CC BY
48
УДК 574.64:561.273
К.С. Пикула, Ж.В. Маркина, А.М. Захаренко, В.В. Чернышев, В.В. Чайка, К.С. Голохваст
ТОКСИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ ТВЕРДЫХ ЧАСТИЦ ВЫХЛОПНЫХ ГАЗОВ АВТОТРАНСПОРТА НА КЛЕТКИ МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ PORPHYRIDIUMPURPUREUM И HETEROSIGMA AKASHIWO
Изучено влияние твердых частиц выхлопных газов авто-, мототранспорта и спецтехники с разными типами двигателей, использующих разные виды топлива, на микроводоросли Porphyridium purpureum и Heterosigma akashiwo. Для определения ответных реакций клеток на их токсическое воздействие определяли изменение размеров клеток, скорости их роста, уровень их эстеразной активности, мембранный потенциал, интенсивность флуоресценции хлорофилла а. Для определения всех перечисленных показателей использовали метод проточной флуоресцентной цитометрии. Показано, что наибольшее негативное влияние на жизнеспособность микроводорослей оказывают твердые частицы выхлопных газов автотранспорта, работающего на дизельном топливе, и что указанные виды микроводорослей можно использовать в качестве тест-объектов для оценки уровня токсичности твердых частиц выхлопных газов. Установлено, что таковая возрастает по мере увеличения объема двигателя транспортного средства. Прямая зависимость уровня токсичности твердых частиц от пробега и года выпуска транспортного средства не обнаружена.
Ключевые слова: твердые частицы выхлопных газов, экотоксикология, микроводоросли, тест-объект, Porphyridium purpureum, Heterosigma akashiwo.
K.S. Pikula, Zh.V. Markina, A.M. Zakharenko, V.V. Chernyshev, V.V. Chaika, K.S. Golokhvast
TOXIC EFFECTS OF VEHICLE EXHAUST PARTICLES ON MARINE MICROALGAE PORPHYRIDIUMPURPUREUM AND HETEROSIGMA AKASHIWO
The influence of particulate matter (PM) emitted by automobiles, motorcycles and specialized vehicle with different types of engines and powered by different types of fuel on the microalgae Porphyridium purpureum and Heterosigma akashiwo was studied. Changes in cell size, growth rate, level of esterase activity, membrane potential, chlorophyll a fluorescence intensity were used to determine the response of cells to the toxic effects of studied particles. Flow fluorescence cytometry was used to determine all the listed parameters. It has been shown that PM emitted by vehicles powered by diesel fuel have the greatest negative impact on the viability of microalgae and that used microalgae species can be useful test objects for assessing the toxicity level of vehicle emitted particles. It was established that the level of vehicle emitted particle toxicity increases if the volume of the vehicle engine increases. The influence of the mileage and vehicle manufacture year on the toxicological properties of emitted particles was not detected.
Key words: particulate matters of the exhausted gases, ecotoxicology, microalgae, test object, Porphyridium purpureum, Heterosigma akashiwo.
DOI: 10.17217/2079-0333-2019-47-86-95
Введение
Выхлопные газы автотранспорта являются крупнейшим источником поступления твердых частиц в атмосферу городских территорий. Твердые частицы, выбрасываемые автотранспортом, способны оказывать негативное влияние на живые организмы от бактерий до высших животных и человека [1, 2]. В 2013 г. Международное агентство по исследованию рака (International Agency for Research on Cancer, IARC) классифицировало загрязнение воздуха (включая автомобильные выхлопы) как канцерогенный для человека фактор [3]. За последние десятилетия многие исследования в этой области были направлены на разработку технических и технологических решений и нормативных ограничений, которые позволили бы снизить содержание твердых частиц в выхлопных газах автомобилей [4-6].
Состав твердых частиц выхлопов автотранспорта отличается в зависимости от типа двигателя, пробега транспортного средства, используемого им вида топлива и смазочных масел [7-9]. Следовательно, воздействие частиц выхлопов разных единиц автотранспорта на живые организ-
мы может сильно различаться. Это вызывает необходимость комплексной оценки токсичности твердых частиц выхлопных газов.
