Влияние гипергомоцистеинемии на катехоламинергическое звено гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс

Милютина Юлия Павловна; Кореневский Андрей Валентинович; Степанов Михаил Григорьевич; Пустыгина Антонина Васильевна; Опарина Татьяна Ивановна; Залозняя Ирина Владимировна; Арутюнян Александр Вартанович

влияние гипергомоцистеинемии

на катехоламинергическое звено

гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс

НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург

УДК: 618.1-092.9:577.112.3

■ У самок крыс, находящихся на стадии проэструса, в условиях длительного потребления метионина были изучены уровни содержания норадреналина (НА) и дофамина (ДА) в зонах гипоталамуса, в которых происходят процессы синтеза (медиальная преоптическая область — МПО) и секреции гонадолиберина (срединное возвышение с аркуатными ядрами — СВ-Арк).

Установлено, что повышенное содержание гомоцистеина вызывает нарушение катехоламинергической регуляции репродуктивной функции самок крыс, оказывая влияние на норадренергическую систему в МПО и дофаминергическую систему в СВ-Арк, что свидетельствует о негативном действии ГГЦ на процессы синтеза и секреции гонадолиберина, находящиеся под контролем этих нейромедиаторных систем. Эти данные дают основание рассматривать повышенное содержание гомоцистеина в качестве фактора, одним из проявлений токсичности которого является нарушение регуляции репродуктивной функции.

■ Ключевые слова: гомоцистеин; катехоламины; окислительный стресс; малоновый диальдегид.

Гомоцистеин (ГЦ) образуется вследствие метаболизма незаменимой аминокислоты метионина, являющейся основным источником метильных групп в организме. Гомоцистеин ре-метилируется с образованием метионина или вступает в реакции транссульфирования с превращением в цистеин.

Несмотря на то, что нейротоксическое действие гомоцисте-ина и его метаболита гомоцистеиновой кислоты, обусловленное связыванием с NMDA-рецепторами глутамата и их гиперактивацией, в настоящее время не вызывает сомнений [20, 3], многие вопросы, касающиеся нейрохимических механизмов нарушения центральной регуляции репродуктивной функции женского организма при гипергомоцистеинемии, остаются невыясненными. Целью данной работы являлось изучение влияния экспериментальной гипергомоцистеинемии (ГГЦ) на содержание катехоламинов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина. Эти исследования способствуют пониманию общих механизмов повреждающего воздействия гомоцистеина на репродуктивную функцию женского организма и могут оказаться полезными в поиске нейропротекторных соединений, которые могли бы предотвратить или ослабить это воздействие.

Материалы и методы

Эксперимент был выполнен на 70 половозрелых крысах-самках линии Вистар массой 200-250 г. Животные содержались в виварии с искусственной вентиляцией и контролируемым световым режимом (день 8.00-20.00, ночь 20.00-8.00), получали стандартную пищу и воду. Животные были разделены на две группы:

1. Контрольные животные, которым в течение 30 дней ежедневно через зонд перорально вводили обычную воду (п=33).

2. Животные, которым в течение 30 дней ежедневно вводили метионин перорально через зонд в концентрации 0,12-0,15 г на животное в сутки (п=37).

Исходя из полученных нами ранее данных о том, что принудительное пероральное введение метионина самкам крыс ведет к более выраженному повышению уровня гомоцистеина в сыворотке крови, чем потребление метионина с питьевой водой [25], в настоящем исследовании нами была выбрана экспериментальная модель гипергомоцистеинемии с пероральным введением метионина.

Поскольку проводимые в нашей лаборатории исследования посвящены влиянию ГГЦ на гипоталамическую регуляцию эстральных циклов, временные точки были выбраны, исходя из сроков формирования преовуляторного пика гонадолиберина на стадии проэструса (540-620 ч, 935-1010 ч и 1115-1155 ч цирка-дианного времени — ЦВ: времени, отсчитываемого от начала дневной фазы экспериментальных суток).

Стадии эстрального цикла определяли по влагалищным мазкам. Правильность отбора подтверждали post mortem, измеряя массу яичников и оценивая состояние матки. Из мозга декапити-рованных животных выделяли МПО, срединное возвышение с аркуатными ядрами и прилежащими гипоталамическими структурами, так называемый медиовентральный гипоталамус (СВ-Арк) замораживали в жидком азоте и хранили при -800 °С до начала анализа.

