлова лягушек выдерживали сутки при комнатной температуре (25-27°С) для опорожнения кишечника, взвешивали на электронных весах «Ohaus Scout Pro» и формировали разные весовые группы (2,1-2,5 г, 2,6-3,0 г и 3,1-3,5 г). Для определения ЛД50 одного образца яда использовали лягушек одной весовой группы.
Образцы ядов гадюк. Образцы ядов обыкновенной гадюки представляли собой яд, полученный от нескольких гадюк (от 10 до 30 экз.) из одной популяции и отловленных в одно время. Образцы яда были получены от гадюк, отловленных в 2009-2013 гг. в бассейне Средней и Нижней Волги и прилегающих к нему районов Донского бассейна, и хранились в лаборатории в условиях, обеспечивающих сохранность их биологической активности в течение нескольких лет. Для удобства обозначения образцов яда использовали их географическую приуроченность к местам отлова гадюк. В экспериментах использовали водные
2337
растворы ядов в концентрации 5 мг/мл для номинативного подвида обыкновенной гадюки и 2 мг/мл для яда гадюки Никольского.
Токсикометрия. Определение среднесмер-тельной дозы ЛД50 ядов гадюк проводили стандартным методом, принцип которого подробно описан в литературе [3, 4, 13]. Для определения значения среднесмертельной дозы проводили инъекции возрастающих доз водных растворов яда группам экспериментальных животных одинакового веса. В каждом эксперименте использовали 30 лягушек - 6 групп лягушек по 5 особей; животным в группах вводили по 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкл раствора яда. Инъекции растворов ядов гадюк проводили внутрибрюшинно в правую нижнюю четверть брюшной поверхности лягушки с использованием микрошприца объемом 0-30 мкл («СЫгапа», Чехия). В качестве контроля использовали группу лягушек (5 шт.), которым вводили максимальный объем (30 мкл) дистиллированной воды. В наших экспериментальных условиях лягушки контрольных групп оставались живыми не только в течение времени наблюдения (24 часа), но и в течение последующих трех-четырех суток. Эксперименты по токсикометрии проводили при комнатной температуре (25-27°С), и наблюдение прекращали через 24 часа после введения яда, подсчитывая число погибших и выживших животных.
Пробит-анализ. Для каждого образца яда проводили как минимум два независимых определения ЛД50 в одинаковых условиях. Значение среднесмертельной дозы ЛД50 рассчитывали ме-
тодом модифицированного пробит-анализа [4]. Среднее значение ЛД50 рассчитывали по результатам двух независимых острых опытов, объединяя в одну линейку все эффективные дозы. При этом количество экспериментальных групп лягушек увеличивалось в два раза (с шести до двенадцати), а количество животных в группе оставалось неизменным (5 особей). Значения средне-смертельной дозы ядовитого секрета выражали в мкг яда/г веса экспериментальных животных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Отловленные для экспериментов озерные лягушки были представлены двумя фенетическими формами: «полосатая» - со светлой дорсомеди-альной полосой (морфа «striata») - и «бесполо-сая», причем соотношение двух форм варьировало в разных биотопах. Как известно из литературных источников [5, 6], эти две формы (у лягушек озерной и остромордой) отличаются уровнем и скоростью метаболизма, степенью накопления ряда элементов, интенсивностью легочного дыхания, продолжительностью жизни и устойчивостью к антропогенной трансформации среды. Такие физиологические различия двух морф не исключают возможности искажения результатов токсикометрических экспериментов. Поэтому первоначально мы определили значение средне-смертельной дозы ЛД50 яда обыкновенной гадюки для лягушек разных морф, но одной весовой группы (табл. 1).
Таблица 1. ЛД50 яда обыкновенной гадюки для разных морф озерной лягушки
Морфа ЛД50, мкг/г М±т t<p Р
со светлой продольной полосой на спине 35,3±3,31 37,3±2,58
39,8±3,46 0,53 >0,05
без светлой продольной полосы на спине 39,3±6,40 39,5±3,29
39,8±3,46
подвида из Нижегородской области, концентрация
примечание: в эксперименте использовали яд яда 5 мг/мл; масса лягушек в группах 2,0-3,5 г.
Как видно из табл. 1, достоверных различий в значениях ЛД50 не выявлено, что говорит об одинаковом результате воздействия ядовитого секрета на две разные морфы озерных лягушек с отмеченными выше особенностями метаболизма. Тем не менее, в дальнейших экспериментах мы все-таки старались использовать лягушек одной морфы - бесполосых, встречаемость которых в местах отлова была значительно выше.
Заметим, что для групп лягушек с большей средней массой абсолютное значение ЛД50 оказалось ниже такового для лягушек в группах меньшей массы. Значения ЛД50 яда гадюк из Новгородской области на лягушках разных весовых групп (1,6-2,0, 2,1-2,5 и 3,6-4,0 г) составили 52,3,
46,3 и 33,4 мкг/г соответственно. Поэтому в дальнейших экспериментах мы старались проводить два определения ЛД50 одного образца яда на лягушках сходных весовых групп.
