CC BY
103
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© А. В. Арутюнян 1, л. С. Козина 2, ТОКСИчЕСКОЕ ВлИяНИЕ ПРЕНАТАЛЬНОй В. А. Арутюнов 2 ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ НА ПОТОМСТВО
(экспериментальное исследование)
1 ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН
2 Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
УДК: 618.2-06-07-092.9
■ При использовании модели экспериментальной пренатальной гипергомоци-стеинемии (пищевая нагрузка метиони-ном крыс при беременности) было установлено повышение уровня содержания гомоцистеина не только в крови самок крыс, но и их потомства. Это сопровождалось снижением веса родившихся крысят и их когнитивных способностей, что было оценено с помощью теста Морриса. Проведенные эксперименты показали, что индукция окислительного стресса in vivo при использовании модели пренатальной гипергомоцистеинемии сопряжена с нарушениями глутаматерги-ческой системы мозга. Обнаружено, что
в условиях пренатальной гипергомоци-стеинемии происходит десенсибилизация ионотропных NMDA-рецепторов глута-мата гранулярных клеток мозжечка, но токсический эффект гомоцистеина и го-моцистеиновой кислоты при этом может реализоваться также через метаботроп-ные глутаматные рецепторы.
■ Ключевые слова: беременность; гипергомоцистеинемия; гомоцистеин; плод; окислительный стресс; крысы.
Исследования последних 15 лет подтвердили и углубили го-моцистеиновую теорию развития сосудистых нарушений [9], согласно которой увеличение концентрации гомоцистеина в плазме крови приводит к повреждению и активации эндотели-альных клеток, выстилающих стенки сосудов, что значительно повышает риск развития тромбозов и запускает атерогенный процесс [21]. Гомоцистеин способен беспрепятственно проникать через плаценту и оказывать токсическое влияние на плод. Образование микротромбов и нарушения микроциркуляции приводят к целому ряду осложнений течения беременности. Нарушение плацентации и фетоплацентарного кровообращения могут быть причиной репродуктивной недостаточности: невынашивания беременности и бесплодия в результате дефектов имплантации зародыша [10]. Доказано, что гипергомо-цистеинемия на ранних стадиях беременности является одной из причин анэнцефалии и незаращения костномозгового канала (spina bifida) [3]. Анэнцефалия приводит к стопроцентной летальности, а spina bifida — к развитию серьезных неврологических проблем у ребенка, включая моторный паралич, пожизненную инвалидность и преждевременную смерть. На более поздних стадиях беременности гипергомоцистеинемия является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии плода. Это приводит к рождению детей с низкой массой тела и снижению функциональных резервов всех жизнеобеспечивающих систем новорожденного и развитию целого ряда осложнений периода новорожденности [23]. Показано, что гипергомоцистеинемия является причиной развития врожденных пороков сердца и дефектов нижних конечностей. При выявлении дефектов нервной трубки наиболее часто отмечается наличие мутации фермента MTHFR C677T. При этом большое значение имеют как генотип плода, так и генотип матери. При сочетании генетических дефектов и у матери, и у плода возрастает частота развития дефектов нервной трубки.
Гипергомоцистеинемия может быть одной из причин развития генерализованой микроангиопатии во второй половине беременности, проявляющейся в виде позднего токсикоза (ге-стоза): нефропатии, преэклампсии и эклампсии [23]. Рождение незрелого недоношенного ребенка в таких случаях грозит летальностью и большим процентом неонатальных осложнений.
У детей, рожденных от матерей с гипергомоцистеинемией, наблюдается отставание в умственном и физическом развитии. Механизм подобных изменений на сегодня изучен недостаточно. Поскольку гомоцистеин (НС) и продукт его аутоокисле-
ния — гомоцистеиновая кислота (HCA) относятся к токсическим структурным аналогам глутамата, вероятной мишенью для их токсического действия являются глутаматные рецепторы, в первую очередь — ионотропные NMDA-рецепторы. При нормальном функционировании организма концентрация этих лигандов в плазме крови (и, по-видимому, в мозге) очень низка, поэтому они не могут выступать в качестве конкурента при взаимодействии с лиганд-связывающим участком рецепторов. Однако при значительном увеличении концентрации этих метаболитов они начинают конкурировать с глутаматом за связывание с рецепторами и вызывают их гиперактивацию, что влечет за собой развитие целого ряда токсических эффектов.
