CC BY
45
Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии.
2019. - Т. 28. - № 2. - С. 273-276.
Б01 10.24411/2073-1035-2019-10229
УДК 598.115.33:615.919
СРЕДНЕСМЕРТЕЛЬНЫЕ ДОЗЫ ЛД50 ЯДОВИТОГО СЕКРЕТА ГАДЮК И МАССА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
© 2019 А.Л. Маленёв
, Р.А. Горелов, Т.Н. Атяшева
Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти (Россия)
Поступила 20.03.2019
В статье приведены результаты определения среднесмертельных доз ЛД50 ядовитого секрета обыкновенной Vipera berus и восточной степной V. renardi гадюк на разных экспериментальных животных, являющихся в природе их пищевыми объектами (прямокрылые насекомые, земноводные, мышевидные грызуны). Установлены значения ЛД50 для яда V. renardi на банановых сверчках разной массы, ядовитого секрета V. renardi и V. berus на сеголетках озерной лягушки разных весовых групп и яда V. berus для самцов и самок мышей разной массы. Для исследованных видов животных и яда обоих видов гадюк отмечена общая тенденция снижения значений ЛД 50 при увеличении массы экспериментальных животных. При этом на имеющемся экспериментальном материале статистически значимых различий в значениях ЛД 50, определенных на животных одного вида разной массы, выявить не удалось.
Ключевые слова: обыкновенная гадюка Vipera berus, восточная степная гадюка Vipera renardi, ядовитый секрет, среднесмертельная доза ЛД50, мыши, лягушки, сверчки.
Malenyov A.L., Gorelov R.A., Atyasheva T.N. Half-lethal doses DL50 of a vipers venoms and mass of the experimental animals. - The article presents the results of determining the half-lethal doses (DL50) of the snake venoms of common adders Vipera berus and eastern steppe vipers V. renardi on various animals that are in nature their food objects (insects, amphibians, mouse-like rodents). The DL50 values for V. renardi venom on banana crickets of different mass, venoms of V. renardi and V. berus on lake frog fingerlings of different body weight and V. berus venom for male and female mice of different mass were established. For the studied species of animals and the venoms of both species of vipers, there is a general tendency for the DL50 values to decrease with increasing mass of experimental animals. At the same time on the available experimental material statistically significant differences in the values of DL50, determined on animals of the same species but different mass, could not be identified.
Key words: common adder Vipera berus, eastern steppe viper Vipera renardi, snake venom, half-lethal dose DL50, crickets, frogs, mice.
ВВЕДЕНИЕ вводимого ядовитого секрета (Беленький,
_ „ 1963). ЛД50, выраженная в мкг/г (или мг/кг),
Определение среднесмертельной дозы ЛД50 „
50 отражает ту дозу яда, при которой наблюдается ядовитых веществ (в том числе и ядовитого
v гибель 50% экспериментальных животных.