После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,25 мл 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05 % метабисульфи-та калия, центрифугировали (10000 g, 15 мин., +4 °С), осадок отбрасывали, а супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматогра-фическому анализу в тот же день.

ГЦ определяли иммуноферментным методом с использованием тест-системы Axis-Sheld (Великобритания). Количественный анализ НА и ДА в исследуемых областях гипоталамуса проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием [4]. Хроматографическое разделение биогенных аминов осуществляли на колонке Reprosil 80 ODS-2 (100 х 4 мм, 3 мкм, Dr. Maisch GmbH, Германия). Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США) при потенциале +0,65 В. Подвижная фаза содержала 6 мМ ци-тратного буфера, 2 мМ этилендиаминтетраацета-та натрия, 1,1 мМ октилсульфоната натрия и 7 % ацетонитрила (v/v). Расход элюента — 0,75 мл/ мин. Содержание определяемых веществ рассчитывали в нанограммах на миллиграмм белка, который определяли по методу Vera [27].

Определение ТБК-активных продуктов осуществляли с использованием метода, описанного в работе Арутюняна А. В. и др. 2000 [1], нитритов, описанного в работе Madueno F., Guerro М. G. 1991[21].

Статистическая обработка данных проведена с использованием непараметрических U — критерия Манна-Уитни, H — критерия Крускала-Уоллиса. Различия считались достоверными при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

В исследованиях, проведенных ранее в нашей лаборатории, было установлено, что норадренергиче-ская система в МПО и дофаминергическая система в СВ-Арк гипоталамуса выполняют важную роль в регуляции репродуктивных циклов [9]. Показано, что при формировании предовуляторного пика го-надолиберина в проэструсе крыс наблюдается повышение уровня содержания НА в МПО и ДА в

СВ-Арк самок крыс, но этого не происходит при воздействии на животных различных ксенобиотиков, которые вызывают нарушение нормальной суточной динамики катехоламинов в структурах гипоталамуса, осуществляющих синтез и секрецию гона-долиберина [2, 5, 8].

На рисунке 1 представлены данные о влиянии принудительного введения метионина на уровень содержания ГЦ в сыворотке крови крыс. Отмечено достоверное повышение значения ГЦ в период формирования и терминации преовуляторного пика го-надолиберина (10 ч ЦВ и 11,5 ч ЦВ).

На рисунках 2 и 3 представлены данные о влиянии гипергомоцистеинемии на суточную динамику катехоламинов в МПО и СВ-Арк. При исследовании уровня содержания НА в МПО гипоталамуса самок в контроле была обнаружена сходная динамика изменений этого нейромедиатора с повышением в дневное время (10ЦВ) и снижением в вечернее (11,5ЦВ). Эти изменения имели характер тенденции, которая исчезала на фоне 30-дневного курса перорального введения метионина, в этих условиях сохранялся практически одинаковый уровень НА во всех трех временных точках (рис. 2).

При исследовании динамики ДА в СВ-Арк было установлено, что в контроле наблюдается суточное изменение его содержания с повышением его в вечерней временной точке (Н=6,608; р=0,04). При введении метионина наблюдается исчезновение нормальной суточной динамики этого нейромедиатора, при этом происходит достоверное по сравнению с контролем повышение ДА в 10 ч ЦВ и тенденция к снижению к 11,5 ч ЦВ (рис. 3).

Определение общего содержания НА в МПО при объединении всех трех временных точек, показало, что после принудительного перорального введения метионина в течение месяца происходит достоверное повышение его содержания в МПО гипоталамуса по сравнению с контролем. В группе животных, получавших метионин, оно составило 27,16 ± 0,99 нг/

контроль метионин

□ 6ЦВ иЮЦВ и11,5ЦВ

Рис. 1. Изменение содержания общего ГЦ в сыворотке крови самок крыс при принудительном пероральном введении метионина * — р < 0,01

мг белка, а в контрольной группе — 23,70± 0,92 нг/ мг белка (р < 0,05). При исследовании уровня ДА в МПО и НА в СВ-Арк не было отмечено их суточной динамики в исследуемых структурах ни в контроле, ни при метиониновой нагрузке.

Согласно современным представлениям, ДА и, особенно, НА считаются позитивными регуляторами синтеза ГЛ в МПО. Активация норадреналинергиче-ских нейронов, иннервирующих преоптическую область, в дневные часы на стадии проэструса играет значительную роль в формировании преовуляторно-го пика гонадолиберина [15].