Значение одноклеточных организмов, в частности микроводорослей, как биоиндикаторов загрязнения широко известно. Эксперименты, направленные на изучение изменений их развития и функционирования в токсической среде позволяют понять влияние тех или иных токсикантов на клеточные структуры и их функции. Основным продуцентом органического вещества в водной среде является фитопланктон. Поскольку он находится в основании трофической пирамиды, изменение его численности и биоаккумуляция им токсичных веществ способны оказать влияние на все последующие звенья пищевой цепи, прежде всего, на зоопланктон и рыб и в итоге на человека. В связи с вышесказанным изучение влияния на микроводоросли токсических веществ, и в частности твердых частиц выхлопных газов авто-, мототранспорта и спецтехники с разными типами двигателей, использующими разные виды топлива, является весьма актуальным.
Материалы и методы
Твердые частицы выхлопных газов автотранспорта
С учетом классификации и системы обозначения автомобильного подвижного состава, а также его агрегатов и узлов, выпускаемых специализированными предприятиями (ОН 025270-66), и рекомендаций Европейской экономической комиссии для проведения экспериментов были выбраны наиболее значимые с точки зрения воздействия на окружающую среду и широко представленные в городах типы автомобилей. Пробы твердых частиц были отобраны от автомобилей, заправлявшихся бензином и дизельным топливом одной марки на заправочной станции одной и той же нефтяной компании.
Для получения суспензии выхлопных газов (СВГ) и проведения замеров были использованы следующие материалы и оборудование: пластиковая тара вместимостью 20 л, шланги из поливинилхлорида (длиной 1 м и диаметром 50 мм, отдельные для каждого замера), вода дистиллированная (объем 10 л на каждый замер). Пропускание выхлопных газов через воду выполнялось с целью охлаждения и улавливания большей части содержащихся в них твердых частиц. Анализ литературных источников показал, что при использовании воды для нейтрализации выхлопных газов двигателей внутреннего сгорания достигается высокая степень поглощения твердых частиц. Перед отбором взвеси пластиковую тару и шланги промывали дистиллированной водой, полученной на установке «SGWASSER Ultra Clear TWF/EL-ION UV plus TM» (Siemens, Berlin, Germany).
Замеры проводили в соответствии с запатентованной методикой (Пат. РФ № 2525051). Транспортные средства, использованные в эксперименте, приведены в табл. 1.
Таблица 1
Перечень транспортных средств, использованных в эксперименте
№, п/п Кодовое обозначение транспортного средства Объем двигателя, см3 Год выпуска Топливо
1 HusTE 300 2013 АИ-92 + АИ-95
2 HonVT 1 300 2013 АИ-95
3 TMar2 2 500 2003 АИ-92
4 THi 3 000 2005 ДТ
5 MiPaj 3 000 2005 АИ-95
6 TLC80 2 500 1997 ДТ
7 KomPC 8 300 2006 ДТ
Культуры микроводорослей
Культуры микроводорослей были предоставлены Центром коллективного пользования Ресурсной коллекцией «Морской биобанк» Национального научного центра морской биологии (ННЦМБ) ДВО РАН. Биоиспытания токсичности образцов топлива были проведены на двух видах морских микроводорослей, собранных в заливе Петра Великого (Японское море, Приморский край) Porphyridium purpureum и Heterosigma akashiwo. Первая принадлежит к красным водорослям, вторая - к динофлагеллятам. Изолированные из фитопланктона микроводоросли культивировали в среде f/2 [10]. Для ее приготовления использовали фильтрованную морскую воду (диаметр пор фильтра 0,22 мкм), соленостью 33 ± 1%о, pH 8,0 ± 0,2.
Культивирование проводили при температуре 20 ± 2°С, интенсивности освещения 300 мкмоль фотонов/м2 • с и фотопериоде 12 : 12 ч. Для испытаний отбирали культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста с плотностью (1-5) х 103 кл./мл.
Биоиспытания
Экспозицию клеток микроводорослей с тестируемыми образцами твердых частиц выхлопных газов проводили в 24-луночных планшетах при концентрациях частиц 1, 10, 100 мг/л. Микроводоросли в среде f/2 без добавления образцов твердых частиц использовали как контрольную группу. Для каждой концентрации твердых частиц и группы контроля было сделано по четыре повторности. Объем аликвоты микроводорослей в каждой повторности был 2 мл.