Для выявления подвидовых различий в токсичности ядов гадюк мы проанализировали ЛД50 образцов ядовитого секрета гадюк разной подви-довой принадлежности из разных популяций в Волжском и Донском речных бассейнах. Результаты этих экспериментов приведены в табл. 2, где данные ранжированы в порядке снижения значений ЛД50 и, соответственно, возрастания токсичности образца яда.
Значения ЛД50 всех исследованных образцов ядов разбиваются на две большие группы, разли-
2338
чающиеся между собой. Это - группа высоких значений ЛД50, характерная для яда обыкновенных гадюк с преобладающими признаками номинативного подвида, и группа низких значений ЛД50, характерная для яда гадюк с преобладающими признаками лесостепного подвида. При сравнении значений ЛД50 ядов номинативного и лесостепного подвидов выявлено, что у первого подвида они многократно (в 3-6 раз) и статистически значимо выше. Это свидетельствует о том, что яд гадюки Никольского значительно более токсичен для озерных лягушек по сравнению с таковым у гадюк номинативного подвида. Полученные данные мы не можем объяснить пищевыми предпочтениями двух подвидов гадюк, поскольку они расходятся с нашими представлениями о незначительных различиях в трофиче-
ских преференциях. На наш взгляд, анализу соответствия токсичности ядов гадюк их пищевым предпочтениям необходимо уделить более пристальное внимание, включив в экспериментальное определение ЛД50 более широкий спектр пищевых объектов, отмеченных в литературе.
Значения ЛД50 яда гадюк из разных популяций с преобладанием признаков V. Ъ. Ъегш различаются между собой: наименее токсичный яд имеют гадюки из Республики Татарстан (ЛД50=51,9±4,43 мг/г), а наиболее токсичный яд получен от гадюк из Пермского края (ЛД50=30,6±1,96 мг/г). Различия этих значений ЛД50 статистически значимы (?ф=4,40,1'<().()() 1). А значения ЛД50 яда из разных популяций с преобладанием признаков V. Ъ. пгко1-якп практически одинаковы и не имеют между собой статистически значимых различий.
Таблица 2. Географические различия ЛД50 яда обыкновенной гадюки для озерной лягушки
Преобладают признаки подвида Место отлова Цвет яда ЛД50, мкг/г, М±щ
V. Ъ. berus Республика Татарстан, Лаишевский район желтый 51,9±4,43
Республика Мордовия, Ковылкинский район желтый 50,8±4,89
Самарская область, Ставропольский район желтый 48,8±5,05
Самарская обл., г. Самара желтый 47,4±3,31
Республика Чувашия, Алатырский район желтый 42,3±4,50
Новгородская область, Боровичский район желтый 41,1±3,87
Нижегородская область, Тоншаевский район желтый 37,2±2,60
Московская область, Раменский район желтый 32,7±4,58
Пермский край, Чердынский район желтый 30,6±1,96
V. Ъ. nikolskii Липецкая область, Добровский район бесцветный 10,9±1,13
Пензенская область, Пензенский район бесцветный 9,9±1,51
Саратовская область, Хвалынский район желтоватый 9,6±1,91
Саратовская область, Аткарский район бесцветный 9,2±1,68
Пензенская область, Пензенский район желтоватый 8,9±1,59
В табл. 2 отмечен также цвет ядовитого секрета гадюк из исследованных популяций. Напомним, что у гадюк номинативного подвида мы всегда отмечали яд ярко-желтого цвета, тогда как у гадюк Никольского встречается и бесцветный, и желтоватый яд (слабой желтой окраски) [2, 7]. Сравнение значений ЛД50 бесцветного и желтоватого яда у гадюк из Пензенского района Пензенской области не выявило статистически значимых различий. Ранее проведенный биохимический анализ яда гадюк Никольского из этих популяций показал, что данные образцы отличались активностью оксидазы Ь-аминокислот, которая и опре-
деляет цвет ядовитого секрета. Получается, что, несмотря на значительные различия в активности оксидазы Ь-аминокислот у особей в популяциях, токсичность их яда для сеголеток лягушек одинакова.
Таким образом, анализ среднесмертельной дозы ЛД50 образцов ядовитого секрета обыкновенной гадюки выявил межподвидовые и внутрипо-двидовые различия в его токсичности для озерной лягушки, биологический смысл которых пока неясен. В частности, необъясненным остается тот факт, что для лягушек яд гадюки Никольского
2339
более токсичен, чем яд гадюк номинативного подвида.
Нам представляется перспективным сравнительный анализ ЛД50 яда одного и того же образца яда гадюк на разных пищевых объектах. Это позволит построить сравнительный ряд токсичности ядовитого секрета для нескольких видов добычи и выявить возможную связь пищевых преференций гадюк с токсичностью их ядовитого секрета.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают благодарность за помощь в отлове экспериментальных животных A.A. Клё-ниной и М.А. Храмовой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бакиев А.Г., Маленев А.Л., Четанов H.A., Зайцева О.В.,
Песков А.Н. Обыкновенная гадюка Vípera berus (Rep-tilia, Viperidae) в Волжском бассейне: материалы по биологии, экологии и токсинологии // Бюл. «Самарская Лука». 2008. Т. 17, № 4. С. 759-816.