Что же касается секреции ГЛ из срединного возвышения гипоталамуса (СВ), то ДА, в противоположность НА, рассматривается как негативный регулятор. В отношении серотонина известно ин-гибирующее влияние на продукцию ГЛ. Для различных моноаминов показано наличие изменений в их содержании и секреции в МПО и медиальном базальном гипоталамусе на стадии проэструса, связанных с их регуляторной ролью в формирования пика ГЛ [6].

Отмеченное в данном исследовании изменение содержания и суточной динамики катехола-минов при метиониновой нагрузке в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГЛ, подтверждает адекватность использования для создания гипергомоцистеинемии модели принудительного кормления животных метио-нином. Можно предположить, что исчезновение суточных ритмов НА и ДА в данной модели ГГЦ связано с изменениями в работе циркадианного осциллятора и является характерным начальным признаком нарушений нормального функционирования репродуктивной функции.

Приведенные результаты указывают на то, что повышенное содержание гомоцистеина вызывает нарушение катехоламинергической регуляции репродуктивной функции самок крыс, оказывая влияние на норадренергическую систему в МПО и дофаминергическую систему в СВ-Арк, что свидетельствует о негативном действии ГГЦ на процессы синтеза и секреции гонадолиберина, находящиеся под контролем этих нейромедиаторных систем. Эти данные дают основание рассматривать повышенное содержание гомоцистеина в качестве фактора, одним из проявлений нейротоксичности которого является нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции, что ставит его в один ряд с другими ранее изученными в нашей лаборатории ксенобиотиками.

Исследование содержания НА в СВ-Арк показало, что результаты сходны с данными, полученными при анализе ДА в МПО. Суточные ритмы отсутствуют в обеих исследованных группах. Отмечено, что его содержание в группе животных,

потреблявших метионин, достоверно не отличается от группы контроля и составляют соответственно 26,99 ± 0,86 нг/мг белка и 24,92 ± 1,13 нг/мг белка. Происходит лишь тенденция к его повышению при введении метионина. Ряд авторов отмечают повышение НА в данной структуре гипоталамуса при метиониновой нагрузке. По их мнению, го-моцистеин индуцирует увеличение секреции ЛГ гипофизом. Это происходит вследствие ингиби-рования активности катехол-О-метилтрансферазы в СВ-Арк гипоталамуса, в результате чего происходит накопление НА [19].

Одним из основных механизмов токсичности гомоцистеина является его аутоокисление в присутствии кислорода и ионов металлов с переходной валентностью и инициируемая этим генерация активных форм кислорода (АФК) [24]. Образующиеся перекись водорода и супероксиданион-радикал стимулируют процессы перекисного окисления липидов и снижают биодоступность оксида азота [26]. Последнее обусловлено, в первую очередь, образованием пероксинитрита вследствие ингиби-рования супероксиддисмутазы и образования при взаимодействии оксида азота и супероксида высокотоксичного продукта — пероксинитрита [17, 26]. При повышении содержания ГЦ некоторые исследователи отмечают подавление экспрессии глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы, что может усиливать токсический эффект свободных радикалов в структурах мозга [22].

Нами при исследовании в сыворотке крови вторичного продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида (МДА) было обнаружено, что при принудительном введении метионина перорально происходит его достоверное повышение у животных с метиониновой нагрузкой, указывающее на активацию пере-кисных процессов в крови при данном способе введения метионина (рис. 4). Аналогичные данные были описаны нами ранее, причем было показано, что наиболее заметное возрастание уровня МДА наблюдается в интервале 9:35 — 10:10 ч ЦВ [25]. Известно, что ГЦ обладает способностью эффективнее других аминотиолов при переходе в дисульфид, или связываясь с эндогенными тиолами, отдавать электроны кислороду, превращая последний в супероксиданион. Супероксиданион уже непосредственно участвует в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ). В результате происходит усиленное образование продуктов свободнорадикального метаболизма [7]. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей. В них отмечается, что при возрастании уровня ГЦ наблюдается увеличение содержание МДА, карбонильных производных и диеновых конью-

контроль метионин

□ 6ЦВ И10ЦВ ПИ.бЦВ

Рис. 2. Суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса самок крыс

контроль метионин

□ 6ЦВ ■ 10ЦВ ПИ.бЦВ

Рис. 3. Суточная динамика содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса самок крыс в проэструсе * — p < 0,05

гатов в плазме крови крыс и кроликов [11, 13], повышение уровня МДА и супероксиданиона в гиппокампе крыс [23]. В других работах показано, что после хронического 22-дневного введения гомоцистеина через час после последней инъекции происходит повышение уровня ПОЛ и снижение общей антиоксидантной активности (ОАА) в сердце крыс. Однако данный эффект исчезает через 12 часов [16]. Исследования, проведенные на культурах клеток печени и микро-глии, показали, что как гомоцистеин, так и S-аденозил-метионин (SAM) вызывают повреждения ДНК клеток. Установлены различия в механизмах повреждающего действия этих соединений на нуклеиновые кислоты и показано, что SAM непосредственно действует на ДНК, тогда как действие ГЦ происходит опосредованно с участием продуктов, образующихся при активации ПОЛ [12].