Регистрация гибели клеток микроводорослей, изменений в их морфологии и биохимических показателей, происходящих при воздействии твердых частиц выхлопных газов автотранспорта, выполнялась с помощью проточного цитофлюориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, США) с программным пакетом CytExpert v.2.0. Оценку уровня токсичности и механизмов токсического действия исследуемых образцов твердых частиц на микроводоросли проводили с использованием специфических флуоресцентных красителей (биомаркеров). Во всех случаях в качестве источника возбуждающего света использовали синий лазер (488 нм) проточного цитофлуориметра CytoFLEX, так как свет данной длины волны соответствует максимуму абсорбции используемых биомаркеров, их метаболитов и хлорофилла а. Для регистрации показателей флуоресценции каждого биомаркера были использованы фильтры эмиссии, подобранные в соответствии с максимумом эмиссии, заявленным производителем биомаркеров (Molecular Probes, США) или указанных в научной литературе. Каждую пробу измеряли при скорости потока 100 мкл/мин в течение 35 с. Ответные реакции клеток, определяемые в процессе биоиспытаний и условия их регистрации, приведены в табл. 2.
Таблица 2
Критерии оценки токсичности и условия их регистрации
Параметр Время измерения Биомаркер Фильтр эмиссии, нм
Жизнеспособность 24 ч, 96 ч, 7 сут Йодид пропидия, PI ECD (Оранжевый), 610
Размер 96 ч, 7 сут Прямое светорассеяние FSC (прямое светорассеяние синего лазера)
Интенсивность флуоресценции хлорофилла а 96 ч, 7 сут Авто флуоресценция PC5.5 (Красный), 690
Ферментативная (эстеразная) активность 3 ч, 24 ч Флуоресцеин диацетат, FDA FITC (Зеленый), 525
Мембранный потенциал 6 ч, 24 ч 3, 3 - дигексилоксакарбоцианин иодид, DIOC6 FITC (Зеленый), 525
Для определения размера клеток микроводорослей с помощью проточного цитофлуориметра, для канала прямого светорассеяния FSC был использован набор калибровочных частиц (партия F13838, Molecular probes, США) с размерами 1, 2, 4, 6, 10, 15 мкм.
Изменение фотосинтезирующей способности микроводорослей является чувствительным показателем токсичности, а измерение флуоресценции хлорофилла a - эффективным и быстрым способом, позволяющим выявить вещества и условия среды, оказывающие влияние на фотосинтез микроводорослей [11-13].
Энергия света, поглощаемая молекулой хлорофилла, может быть использована тремя путями: непосредственно для фотосинтеза, рассеиваться в виде тепла или переизлучаться как свет (флуоресценция). Поскольку эти процессы взаимосвязаны, увеличение интенсивности одного из них приводит, соответственно, к уменьшению интенсивности одного или двух других, что позволяет при увеличении интенсивности флуоресценции хлорофилла и образовании клетками микроводорослей тепла судить о падении уровня фотосинтеза, оценивать уровень токсичности ксенобиотиков и механизмы их влияния на клетку [14].
В экспериментах с микроводорослями P. purpureum и H. akashiwo на точечной цитограмме FSC/SSC (отношение прямого и бокового светорассеяния синего лазера проточного цитометра CytoFLEX) была выделена область, включающая в себя однородное множество зарегистрированных событий. В дальнейшем из событий, зарегистрированных в данной области, отобраны
только те, которые имели интенсивный сигнал в канале эмиссии PC5.5, соответствующем автофлуоресценции хлорофилла a. При сравнении влияния токсикантов на микроводоросли использовали условные единицы флуоресценции клеток. Таким образом, с помощью проточного цито-метра CytoFLEX определяли количество и изменение физиологических показателей клеток микроводорослей.
Для оценки жизнеспособности, эстеразной активности и мембранного потенциала каждого вида микроводорослей была проведена серия предварительных измерений с целью выявления оптимальных концентраций флуоресцентных красителей и времени экспозиции клеток с красителем.
Жизнеспособность клеток оценивали в ходе окрашивания йодидом пропидия (PI) в соответствии со стандартным протоколом биоиспытаний [15]. Механизм действия PI основан на встраивании его между парами оснований ДНК или РНК и увеличении при этом интенсивности флуоресценции красителя в 20-30 раз [16]. Поскольку PI не способен проникать сквозь мембрану живых клеток, по интенсивности свечения в фильтре эмиссии ECD можно судить о количестве мертвых клеток. Оптимальная концентрация PI и время экспозиции красителя для каждого вида микроводорослей были определены с использованием мертвых клеток, выдержанных вердо-тельном климатстате в течение 10 мин при температуре 99°С (отрицательный контроль), живых клеток (положительный контроль) и смеси живых и мертвых клеток в соотношении 1 : 1. Исходный раствор (1,5 мМ) готовили путем разведения 1 мг PI в 1 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор получали разбавлением исходного раствора дистиллированной водой до 500 мкМ. К каждой группе клеток был добавлен PI в концентрациях от 5 до 100 мкМ. Измерения уровня флуоресценции красителя проводили в течение 30 мин с шагом 5 мин.