Поэтому представляет интерес определение изменения в функционировании NMDA-рецепторов, происходящие при увеличении в плазме крови уровня HC и HCA. С этой целью представлялось полезным разработать такую экспериментальную модель гипергомоцистеинемии, при которой было бы возможно анализировать не только состояние крыс с повышенным содержанием гомоцистеина в плазме крови, но и свойства их потомства. Модель пренатальной гипергомоцистеинемии на крысах, у которых беременность протекает в условиях пищевой нагрузки метионином, является новым инструментом исследования молекулярных механизмов действия HC и HCA in vivo. В данной работе были исследованы когнитивные способности потомства крыс, развивавшегося в условиях пренатальной гипергомоцистеинемии, и дана характеристика свойств его нейрональных NMDA-рецепторов при активации рецепторов лигандами в норме и в условиях окислительного стресса, вызываемого повышенным содержанием гомоцистеина.
Материалы и методы исследования
Повышенный уровень гомоцистеина создавали в крови самок в период беременности, используя описанную ранее экспериментальную модель [1]. Данная модель заключается во введении в питьевой рацион крыс метионина в концентрации (1 ± 0,01) г/кг массы животного (с учетом суточного потребления воды). Развитие потомства и формирование глутаматных рецепторов в рамках созданной модели происходит в условиях окислительного стресса, индуцированного повышенным уровнем НС в плазме крови как самки, так и формирующегося плода. Нагрузку метионином начинали при констатации у животных беременности и продолжали после появления потомства, которое получало метионин как с молоком матери, так и в питьевом рационе. Полученное потомство учитывали по количеству и весу и использовали
для исследования свойств нейронов в возрасте 10-11 дней, а для физиологической характеристики — в возрасте 45-55 дней. В работе использовали крыс линии Вистар (самки весом 180-200 г, самцы весом 250 г). В контрольной группе (6 семей) исследовали потомство самок с нормальным уровнем НС в крови, в подопытной группе (ме-тиониновые животные, 4 семьи) исследовали потомство самок с гипергомоцистеинемией. В экспериментах потомство каждой семьи исследовали отдельно, что позволяло учитывать индивидуальные различия, обусловленные физиологическими особенностями каждой самки (интенсивность обмена веществ, активность антиоксидантной системы и др.). Значение среднего веса подсчитывали, взвешивая не менее 3 детенышей из каждой семьи в день проведения цитометрического анализа.
Определение гомоцистеина проводили им-мунофлуоресцентным методом, используя набор реактивов фирмы AxisTM (Axis-Shield, Великобритания). Принцип метода заключается в восстановлении всех форм HC, содержащихся в плазме крови, до свободного HC и затем в ферментативном переводе его в S-аденозил-Ь-гомоцистеин,
Оценку способности крыс к обучению проводили при помощи классического варианта теста Морриса [18], который позволяет изучать пространственную память у крыс, а также роль различных структур мозга в формировании этого типа памяти. Использовали бассейн диаметром 1,7 м, наполненный на 30 см смесью из воды и 2 литров молока (для замутнения среды). Платформа диаметром 15 см находилась под поверхностью воды на глубине 0,5-1 см на расстоянии не ближе 30 см от края бассейна, чтобы исключить случайное нахождение платформы при движении крысы вдоль бортика бассейна. Температура воды поддерживалась равной 21 ± 1°С.
В эксперименте использовали потомство контрольных и «метиониновых» крыс в возрасте 45-55 дней. В первый день крыс обучали находить платформу в бассейне. Во второй день крыс помещали на платформу, чтобы они могли определить ее положение относительно внешних объектов, а затем опускали в воду около бортика бассейна и ждали, когда они обнаружат платформу. Производилось пять последовательных попыток. После каждой попытки крыса в течение 30 секунд оставалась на платформе. Для каждой экспериментальной группы было протестировано 23 особи. Тестирование памяти проводили через 1 неделю после обучения. При этом платформа оставалась в том же месте, что и в предыдущий раз, а крысу сразу помещали в воду с целью определить, насколько хорошо она запомнила местоположение платформы.