секрета змей) предполагает построение зависимости эффекта воздействия яда (летальности экспериментальных животных) от количества
Определение ЛД50 яда гадюк в «классическом» варианте предполагает инъекцию раствора ядовитого секрета в возрастающих дозах экспери---ментальным животным одинаковой массы,
Маленёв Андрей Львович, к.б.н., заведующий лабо- сформированным в группы, и на кажд°й группе
раторией герпетологии и токсинологии, животных анализируют одну дозу яда (Гела-
[email protected]; Горелов Роман Андреевич, к.б.н., швили и др., 2015). В токсинологическом экс-
мл. научный сотрудник той же лаборатории, перименте по определению ЛД50 необходимо
[email protected]; Атяшева Татьяна Никола- использовать животных одинаковой массы, од-
евна инженер-исследователь той же лаборатории, ного пола, содержащихся в одинаковых усло-tatyana. atyasheva@mail. т
виях (режим кормления, температура и. т.п.). В частности, в экспериментах на мышах рекомендовано использовать мышей-самцов массой 20,0±1,0 г. При таком подходе сводятся к минимуму и половые различия, и различия, обусловленные онтогенетическими особенностями. Ранее было показано на ядовитом секрете четырех подвидов гадюк (V. Ь. berus, V. Ь. тЫ-skii, V. г. ^т^, V. г. bashkirovi), что в наших экспериментальных условиях самцы и самки мышей обладают одинаковой устойчивостью к их яду (Горелов, 2018). Значения ЛД50 яда восточных степных гадюк, определенные на самцах и самках банановых сверчков, также не имеют статистически значимых различий (Ма-ленёв и др., 2016). Поэтому цель настоящего исследования - выявить возможную зависимость значений ЛД 50 ядов обыкновенной и восточной степной гадюк от массы экспериментальных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ядовитый секрет гадюк. Объединенные образцы ядовитого секрета обыкновенной V. berus и восточной степной V. ^т^ гадюк из разных локалитетов на территории Волжского
бассейна были получены ранее (2013-2017 гг.) в ходе плановых экспедиций. Все процедуры получения ядовитого секрета проводили в лаборатории стандартными методами (Маленёв и др., 2014). Выбор именно этих образцов ядовитого секрета гадюк был обусловлен тем, что их количества было достаточно для проведения серии токсинологических экспериментов.
Сверчки. В экспериментах по определению ЛД50 на насекомых использовали культуру банановых сверчков Gryllus assimilis, которых содержали и разводили в лаборатории. В экспериментах использовали водный раствор яда в концентрации 2,0 мг/мл, и определение ЛД50 яда гадюк проводили на группах сверчков массой 0,40-0,49, 0,50-0,59, 0,60-0,69 и 0,70-0,79 г, в которых присутствовали и самцы, и самки сверчков. На каждой весовой группе было проанализировано 6 доз яда (5-10-20-30-40-60 мкг/г) по 5 сверчков для каждой дозы (таблица). Водные растворы яда вводили сверчкам внутрибрюшинно с помощью микрошприца (1 -30 мкл) в правую нижнюю четверть брюшка с дорзальной стороны.
Таблица
Характеристика гадюк, от которых получен яд, и экспериментальных животных
Вид гадюк Место отлова гадюк Экспериментальные животные Пол экспериментальных животных Масса животных в группе, г п
V. ^т^ Волгоградская обл., Камышинский р-н, окрестности с. Верхняя Добринка банановые сверчки самцы и самки 0,40-0,49 30
0,50-0,59 30
0,60-0,69 30
0,70-0,79 30
V. berus Новгородская обл., Боровичский р-н, окрестности с. Опеченский посад озерные лягушки самцы и самки 1,6-2,0 30
2,1-2,5 30
3,6-4,0 30
V. ^т^ Волгоградская обл., Камышинский р-н, окрестности с. Верхняя Добринка 1,6-1,8 25
2,6-3,0 25
3,6-4,0 25
V. berus г. Самара, Красноглинский р-н лабораторные мыши самцы 14,0-16,5 12
19,5-21,0 12
25,0-29,0 12
самки 14,0-16,5 12
19,5-21,0 12
25,0-29,0 12
Лягушки. Для определения ЛД50 ядов гадюк для земноводных использовали сеголетков озерной лягушки Pelophylax ridibundus, которые были отловлены в пойме р. Ахтуба (Красноярский район Астраханской области, окрестности ст. Досанг) в конце августа - начале сентября 2013 г. (Маленёв и др., 2013).
Ядовитый секрет обыкновенных гадюк ана-
лизировали на лягушках трех групп с массой 1,6-2,0 г, 2,0-2,5 г и 3,6-4,0 г. Водный раствор яда использовали в концентрации 5,0 мг/мл, и в каждой весовой группе анализировали 6 доз (510-20-40-60-80 мкг/г) по 5 лягушек для каждой дозы (таблица).
Определение ЛД50 яда восточных степных гадюк проводили на лягушках массой 1,6-1,8 г,
2,6-3,0 г и 3,6-4,0 г. В каждой весовой группе было проанализировано 5 доз яда (5-10-15-2030 мкг/г), также по 5 лягушек (таблица). Водные растворы яда вводили лягушкам внутри-брюшинно в правую нижнюю четверть брюшка с вентральной стороны.