Для обоих изученных видов, P. purpureum и H. Akashiwo, оптимальная концентрация PI составила 20 мкМ, а время окрашивания - 10 мин.
Эстеразную активность микроводорослей до и после воздействия токсикантов оценивали с помощью нефлуоресцентного липофильного красителя диацетата флуоресцеина (FDA), который легко проникает сквозь клеточную стенку микроводорослей и разлагается неспецифическими эстеразами внутри живых клеток с образованием ярко светящегося в желто-зеленом спектре флуоресцеина [17]. Таким образом, по интенсивности свечения флуоресцеина внутри клеток можно сделать вывод об эстеразной активности микроводорослей. При добавлении FDA средняя интенсивность флуоресценции клеток микроводорослей в связи с образованием флуоресцеина начинает резко возрастать. При достижении максимума в течение нескольких минут она остается стабильной, а затем начинает снижаться.
При работе с каждым видом микроводорослей было необходимо подобрать оптимальную концентрацию красителя и установить временной интервал, в пределах которого сохраняется максимальная интенсивность флуоресценции. Для этого разведением 5 мг FDA в 1 мл ацетона готовили исходный раствор (12 мМ), из него путем разбавления дистиллированной водой получали рабочий раствор (1 мМ). К каждой группе клеток добавляли FDA в концентрациях от 1 до 50 мкМ. Измерения проводились в течение 60 мин с шагом 2 мин. Для P. purpureum оптимальная концентрация FDA составила 15 мкМ, а время окрашивания - 18-28 мин, для H. akashiwo 5 мкМ и 24-34 мин соответственно.
Мембранный потенциал клеток микроводорослей оценивали с помощью липофильного, положительно заряженного флуоресцентного красителя йодида 3,3'-дигексилоксакарбоцианина (DiOC6), способного связываться с мембранами митохондрий, эндоплазматического ретикулума и другими гидрофобными отрицательно заряженными структурами клеток. В случае гиперполяризации (увеличения мембранного потенциала), при которой внутренние мембраны клетки становятся более электроотрицательными, чем окружающая среда, происходит поглощение красителя. Если мембранный потенциал уменьшается и клетка становится менее электроотрицательной, чем среда (деполяризация), происходит удаление красителя из клетки.
Для определения оптимальных значений концентрации и времени экспозиции микроводорослей с DiOC6, при которых наблюдается максимальная интенсивность флуоресценции красителя, сохраняющаяся в течение некоторого периода времени, разбавлением 5,7 мг DiOC6 в 1 мл ацетона готовили исходный раствор (10 мМ), из которого затем путем разведения дистиллированной водой получали рабочий раствор (100 мкМ). Краситель DiOC6 добавляли к клеткам микроводорослей в концентрациях от 0,1 до 5 мкМ. Измерения проводили в течение 35 мин с шагом
5 мин. Для P. purpureum оптимальная концентрация DiOC6 составила 1,5 мкМ, а время окрашивания - 15-25 мин, для H. akashiwo - 0,5 мкМ и 20-30 мин соответственно.
Статистический анализ
Статистический анализ был проведен с помощью программного пакета GraphPad Prism 7.04 (GraphPad Software, США).
Результаты и обсуждение
Для всех исследуемых образцов были определены концентрации, при которых скорость роста клеток, интенсивность флуоресценции FDA и интенсивность флуоресценции DiOC6 снижаются на 50% (EC50) в сравнении с контролем. Величины EC50, полученные на основе данных проточной цитометрии и рассчитанные в программном пакете GraphPad Prism 7.04, представлены в табл. 3. В незаполненных ячейках табл. 3 зафиксировано отсутствие статистически значимого воздействия исследуемого образца твердых частиц выхлопных газов на клетки микроводорослей. Данные о приросте популяции микроводорослей и увеличении интенсивности флуоресценции FDA и DiOC6 приведены для концентрации твердых частиц 100 мг/л в сравнении с группой контроля.