Рис. 1. Tраектория пути крысы в бассейне
В процессе эксперимента все передвижения крысы фиксировали на видеокамеру (рис. 1), что позволило после программной обработки определять время, за которое крыса находит платформу (latency), длину траектории движения и характер траектории, который показывает, насколько эффективно крыса осуществляет поиск платформы [24].
Используемая программа, анализирующая движение крысы в бассейне, регистрирует следующие параметры: время от начала движения крысы в бассейне до достижения ею платформы (в с); длину пути (в м); среднюю скорость (в м/с); время плавания с быстрой, средней и медленной скоростью (в % от всего времени прохождения теста); время, в течение которого крыса находилась в каждом из четырех квадрантов бассейна (в % от всего времени прохождения теста), что позволяет оценить, ищет ли крыса платформу в нужном направлении или хаотично плавает по всему бассейну; время нахождения в центре бассейна (внутренний круг) или около бортика (внешний круг), что также позволяет оценить характер поисков. Статистическую обработку проводили с помощью программы «Statistica 6.0», используя критерии Крускала-Уоллиса, Фишера и Дункана.
Первичную суспензию нейрональных клеток получали по методу, предложенному ранее [4] с некоторыми модификациями. Из потомства каждой самки случайным образом отбирали 3-4 животных в возрасте 9-10 дней. Для получения суспензии клеток животных объединяли, что позволяло исключить индивидуальные различия внутри семей. Для выделения суспензии нейронов из мозжечка крыс животных декапитирова-ли, вскрывали черепную коробку и извлекали мозжечок, который помещали в стоящую на льду чашку Петри на фильтровальную бумагу, смоченную раствором Тироде (NaCl 148 мМ, KCl 5 мМ,
MgCl2 мМ, глюкоза 10 мМ, HEPES 10 мМ, pH 7.4). Мозжечок промывали ледяным раствором ^роде, удаляли крупные кровеносные сосуды и измельчали скальпелем. Для разрыхления межклеточного вещества кусочки ткани помещали в раствор коллагеназы, приготовленный на растворе Tироде (Wako collagenase, 2 mg/ml, 400 ед. активности), и инкубировали, не перемешивая, при 34 °С в течение 30 мин. После инкубации удаляли раствор коллагеназы и троекратно отмывали кусочки ткани раствором Tироде, содержащим 150 мкл фетальной сыворотки телят (Fetal Bovine Serum, FBS) в 15 мл раствора.
Затем клетки отмывали еще 2 раза раствором ^роде, содержащим в 15 мл 37,5 мкл фетальной телячьей сыворотки. В этом растворе кусочки ткани суспендировали при помощи пастеровской пипетки с оплавленным кончиком, при этом клетки отрываются от разрыхленной ткани и выходят в раствор, который из прозрачного становится опа-лесцирующим. Полученную суспензию пропускали через тефлоновый фильтр с размером пор 43 мкм для удаления крупных фрагментов ткани. Количество выделенных клеток в 1 мл составляло 1,5-2,0 миллиона. Перед проведением эксперимента клетки оставляли на 30 мин при 34 °С, после чего подготавливали для цитометрических экспериментов.
Преинкубацию клеток с лигандами проводили в течение 30 мин при 37 °С в темноте. Использовали агонисты глутаматных рецепторов: N-метил -D-аспартат (NMDA), HC и HCA ("Sigma" США) (в концентрации 500 мкМ) и антагонисты ионотропных(МК-801 и D-AP5) и метаботропных рецепторов — (RS)-б-метилсерин-фосфат (MSOP) или UPF 523/(RS)-1,5-дикарбоксиловую кислоту (AIDA) в концентрации 10 мкМ ("Tocris" UK).
Цитометрические исследования проводили на приборе «FACStar» фирмы «Becton Dickinson» (США). Каждый образец анализировали по результатам измерения 10 000 событий.