Мыши. Белых лабораторных мышей Mus musculus содержали и разводили в виварии в стандартных клетках для мелких грызунов. В экспериментах использовали группы мышей (отдельно самцов и самок) с массами 14,0-16,5, 19,5-21,0 и 25,0-29,0 г. Яд растворяли в физиологическом растворе до концентрации 3,0 мг/мл и анализировали 4 дозы (0,5-1,0-2,0-3,0 мкг/г) по 3 мыши в каждой группе (таблица). Раствор ядовитого секрета вводили мышам также внутрибрюшинно в правую нижнюю четверть брюшка с вентральной стороны.
Токсикометрия. Наблюдения за животными проводили в течение 24 часов после инъекции яда, после чего подсчитывали количество погибших и выживших животных. В качестве
контроля использовали группы животных, которым вместо раствора яда вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В наших экспериментальных условиях все животные контрольных групп оставались живыми в течение времени наблюдения. Эксперименты по токсикометрии проводили при комнатной температуре (22-25°С).
Пробит-анализ. Для каждой весовой группы разных видов экспериментальных животных значение среднесмертельной дозы ЛД50 рассчитывали методом модифицированного про-бит-анализа (Безруков и др., 1995) и выражали в мкг яда/г массы тела. Достоинство данного метода заключается в том, что с его помощью можно рассчитать не только среднее значение ЛД50, но и ошибку средней (M±m), а также провести сравнительный анализ токсичности разных образцов яда. Сравнение значений средне-смертельных доз проводили методами параметрической статистики с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).
о
1Л
CI с;
о
1Л
CI с;
80 70 60 50 40 30 20 10 0
40 35 30 25 20 15 10 5 0
А
1,6-2,0 2,1-2,5 3,6-4,0
масса лягушек, г
В
0,40-0,49 0,50-0,59 0,60-0,69 0,70-0,79 масса сверчков, г
о m
cl с;
35 30 25 20 15 10 5 0
Б
3,00
а
S 2,50
сэ
m
cl 2,00 с;
1,50 1,00 0,50 0,00
1,6-1,8 2,6-3,0 3,6-4,0
масса лягушек, г
□ самцы □ самки
Г
14,0-16,5 19,5-21,0 25,0-29,0
масса мышей, г
Рис. Значения ЛД50, определенные на экспериментальных животных разной массы
(А - сеголетки озерной лягушки, ядовитый секрет Vipera berus; Б - сеголетки озерной лягушки, ядовитый секрет V. renardi; В - банановые сверчки, ядовитый секрет V. renardi; Г - самцы и самки лабораторных мышей, ядовитый секрет V. berus)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты определения ЛД50 ядов гадюк на экспериментальных животных разной массы тела представлены на рисунке (А, Б, В, Г). В диаграммах приведены средние значения ЛД50 и их 95%-ные доверительные интервалы. Данные виды экспериментальных животных выбраны по той причине, что в природе они являются пищевыми объектами гадюк - в частности, мышевидные грызуны входят в состав рациона обоих видов гадюк, прямокрылые насекомые составляют значительную часть рациона восточных степных гадюк, а земноводные являются пищевыми объектами обыкновенных гадюк (Bakiev u.a., 2005; Бакиев и др., 2008а, б, 2015).
Как видно из представленных диаграмм, наблюдается общая тенденция - чем больше масса животных в группе, тем меньше абсолютное значение ЛД 50, т.е. с увеличением массы животных в группах экспериментально определенные значения ЛД50 снижаются. Это отмечено для ядовитого секрета обоих видов гадюк и трех разных видов экспериментальных животных (рисунок). Но при сравнении значений ЛД 50 яда, определенных на животных одного вида разной массы, статистически значимых различий выявить не удалось - отмеченные на диаграмме доверительные интервалы
средних значений ЛД 50 перекрываются.