Как видно из приведенной ниже табл. 3, красная водоросль P. purpureum показала значительно более высокую чувствительность к воздействию всех образцов твердых частиц выхлопных газов, при этом по мере увеличения времени их воздействия на растения от 24 ч до 7 сут токсическое воздействие всех исследуемых частиц уменьшалось. Наиболее токсичными для обоих видов микроводорослей оказались образцы частиц KomPC, и TLC80. При этом частицы KomPC показали сохраняющийся в динамике для всех определяемых показателей уровень токсичности для H. akashiwo, а для P. purpureum - высокий уровень острой токсичности (24 ч и 96 ч) и более низкий уровень хронической токсичности (7 сут). Частицы от THi и MiPaj вызвали гибель и значительное замедление роста численности популяции только у P. purpureum. В культурах H. akashiwo частицы от THi уменьшили численность популяции водорослей на 30-35% при концентрации частиц 100 мг/л только после 24 ч экспозиции, но в последующем отрицательный эффект исчезал. На воздействие частиц MiPaj у микроводоросли H. akashiwo ни по одному из определяемых показателей токсичности ответ не наблюдался. Частицы HusTE при концентрации 100 мг/л оказали позитивный эффект на скорость роста популяции при 96 ч экспозиции. На 7-е сутки эксперимента наблюдалось незначительное ингибирование развития вида.
Таблица 3
Показатели физиологического состояния клеток микроводорослей Porphyridium purpureum и Heterosigma akashiwo при воздействии на них твердых частиц выхлопных газов разных транспортных средств в соответствии с величиной средней эффективной концентрации в 50% случаев
(EC50, при доверительном интервале 95%)
Транспортное средство Жизнеспособность, EC50 (мг/л) Эстеразная активность (изменение интенсивности флуоресценции FDA), EC50 (мг/л) Мембранный потенциал (изменение интенсивности флуоресценции DiOC6), EC50 (мг/л)
24 ч 96 ч 7 сут 3 ч 24 ч 6 ч 24 ч
1 2 3 4 5 6 7 8
Porphyridium purpureum
HusTE 219,7 (214,5-225) - - 217,8 (210,7-225,3) 220,8 (215,7-226) Увеличение на 39-40% Увеличение на 44-58%
HonVT 130,1 (127,5-132,7) - - 59,3 (58,8-59,9) 101,2 (100,4-102,1) 218,9 (210,3-228,1) 169,7 (168,6-170,7)
TMar2 72,7 (70,1-74,5) - - 246,4 (244,1-248,8) - 155,7 (154,5-156,9) 105,9 (104,4-107,3)
THi 9,1 (8,9-9,2) 28,3 (27,6-29) 54,57 (52,6-56,6) - - 47,6 (46,7-47,4) 70,6 (73,1-74,2)
MiPaj 33,7 (33,3-34,2) 149,1 (141,3-157,4) - 183 (176,3-190,2) 190,2 (188-192,4) - 165,5 (163,4-167,6)
TLC80 31,3 (30,1-31,7) 46,1 (45,1-47,1) 119,3 (114,3-124,6) 50,9 (50,2-51,7) 47,8 (47-48,7) 57,5 (56,9-58) 129,6 (124,2-135,4)
KomPC 14,9 (14,5-15,2) 13,6 (13,3-13,9) 70,4 (67,4-73,6) - 62 (61,3-62,8) 19 (18,7-19,3) 25,3 (24,9-25,7)
Окончание табл. 3
i 2 4 7 в
Heterosigma akashiwo
HusTE - Прирост на 23-28% 125,3 (114,9-132,9) - 144,6 (142,1-147,2) - -
HonVT - - Прирост на 27-55% Увеличение на 6-10% Увеличение на 12-18% - 212,9 (208,7-217,1)
TMar2 - - 155,5 (149,8-161,6) - - - -
THi 189,5 (188,9-190,2) - - Увеличение на 10-13% Увеличение на 13-17% 48,4 (47,8-48,9) 68,1 (67,1-69,2)
MiPaj - - - - - - -
TLC80 - 135,6 (134,1-137,1) 187,9 (181,2-194,9) - - 103 (102-104,1) 125,2 (123,8-126,8)
KomPC 46,3 (44,7-48) 47,9 (46,2-49,8) 48,8 (46,9-50,8) - - 18 (17,8-18,2) 48,3 (47,9-48,7)
У динофитовой водоросли H. akashiwo ингибирование эстеразной активности практически отсутствовало. К 24-му часу экспозиции при концентрации 100 мг/л частиц HusTE наблюдалось снижение уровня флуоресценции FDA на 26-28% по сравнению с контролем. Остальные образцы твердых частиц не вызвали ингибирования флуоресценции FDA у H. akashiwo, в то время как частицы HonVT и THi вызвали незначительное увеличение эстеразной активности клеток.