Определение уровня активных форм кислорода (АФК) в цитоплазме нейронов проводили с помощью окрашивания клеток флуоресцентным зондом 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диаце-татом (DCFHA2-DA) ("Sigma" США) в конечной концентрации 100 мкМ. DCFH2-DA является гидрофобной, незаряженной и нефлуоресцирую-щей молекулой, легко проникающей через цито-плазматическую мембрану клетки. В цитоплазме эстеразы отщепляют ацетильные группы, превращая молекулу в 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин фСТН2), несущий отрицательный заряд, что затрудняет обратный выход красителя из клетки. Tаким образом, DCF^ накапливается в клетках, где он может ферментативно окисляться при
Таблица 1
Характеристика потомства животных, используемых в экспериментах
Экспериментальная группа Кол-во семей Среднее количество особей в помете Вес, г (для потомства в возрасте 10 дней) Концентрация гомоцистеина в крови, мкМ
Контроль 6 9 ± 3 23,05 ± 1,45 7,4 ± 0,5
Метионин 6 9 ± 2 17,86 ± 3,05* 9,8 ± 0,2*
* — p < 0,05
взаимодействии с перекисью водорода (или пе-роксинитритом) до флуоресцирующего продукта дихлорфлуоресцеина (DCF), количество которого определяется по интенсивности флуоресценции на длине волны X . . = 530 нм (возбуждение
emission 4 J
при ^exitatlon=485 нм). Для окраски клеток в исследуемую суспензию добавляли DCFH2-DA, инкубировали в течение 30 мин при 37 °С в темноте. Краситель растворяли в DMSO (диметилсульфок-сид) так, чтобы конечная концентрация DMSO в пробе была не выше 0,1 %.
Определение процента погибших клеток в исследуемой популяции клеток проводили после их окраски иодидом пропидия ("Sigma" США). Пропидий иодид (PI, ^exitation=485 нм, X . = 610 нм) не способен проникать через мем-
emisson
брану нативной клетки, поэтому накапливается только в погибших клетках, имеющих мембранные дефекты, и связывается там с нуклеиновыми кислотами, образуя с ними стойкие цветные комплексы. По этой причине клетки, окрашиваемые PI, считаются погишими в результате некроза. Для определения таких клеток в исследуемую суспензию нейронов добавляли PI в концентрации 10 мкМ за 1-3 мин до измерения.
Обработку данных, получаемых с применением метода проточной цитометрии, проводили в пакете программ WIN MDI. Из всего массива выделенных клеток гейтом выделяли область, которая позволяла исключить из анализируемой популяции события, не относящиеся к нейрональным клеткам. Полученные значения флуоресценции выражали в относительных ед. (X mean) или в процентах к контрольным значениям.
Результаты и обсуждение
В ходе проведенного исследования мы обнаружили, что животные, развивающиеся в условиях пренатальной гипергомоцистеинемии, по многим показателям уступают контрольным (табл. 1). Их вес был достоверно меньше, чем в группе контрольных животных, а стандартное отклонение показателя среднего веса у «метиониновых» животных также было более выражено, что косвенно свидетельствует о неодинаковой чувствительности к метионину отдельных семей внутри каждой группы.
Анализ полученных данных не выявил достоверных различий в результатах, получаемых при
исследовании разных семей одной и той же группы (контроль и животные, получавшие метионин). Следовательно, полученные экспериментальные данные можно считать однородными и отражающими закономерности, характерные для каждой группы. В контрольной группе, в отличие от подопытной, наблюдалась практически 100 % рождаемость.
Уровень НС в плазме крови взрослых животных после добавления метионина в питьевую воду возрастал в среднем в 5 раз по сравнению с исходным (с 5,9 ± 1,8 мкМ до 33,0 ± 3,9 мкМ), что свидетельствует о развитии гипергомоцистеине-мии у самок в ответ на введение избыточного количества метионина в питьевую воду. У потомства этих животных, как видно из данных, приведенных в табл. 1, также было обнаружено повышенное содержание НС по сравнению с контролем, хотя оно было выражено в меньшей степени, чем у взрослых животных.
Тестирование пространственной ориентации животных, то есть их способности к обучению, при плавании в бассейне (тест Морриса) выявило существенное ослабление когнитивных способностей у потомства крыс, подвергавшихся во время беременности метиониновой нагрузке. Следует отметить, что тест Морриса широко используется в литературе для оценки степени повреждения мозга крыс и скорости восстановления когнитивных функций. Например, с помощью этого теста продемонстрировано восстановление функций мозговой ткани крыс после травматического повреждения, при введении нейро-эпителиальных клеток для устранения последствий экспериментального ишемического повреждения мозга [8], а также при ликвидации физического повреждения мозга путем введения нейрональных стволовых клеток человека [22].