Тем не менее, полученные результаты позволяют сформулировать замечания, которые следует учитывать на практике при планировании и проведении токсинологических экспериментов: увеличение массы животных в испытуемых группах приводит к некоторому занижению значений ЛД 50 в опыте, а расширение диапазона масс животных в группах приводит к увеличению ошибки при экспериментальном определении ЛД50.
ВЫВОДЫ
Представленные выше результаты определения среднесмертельных доз ЛД 50 ядовитого секрета обыкновенной и восточной степной гадюк свидетельствуют о наличии общей тенденции снижения значений ЛД50 при увеличении массы экспериментальных животных. Данная тенденция отмечена для всех рассмотренных видов экспериментальных животных (сверчки, лягушки, мыши). При этом статистически значимых различий при сравнении величин ЛД 50, определенных на животных одного вида разной массы, на имеющемся экспериментальном материале нам выявить не удалось.
Авторы выражают признательность А.Г. Бакиеву и А.А. Клёниной за помощь в сборе материала и консультации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бакиев А.Г., Гаранин В.И., Гелашвили Д.Б. и
др. Гадюки (Reptilia: Serpentes: Viperidae: Vipera) Волжского бассейна. Часть 1. Тольятти: Кассандра, 2015. 234 с.
Бакиев А.Г., Гаранин В.И., Павлов А.В., Шуршина И.В., Маленев А.Л. Восточная степная гадюка Vipera renardi (Reptilia, Viperidae) в Волжском бассейне: материалы по биологии, экологии и токсинологии // Бюл. «Самарская Лука». 2008а. Т. 17, № 4. С. 817-845.
Бакиев А.Г., Маленев А.Л., Четанов Н.А., Зайцева О.В., Песков А.Н. Обыкновенная гадюка Vipera berus (Reptilia, Viperidae) в Волжском бассейне: материалы по биологии, экологии и токсино-логии // Бюл. «Самарская Лука». 2008б. Т. 17, № 4. С. 759-816.
Безруков М.Е., Гелашвили Д.Б., Силкин А.А.
Методы токсикометрии в биомониторинге // Экологический мониторинг. Методы биомониторинга: Учебное пособие. Часть II. Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. 272 с.
Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Медгиз, 1963. 152 с.
Гелашвили Д.Б., Крылов В.Н., Романова Е.Б.
Зоотоксинология: биоэкологические и биомедицинские аспекты. Учебное пособие. Нижний Новгород:
Изд-во ННГУ, 2015. 770 с.
Горелов Р.А. Ядоотдача и токсичность ядовитого секрета гадюк Волжского бассейна: Дис. ... канд. биол. наук. Тольятти: ИЭВБ РАН, 2018. 114 с.
Лакни Г.Ф. Биометрия. Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
Маленёв А.Л., Горелов Р.А., Атяшева Т.Н., Бакиев А.Г. Ядоотдача и свойства ядовитого секрета восточной степной гадюки Vipera renardi в разное время сезонной активности // Совр. герпетология. 2016. Т. 16, вып. 3/4. С. 129-134.
Маленёв А.Л., Горелов Р.А., Бакиев А.Г. Токсичность яда обыкновенной гадюки Vipera berus для озерных лягушек Pelophylax ridibundus // Изв. Са-мар. НЦ РАН. 2013. Т. 15, № 3 (7). С. 2337-2340.
Маленёв А.Л., Макарова Т.Н., Горелов Р.А. Особенности ядовитого секрета гадюки Ренара (Vipera renardi) из Волгоградской области // Изв. Самар. НЦ РАН. 2014. Т. 16, № 1. С. 261-265.
Bakiev A.G., Böhme W., Joger U. Vipera (Pelias) [berus] nikolskii Vedmederya, Grubant und Rudaeva, 1986 - Waldsteppenotter // Handbuch der Reptilien und Amphibien Europas. Band 3/IIB: Schlangen (Serpentes) III. Viperidae. Wiebelsheim: AULA-Verlag, 2005. S. 293-309.