Для водоросли P. purpureum по степени снижения эстеразной активности наиболее токсичными оказались частицы TLC80 и HonVT как после 3 ч, так и после 24 ч экспозиции, частицы KomPC вызвали значительное ингибирование флуоресценции FDA только после 24 ч экспозиции.
Наибольшую токсичность, судя по снижению мембранного потенциала у обоих видов микроводорослей, проявили частицы KomPC. Значительное ингибирование флуоресценции DiOC6 было зарегистрировано у обоих водорослей при воздействии частиц THi и TLC80.
Влияние частиц выхлопных газов автотранспорта на интенсивность флуоресценции хлорофилла а микроводорослей P. purpureum и H. akashiwo представлено на рис. 1. Наибольшее увеличение интенсивности флуоресценции и, как следствие, снижение интенсивности фотосинтеза для обоих видов микроводорослей вызывают образцы, полученные от KomPC и TLC80. Частицы от THi также показали высокий уровень воздействия на интенсивность флуоресценции хлорофилла а, но эффект для P. purpureum оказался значительно большим, чем для частиц от H. akashiwo. Кроме этого, частицы от KomPC, TLC80 и THi показали увеличение или сохранение уровня воздействия на интенсивность флуоресценции хлорофилла а при оценке хронической токсичности (7 сут). Частицы от HusTE показали самый низкий уровень воздействия, стремящийся к группе контроля (100%). Частицы от HonVT, TMar2 и MiPaj оказали воздействие на уровень флуоресценции хлорофилла а только после 96-часовой экспозиции. На 7-е сут эксперимента отрицательный эффект стал минимальным.
Изменение размеров клеток водорослей при воздействии на них твердых частиц выхлопных газов автотранспорта представлено на рис. 2. Для изучения влияния твердых частиц на размерную структуру популяции P. purpureum представители этого вида были разделены на три группы: с размерами клеток 4-6 мкм, 6-10 мкм и 10-15 мкм. В контрольной популяции 31-35% клеток принадлежали к первой группе, а 55-60% - ко второй. Популяция H. akashiwo была разделена на размерные группы 6-10 мкм, 10-15 мкм и более 15 мкм. В контроле 30-31% принадлежали к первой группе, 68-70% ко второй.
Воздействие частиц от автотранспортных средств KomPC, TLC80 и THi вызвало наиболее существенное увеличение размеров клеток у обоих видов микроводорослей. У P. purpureum воздействие частиц TLC80 в концентрации 100 мг/л привело к практически полному исчезновению клеток размером 4-6 мкм и увеличению доли клеток размерного диапазона 6-10 мкм до 91-93%. Воздействие частиц от KomPC и THi привело к увеличению доли клеток P. purpureum до 10-15 мкм (56-64% для KomPC и 8-14% для THi при концентрациях частиц 100 мг/л) при 96-часовой экспозиции с последующим снижением эффекта. У H. аkashiwo, в отличие от P. purpureum, эффект увеличения размера клеток при воздействии частиц KomPC, TLC80, THi и HonVT на 7 сут эксперимента усилился и привел к образованию клеток размером более 15 мкм.
Рис. 1. Изменение интенсивности флуоресценции хлорофилла а у Porphyridium purpureum и Heterosigma akashiwo после 96 ч и 7 сут экспозиции с частицами выхлопных газов автотранспорта в концентрациях 1, 10 и 100 мг/л
Рис. 2. Изменение размера клеток водорослей P. purpureum и H. akashiwo на 96 ч и 7 сут экспозиции с частицами выхлопных газов автотранспорта в концентрациях 1, 10 и 100 мг/л
Заключение
Результаты экспериментов показывают, что твердые частицы выхлопных газов, полученные от транспортного средства KomPC, проявляют наивысший уровень острой токсичности (EC50, 96 ч экспозиции) при оценке их влияния на жизнеспособность клеток и их мембранный потенциал у обоих видов микроводорослей, использовавшихся в качестве тест-объектов. Частицы KomPC проявили такой же высокий уровень негативного влияния на жизнеспособность клеток водоросли H. akashiwo при оценке хронической токсичности (EC50, 7 сут экспозиции). Хроническая токсичность частиц KomPC при оценке жизнеспособности водоросли P. purpureum, а также мембранного потенциала у обоих видов микроводорослей оказалась ниже, чем у острой. Отрицательное влияние твердых частиц выхлопных газов на эстеразную активность зафиксировано только у P. purpureum, испытывающей хроническую токсичность. Частицы от KomPC вызвали значительное увеличение уровня флуоресценции хлорофилла а обоих видов микроводорослей, что свидетельствует об ингибировании фотосинтезирурующей активности и способствует увеличению среднего размера клеток водорослей.