Результаты тестирования показали, что животным, развивавшимся в уловиях гипергомоцистеи-немии, требовалось больше времени, чтобы найти платформу, скорость плавания у них была ниже, а путь соответственно длиннее, чем в контрольной группе. Оказалось, что они демонстрируют достоверно большее время поиска и снижение скорости плавания, чем контрольные животные, что свидетельствует о нарушении процессов обучения и запоминания, вызываемом гипергомоци-стеинемией. Снижение скорости плавания может также свидетельствовать о нарушении обмена ве-
А) X mean = 14.7
Б) X mean = 39.6
Рис. 2. Увеличение флуоресценции DCF (параметр X mean) и процента погибших клеток в суспензии нейронов, выделенной из мозжечка животных контрольной (А) и «метиониновой» группы (Б). Мертвые клетки располагаются вверху каждого рисунка
ществ в мозге животных, находящихся в условиях пренатальной гипергомоцистенемии.
Результаты тестирования, проводившегося через 1 неделю после отмены метиониновой диеты, обнаружили, что время и скорость поиска платформы в группе животных, получавших метио-нин, уже достоверно не отличаются от показателей для контрольной группы, что свидетельствует об обратимости обнаруженных изменений, вызываемых гипергомоцистеинемией.
Важным параметром в оценке жизнедеятельности клеток и устойчивости их к токсическому влиянию свободнорадикальных молекул, образующихся в условиях окислительного стресса, является процент погибших клеток в выделенной клеточной суспензии. При сравнении этого параметра в популяциях клеток, выделенных из мозжечка животных контрольной и «метиониновой» групп (рис. 2), было отмечено увеличение процента погибших клеток в суспезии, полученной из мозжечка животных метиониновой группы (30,3 ± 3,3 %) по сравнению с таковым в группе контрольных животных (15,5 ± 2,2 %).
Исследование молекулярных свойств NMDA-рецепторов при формировании нервной системы в условиях гипергомоцистеинемии позволило определить чувствительность нейронов, полученных от животных исследуемых групп, к лигандам. Данные по действию NMDA, НС и НСА на NMDA-рецепторы гранулярных клеток, выделенных из мозжечка контрольных животных, соответствуют
результатам, полученным ранее при моделировании окислительного стресса in vitro на интактных животных [2]. Таким образом, нейроны контрольных животных чувствительны как к NMDA, так и к НС и НСА, а также собственно к глутамату (рис. 3). На рисунке также представлено подавляющее действие специфических антагонистов в случае активации исследуемыми лигандами ионотропных NMDA-рецепторов (МК-801, неконкурентного антагониста, блокирующего ионный канал рецепторов; D-AP5, высокоселективного конкурентного антагониста, препятствующего взаимодействию агонистов с лиганд-связывающим участком NMDA-рецептора). Эти данные являются важной характеристикой действия НС и НСА на ионотроп-ные рецепторы — они показывают, что токсические аналоги глутамата способны не только связываться с NMDA-рецепторами, но и индуцируют активацию связанного с рецепторм ионного канала.
При исследовании гранулярных клеток мозжечка животных, рожденных от самок с гипер-гомоцистеинемией, было обнаружено изменение ответа клеток на внесение агонистов. Увеличение уровня АФК в исследуемых клетках животных этой группы происходило лишь при воздействии на клетки НС и НСА, в то время, как при инкубации клеток с NMDA изменение уровня АФК в цитоплазме нейронов было слабо выражено (рис. 4), что указывает на возможную де-сенситизацию NMDA-рецепторов в условиях гипергомоцистеинемии.