2. Бакиев А.Г., Маленев А.Л., Зайцева О.В., Шуршина И.В.
Змеи Самарской области. Тольятти: Кассандра, 2009. 170 с.
3. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фар-
макологического эффекта // JL: Гос. изд-во мед. литры, 1963. 162 с.
4. Безруков М.Е., Гелашвили Д.Б., Силкин A.A. Методы токсикометрии в биомониторинге // Экологический мониторинг. Методы биомониторинга: Учебное пособие. Часть II. Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. 272 с.
5. Вершинин В.Л. Морфа striata и ее роль в путях адапта-
циогенеза рода Rana в современной биосфере // Доклады АН. 2004. Т. 396, №2. С. 1-3.
6. Вершинин В.Л. Морфа striata у представителей рода Rana (Amphibia, Anura) - причины адаптивности к изменениям среды // Журн. общ. биологии. 2008. Т. 69, № 1. С. 65-71.
7. Зайцева О.В Популяционные особенности ядовитого секрета обыкновенной гадюки Vípera berus (Linneaus,
1758) в Волжском бассейне: Дис. ... канд. биол. наук. Тольятти, 2011. 108 с.
8. Зиненко А.И. Особенности морфологии Vipern berus (Linnaeus, 1758) и Vipera nikolskii Vedmedeija, Grubant et Rudaeva, 1986 - следствие интрогрессивной гибридизации? II Змеи Восточной Европы: Материалы меж-дунар. конф. Тольятти, 2003. С. 20-22.
9. Маленев А.Л., Бакиев А.Г., Зайцева О.В., Шуршина И.В.
Токсичность яда обыкновенных гадюк из различных пунктов ареала // Изв. Самар. НЦ РАН. 2007. Т. 9, № 1. С. 259-261.
10. Маленев А.Л., Зайцева О.В., Бакиев А.Г., Зиненко А.И. Обыкновенная гадюка на границе речных бассейнов Волги и Дона: особенности морфологии змей и свойств ядовитого секрета в популяции из Пензенской области// Современная герпетология. 2010. Т. 10, вып. 3/4. С. 115-120.
11. Мильто К.Д. Распространение и морфологические особенности черной лесостепной гадюки // Змеи Восточной Европы: Материалы междунар. конф. Тольятти, 2003. С. 56-57.
12. Павлов A.B., Петрова И.В., Хайрутдинов И.З. К морфологии и систематике обыкновенной гадюки Vipera berus L. заповедника II Научные труды Государственного природного заповедника «Большая Кокшага». Вып. 5. Йошкар-Ола: Map. гос. ун-т, 2011. С. 278-289.
13. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. Часть 1. Гигиенические критерии состояния окружающей среды, 6. Женева, 1981.
14. Bakiev A.G., Böhme W., Joger U. Vipera (Pelias) [berus] nikolskii Vedmederya, Grubant und Rudaeva, 1986 -Waldsteppenotter II Handbuch der Reptilien und Amphibien Europas. Band ЗЯГВ: Schlangen (Serpentes) III. Viperidae. Wiebelsheim: AULA-Verlag, 2005. S. 293-309.
15. Milto K.D., Zinenko O.l. Distribution and Morphological Variability of Vipera berus in Eastern Europe II Herpe-tologia Petropolitana: Proc. of the 12th Ordinary General Meeting of the Societas Europaea Herpetologica. St. Petersburg, 2005. P. 64-73.
16. Starkov V.G., Osipov A.V., Utkin Y.N. Toxicity of venoms from vipers of Pelias group to crickets Gryllus assimilis and its relation to snake entomophagy // Toxicon. 2007. V. 49. P. 995-1001.
TOXICITY OF ADDER VIPERA BERUS VENOM FOR LAKE FROGS PELOPHYLAXRIDIBUNDUS
© 2013 A.L. Malenyov, R.A. Gorelov, A.G. Bakiev
Institute of ecology of Volga river basin of Russian Academy of Science, Togliatti
The results of definition lethal doses (DL50) of adder's venom Vpera berus from the Volga and Don bassins for juveniles of lake frog Pelophylax ridibundus are submitted in article. A venom's samples from populations with prevalence signs V. b. berus has higher DL50 values than that from populations with prevalence signs V. b. nikolskii.
Key words: adder Vipera berus, venom, toxicity, DL50, lake frog Pelophylax ridibundus.
Malenyov Andrey Lvovich, malenyov@mail.ru; Gorelov Roman Andreevich, postgraduate student, gorelov.roman@mail.ru; Bakiev Andrey Gennadievich, herpetology@list.ru
2340