Частицы THi проявили высокий уровень острой токсичности на жизнеспособность клеток и ингибирование их мембранного потенциала у водоросли P. purpureum. При оценке хронической токсичности уровень негативного воздействия частиц снизился. Изменение уровня эстераз-ной активности у P. purpureum не зафиксировано. У H. akashiwo наблюдали небольшой рост интенсивности флуоресценции FDA, свидетельствующий об увеличении эстеразной активности. Влияние частиц THi выразилось в увеличении интенсивности флуоресценции хлорофилла а. У P. purpureum этот эффект был значительно выше, чем у H. akashiwo. Отметим также, что под влиянием твердых частиц выхлоплых газов от THi наблюдалось увеличение размеров клеток водорослей, но в меньшей степени, чем при воздействии частиц KomPC.
Частицы TLC80 проявили высокий уровень острой токсичности в ходе изучения их влияния на жизнеспособность клеток, их эстеразную активность и мембранный потенциал P. purpureum. Значительно меньше эти показатели изменяются при воздействии твердых частиц от TLC80 на клетки H. akashiwo. Твердые частицы, полученные от других автотранспортных средств, судя по полученным нами результатам, демонстрируют низкий уровень токсичности или его почти полное отсутствие.
По результатам проведенного эксперимента можно сделать вывод о том, что наибольшую опасность для изученных видов микроводорослей представляют твердые частицы выхлопов автотранспорта, работающего на дизельном топливе. С увеличением объема двигателя транспортного средства увеличивается токсичность твердых частиц выхлопных газов. Год выпуска транспортного средства не влияет на токсичные свойства выбрасываемых ими твердых частиц. Результаты данного исследования имеют важное значение для понимания степени опасности твердых частиц выхлопных газов разных транспортных средств, влияющих на состояние окружающей среды и здоровье человека.
Настоящая работа поддержана грантом Российского научного фонда (15-14-20032-П).
Литература
1. Ecotoxicity assessment of particulate matter emitted from heavy-duty diesel-powered vehicles: influence of leaching conditions / A.X.R. Correa, R.C. Testolin, M.M. Torres, S. Cotelle, J.J. Schwartz, M. Millet, C.M. Radetski // Environmental Science and Pollution Research. - 2017. -№ 24. - P. 9399-9406.
2. Ecotoxicity and genotoxicity assessment of exhaust particulates from diesel-powered buses / N. Kovats, A. Acs, A. Ferincz, A. Kovacs, E. Horvath, B. Kakasi, B. Jancsek-Turoczi, A. Gelencser // Environmental Monitoring and Assessment. -2013. - № 185. - P. 8707-8713.
3. WHO Air Pollution and Cancer // IARC scientific publication (International Agency for Research on Cancer, Geneva, Switzerland, ed. World Health Organization) / Edited by Straif K., Cohen A. and Samet J. - 2013. - 161. - Р. 177.
4. Atmosphere environment improvement in Tokyo by vehicle exhaust purification / H. Minoura, K. Takahashi, J.C. Chow, J.G. Watson // Air Pollution Xvii. - 2009. - № 123. - Р. 129.
5. Significant reduction of ambient black carbon and particle number in Leipzig as a result of the low emission zone / F. Rasch, W. Birmili, K. Weinhold, S. Nordmann, A. Sonntag, G. Spindler,
H. Herrmann, A. Wiedensohler, G. Loschau // Gefahrstoffe Reinhaltung Der Luft. - 2013. - № 73. -P.483-489.
6. Johnson T.V. Diesel Emission Control in Review // Sae International Journal of Fuels and Lubricants. - 2009. - № 2. - P. 1-12.
7. Grain type and size of particulate matter from diesel vehicle exhausts analysed by transmission electron microscopy / P. Sielicki, H. Janik, A. Guzman, J. Namiesnik // Environmental Technology. -2012. - № 33. - P. 1781-1788.
8. Impact of Lubricating Oil Condition on Exhaust Particulate Matter Emissions from Light Duty Vehicles / M.G. Christianson, E. Bardasz, W. Nahumck // Sae International Journal of Fuels and Lubricants. - 2010. - № 3. - P. 476-488.