Рис. 3. Уровень активных форм кислорода в цитоплазме нейронов контрольных животных при инкубации с лигандами. Аго-нисты (500 мкМ): НС, НСА, КМЭА; антагонисты (10 мкМ): МК-801, D-AP5
160
140
О 120
100
W 80
й 60
^ 40
20
контроль_HC
HCA
NMDA
Рис. 4. Уровень активных форм кислорода в цитоплазме гранулярных клеток мозжечка животных «метионино-вой» группы при инкубации с лигандами (500 мкМ)
Известно, что десенситизация КМБА-рецепторов мозжечка коррелирует со снижением активности этих рецепторов в гиппокампе, непосредственно отвечающем за формирование памяти, а следовательно, и с нарушением способности к обучению. В нашем случае это хорошо согласуется со снижением способности к обучению у «метиониновых» животных.
Эти группы рецепторов различаются в том отношении, что I группа обладает способностью защищать клетки от окислительного стресса, а III группа, напротив, усиливает его действие [4]. Как видно из представленных данных, оба исследуемых соединения препятствовали развитию ответа клеток на преинкубацию с НС и НСА (рис. 5). Эти данные с определенностью указывают на то, что хотя КМБА-рецепторы при гипергомоцисте-инемии и десенситизированы, метаботропные ре-
цепторы остаются функционально активными и испытывают активирующее действие НС и НСА.
Первые сведения о том, что гипергомоцистеи-немия относится к числу важных факторов, обусловливающих когнитивные дисфункции, появились относительно недавно, когда было показано, что хроническое введение метионина приводит к ухудшению кратковременной и долговременной памяти у крыс [5]. Было высказано предположение, что это вызвано усилением окислительного стресса в этих условиях [11], так как было обнаружено, что гомоцистеин подавляет экспрессию антиоксидантных ферментов (супероксиддисму-тазы и глутатионпероксидазы) в нервной ткани [11, 15, 17]. Наряду с этим клиническими наблюдениями было установлено, что повышение уровня гомоцистеина в крови вносит значительный вклад в развитие болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний [17, 9, 19, 25].
Дальнейшие исследования, проведенные G. Вау-adas и соавт. [7, 14], выявили, что пренатальная ги-пергомоцистеинемия приводит к окислительному стрессу и активирует апоптоз в нервной ткани потомства крыс, а также угнетает экспрессию нейро-специфических адгезивных белков (белок S-100, GFAP К-САМ), которые играют важную роль в процессах синаптической пластичности в различных структурах мозга, в том числе в гиппокампе [6]. Обнаруженные изменения сопровождаются ухудшением когнитивных способностей потомства крыс, выращенного в условиях пренатальной ги-пергомоцистеинемии [7, 17]. К сожалению, в этих исследованиях не было проведено определение содержания гомоцистеина в крови ни беременных
0
160
140
Рис. 5. Уровень активных форм кислорода в цитоплазме нейронов мозжечка животных «метиониновой» группы при инкубации с антагонистами метаботропных глутаматных рецепторов (AIDA и MSOP) в концентрации 10 мкМ.
крыс, ни их потомства, то есть не был проведен количественный контроль интенсивности гипер-гомоцистеинемии. В наших опытах эти измерения были осуществлены и продемонстрировали, что осложнения беременности и ухудшение когнитивных свойств потомства действительно вызваны гипергомоцистеинемией, прчем эти нарушения частично обратимы. Более того, мы показали, что индукция окислительного стресса при использовании экспериментальной модели пренатальной гиперго-моцистеинемии сопряжена с нарушением глутама-тергической системы мозга. Мы постулируем, что одним из важных факторов влияния пренатальной гипергомоцистеинемии на когнитивные функции потомства, вероятно, является десенситизация глу-таматных рецепторов NMDA-класса под влиянием гомоцистеина.
заключение
В результате проведенной работы была отработана модель пренатальной гипергомоцистеинемии на беременных крысах, у которых беременность протекает в условиях пищевой нагрузки метиони-ном. Оказалось, что введение метионина в питье экспериментальной группе животных в концентрации (1 ± 0,01) г/кг массы сопровождается увеличением содержания гомоцистеина в плазме крови беременных самок и в какой-то мере их потомства. Вес животных, развивающихся в условиях прена-тальной гипергомоцистеинемии, был достоверно меньше, чем в группе контрольных животных (17,86 ± 3,05 г против 23,05 ± 1,45 г соответственно). При помощи теста Морриса показано, что жи-
вотные, развивавшиеся в условиях пренатальной гипергомоцистеинемии, обладают пониженной по сравнению с контрольной группой способностью к обучению. Исследования, проведенные с помощью проточной цитометрии, показали, что процент погибших клеток в популяции нейронов, выделенной из мозга животных «метиониновой» группы, в два раза выше, чем у контрольной. Установлено, что развитие мозга в условиях пренатальной гиперго-моцистеинемии происходит на фоне десенсибилизации NMDA-рецепторов гранулярных клеток мозжечка, причем токсический эффект гомоци-стеина и гомоцистеиновой кислоты на нейроны в этих условиях может реализоваться также через метаботропные глутаматные рецепторы.