9. Size and composition distribution of fine particulate matter emitted from motor vehicles / M.J. Kleeman, J.J. Schauer, G.R. Cass // Environmental Science & Technology. - 2000. - № 34. -P.1132-1142.
10. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran / R.R. Guillard, J.H. Ryther // Canadian journal of microbiology - 1962. - № 8. - P. 229-239.
11.Marwood C.A., Solomon K.R., Greenberg B.M. Chlorophyll fluorescence as a bioindicator of effects on growth in aquatic macrophytes from mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons // Environmental Toxicology and Chemistry. - 2001. - № 20. - № 890-898.
12. Evaluation of different algal species sensitivity to mercury and metolachlor by PAM-fluorometry / P. Juneau, D. Dewez, S. Matsui, S.G. Kim, R. Popovic // Chemosphere. - 2001. - № 45. - Р. 589.
13. Brack W., Frank H. Chlorophyll a fluorescence: A tool for the investigation of toxic effects in the photosynthetic apparatus // Ecotoxicology and Environmental Safety. - № 40. - Р. 34-41.
14. Fai P.B., Grant A., Reid B. Chlorophyll a fluorescence as a biomarker for rapid toxicity assessment / // Environmental Toxicology and Chemistry. - 2007. - № 26. - Р. 1520-1531.
15. Ostrander G.K. Techniques in aquatic toxicology // CRC Press. - 2005 - № 2.
16. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy / T. Suzuki, K. Fujikura, T. Higashiyama, K. Takata // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. - № 45. - Р. 49-53.
17. Fontvieille D.A., Outaguerouine A., Thevenot D.R. Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of microbial activity in aquatic systems: application to activated sludges // Environmental Technology. - 1992. - № 13. - Р. 531-540.
Информация об авторах Information about the authors
Пикула Константин Сергеевич - Дальневосточный федеральный университет; 690950, Россия, Владивосток; младший научный сотрудник НОЦ «Нанотехнологии»; k.pikula@mail.ru
Pikula Konstantin Sergeevich - Far Eastern Federal University; 690950, Russia, Vladivostok; Junior Researcher, SEC Nanotechnology; k.pikula@mail.ru
Маркина Жанна Васильевна - Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского; 690041, Россия, Владивосток; научный сотрудник; zhannav@mail.ru
Markina Zhanna Vasilievna - National Scientific Center of Marine Biology named after A.V. Zhirmunsky; 690041, Russia, Vladivostok; Researcher; zhannav@mail.ru
Захаренко Александр Михайлович - Дальневосточный федеральный университет; 690950, Россия, Владивосток; старший научный сотрудник НОЦ «Нанотехнологии»; rarf@yandex.ru
Zakharenko Alexander Mikhailovich - Far Eastern Federal University; 690950, Russia, Vladivostok; Senior Researcher, SEC Nanotechnology; rarf@yandex.ru
Чернышев Валерий Валериевич - Дальневосточный федеральный университет; 690950, Россия, Владивосток; старший преподаватель кафедры нефтегазового дела и нефтехимии; chvv@mail.ru
Chernyshev Valeriy Valerirvich - Far Eastern Federal University; 690950, Russia, Vladivostok; Senior Lecturer of Oil Gas and Petrochemical Industry Chair; chvv@mail.ru
Чайка Владимир Викторович - Дальневосточный федеральный университет; 690950, Россия, Владивосток; директор НОЦ «Нанотехнологии»; chayka.vv@dvfu.ru
Chaika Vladimir Viktorovich - Far Eastern Federal University, 690950, Russia, Vladivostok; Director of SEC Nanotechnology; chayka.vv@dvfu.ru
Голохваст Кирилл Сергеевич - Дальневосточный федеральный университет; 690950, Россия, Владивосток; проректор по научной работе, профессор кафедры безопасности жизнедеятельности в техносфере; научный руководитель научно-образовательного центра «Нанотехнологии», директор Дальневосточного регионального научного центра Российской академии образования; droopy@mail.ru
Golokhvast Kirill Sergeevich - Far Eastern Federal University; 690950, Russia, Vladivostok; Doctor of Biological Sciences; Vice-Rector for Research of Far Eastern Federal University, Professor of Life Safety in Technosphere Chair, Academic Director of Research and Education Center "Nanotechnologies", Head of Far East Regional Scientific Center of Russian Academy of Education; droopy@mail.ru