Авторы признательны сотрудникам кафедры биохимии биологического факультета МГУ и Научного центра неврологии РАМН А. В. Махро, А. П. Машкиной, Л. П. Карповой, М. С. Степановой, О. А. Труновой и Е. Р. Булыгиной за участие в выполнении проведенных экспериментов и проф. А. А. Болдыреву за плодотворную дискуссию.
литература
1. Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного гипергомоцистеинемией / Махро А. В. [и др.] // Ней-рохимия. — 2008. — Т. 23, № 4. — С. 233-240.
2. Махро А. В., Булыгина Е. Р., Болдырев А. А. Влияние гомо-цистеина и гомоцистеиновой кислоты на гранулярные клетки мозжечка // Нейрохимия. — 2006. — Т. 23, № 3. — С. 179-184.
3. A common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene as a new risk factor for placental vasculopathy / Van der Molen E. F. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2000. — Vol. 182. — P. 1258-1263.
4. Boldyrev A. A. Why homocysteine is a risk factor of neurodegenerative diseases // Neurochemical J. — 2007. — Vol. 1. — P. 14-20.
5. Chronic hyperhomocysteinemia provokes a memory deficit in rats in the Morris water maze test / Streck E. L. [et al.] // Be-hav. Brain Res. — 2004. — Vol. 153. — P. 377-381.
6. Delayed and isoform-specific effect of NMDA exposure on neural cell adhesion molecules in hippocampus / Hoffman K. B. [et al.] // Neurosci. Res. — 2001. — Vol. 39. — P. 167-173.
7. Effects of maternal hyperhomocysteinemia induced by high methionine diet on the learning and memory performance in offspring / Bayadas G. [et al.] // Int. J. Devel. Neurosci. — 2007. — Vol. 25. — P. 133-139.
8. Fukunaga А., Kawase T., Uchida K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat brain // Acta. Neurochir. — 2003. — Vol. 145. — P. 473-481.
9. Homocysteine and coronary atherosclerosis / Mayer E. [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. — 1996. — Vol. 27. — P. 517-527.
10. Inherited thrombophilia is associated with early onset preeclampsia, fetal growth restriction, fetal demise and abruptio placentae / Kupfermine M. J. [et al.] //Soc. Gynecol. Invest. — 1998. — Vol. 5. — P. 137A.
11. Inhibitory effects of melatonin on neural lipid peroxidation induced by intracerebrovetricularly administered homocysteine / Bayadas G. [et al.] // J. Pineal. Res. — 2003. — Vol. 34. — P. 36-39.
12. MattsonM. P., Shea T. B. Folate and homocysteine metabolism in neural plasticity and neurodegenerative disorders // Trends Neurosci. — 2003. — Vol. 26. — P. 137-146.
13. Melatonin improves learning and memory performances impaired by hyperhomocysteinemia / Bayadas G. [et al.] // Brain Res. — 2005. — Vol. 1046. — P. 187-194.
14. Melatonin inhibits oxidative stress and apoptosis I fetal brain of hyperhomocysteinemic rat dams / Bayadas G. [et al.] // J. Pineal Res. — 2007. — Vol. 43. — P. 225-231.
15. Melatonin prevents oxidative stress and inhibits reactive glio-sis induced by hyperhomocysteinemia in rats / Bayadas G. [et al.] // Biochemistry. — 2006. — Vol. 71. — P. 91-95.
16. Miller A. L. The methionine-homocysteine cycle and its effects on cognitive diseases // Altern. Med. Rev. — 2003. — Vol. 8. — P. 7-19.
17. Multiple aspects of homocysteine neurotoxicity: glutamate neurotoxicity, kinase hyperactivation and DNA damage / Ho P. I. [et al.] // J. Neurosci. Res. — 2002. — Vol. 70. — P. 694-702.
18. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions / Morris R. G. [et al.] // Nature. — 1982. — Vol. 297. — P.681-683.
19. Shea T. B., Lyons-Weiler J., Rogers E. Homocysteine, folate deprivation and Alzheimer neuropathology // J. Alzheimers Dis. — 2002. — Vol. 4. — P. 261-267.
20. Sources of reactive oxygen species production in excitotoxin-stim-ulated cerebellar granule cells / Boldyrev A. A. [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1999. — Vol. 256. — P. 320-324.
21. Stein J., Mc Bride P. Hyperhomocysteinemia and atherosclerotic vascular disease // Arch. Intern. Med. — 1998. — Vol. 158. — P. 1301-1306.
22. Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function in rats after traumatic brain in-
■ Адреса авторов для переписки-
Арутюнян Александр Вартанович — д. б. н., профессор, руководитель лаборатории биохимии с отделением клинической диагностики. ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: [email protected].
Козина Людмила Семеновна — д. б. н., доцент, аспирант, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геротологии СЗОРАМН. 197110 Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, дом 3. E-mail: [email protected].
Арутюнов Владимир Александрович — к. б. н., с. н. с. лаборатории биохимии Санкт-Петербургского института биорегуляции и герото-логии СЗОРАМН.
197110 Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, дом 3. E-mail: [email protected].
jury / Gao J. [et al.] // Experimental Neurology. — 2006. — Vol. 201. — P. 281-292.
23. Vollset S. E. Plasma total homocysteine, pregnancy complications, and adverse pregnancy outcomes: the Hordaland Homocysteine Study // Am. J. Clin. Nutr. — 2000. — Vol. 71. — P. 962-968.
24. Whishaw Ian Q. Formation of a place-learning set by the rat. A new paradigm for neurobehavioral studies // Physiol. Beh. — 1984. — Vol. 5. — P. 139-143.
25. White A. R., Huang X., Jobling M. F. Homocysteine potentiates copper- and amyloid beta peptide-mediated toxicity in primary neuronal cultures possible risk factors in the Alzheimer-type neurodegenerative pathways // J. Neurochem. — 2001. — Vol. 76. — P. 1509-1520.
Статья представлена И. И. Евсюковой, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта,
Санкт-Петербург
TOXIC EFFECT OF PRENATAL HYPERHOMOCYSTEINEMIA ON OFFSPRING (EXPERIMENTAL STUDY)
Arutjunyan A. V., Kozina L. S., Arutyonov V. A.
■ Summary: Experimental prenatal hyperhomocysteinemia (pregnant rats were methionine-loaded) has been shown to elevate homocysteine blood level not only in female rats, but also in their offspring. This was accompanied by a decrease in body weight and cognitive abilities of newborn rats, which was assessed with the use of Morris's test. The experiments carried out have shown that oxidative stress induced in the model of prenatal hyperhomocysteinemia in vivo is associated with glutamatergic system impairment in brain. It has been revealed that prenatal hyperhomocysteinemia desensitizes NMDA-ionotropic receptors of glutamate on the surface of the parencephalon granule cells, but the toxic effect of homocysteine and homocysteinic acid may also be implemented via metabotropic receptors of glutamate.
■ Key words: pregnancy; hyperhomocysteinemia; homocysteine; fetus; oxidative stress; rats.
Arutjunyan Alexander Vartanovich — Dr. Biol. Sci., professor, Head of the Laboratory of Biochemistry with Division of Clinical Diagnostics. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: [email protected].
Kozina Ljudmila Semenovna — Dr. Biol. Sci., Assistant professor, Leading scientific worker of Laboratory of Biochemistry. St.Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, North-West Branch of RAMS. 3, Dynamo pr., Saint Petersburg, Russia, 197110. E-mail: [email protected].
Arutyonov Vladimir Alexandrovich — PhD., Senjor scientific worker of Laboratory of Biochemistry.
St.Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, North-West Branch of RAMS. 3, Dynamo pr., Saint Petersburg, Russia, 197110. E-mail: [email protected].