В настоящей работе нами была также отмечена суточная динамика изменения содержания нитритов в группе контроля (H=7,489, p=0,02), с их достоверным повышением к 11,5 часам ЦВ (рис. 5). Введение метионина приводило к достоверному снижению содержания нитритов в вечернюю временную точку (p < 0,05), нарушая при этом их нормальную суточную динамику. Снижение содержания нитритов может быть обусловлено

16 14 ^ 12 § 10

< 1=5

контроль

Рис. 4. Содержание МДА в сыворотке крови самок крыс при пероральном введении метионина * — р < 0,01 — отличие содержания МДА при пероральном введении метионина от контрольной группы

10

контроль □ 6ЦВ

110ЦВ

метионин □ 11,5ЦВ

Рис. 5. Содержание нитритов в сыворотке крови самок крыс при пероральном введении метионина (* — р < 0,05)

усилением взаимодействия с супероксидным радикалом и косвенно свидетельствовать об интенсификации процесса образования пероксинитрита в этих условиях.

Обнаруженные нами изменения в содержании отдельных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса самок крыс при ГГЦ требуют дальнейшего исследования. Последнее время в основном интерес к ГГЦ связывают с изучением дегенеративных заболеваний нервной системы, при которых все больше исследователей отмечают повышенный уровень гомоцистеина сыворотки крови. Однако механизм этого пока остается недостаточно изученным, поэтому исследователи используют различные экспериментальные модели для изучения влияния ГГЦ на физиологические и биохимические показатели структур мозга. Так, ряд ученых обнаружили, что у крыс, находящихся на диете с высоким потреблением метионина, снижено содержание серотонина и дофамина в коре головного мозга [10]. Другие исследователи, используя модель ГГЦ, вызванную диетой с дефицитом фолата, также отмеча-

8

6

4

2

0

ли изменения метаболизма моноаминов и снижение глутатиона в мозге животных [14]. Имеются данные, что введение гомоцистеина увеличивает содержание белка XBP1 в нескольких областях мозга мышей, таких как гиппокамп, гипоталамус и кора. Известно, что белок XBP1 вовлечен в патогенез болезней центральной нервной системы [18]. Таким образом, можно предположить, что искажение нормальных ритмов и общего содержания катехоламинов в МПО и СВ-Арк в рассмотренной модели гипергомоцистеинемии, вызванной введением метионина, может обуславливать нарушения в центральной регуляции репродуктивной функции. Однако механизмы этого явления нуждаются в дальнейшем изучении.

Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-00749-а.

Литература

1. Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н. Методы оценки сободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. — СПб, 2000. — 104 с.

2. Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В. Нарушение нейромедиаторного звена гипоталамической регуляции репродуктивной функции под влиянием нейротоксических ксенобиотиков // Нейрохимия. — 1998. — №4. — С. 264-270.

3. Болдырев А. А. Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина // Биохимия. — 2009. — Т.74, №6. — С. 725-736

4. Влияние экологически неблагоприятных факторов на репродуктивную систему / Арутюнян А. В. [и др.] // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. — 1997. — №4. — С. 28-31.

5. Воздействие мелатонина и пептидов эпифиза на кате-холаминергическое звено гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс / Милютина Ю. П. [и др.] // Нейрохимия. — 2007. — Т. 27, № 3. — С. 221-229.

6. Динамика содержания катехоламинов в преовуляторный период / Разыграев А. В. [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. — 2003. — Т. 59., №4. — С. 76-81.

7. Жлоба А. А., Никитина В. В. Выявление и лечение гиперго-моцистеинемии. — М.: Дружба народов, 2004. — 40 с.

8. Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции при воздействии нейротоксических соединение и мелатонина / Арутюнян А. В. [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. — 2003. — Т. 52, № 2. — С. 77-85.

9. О взаимосвязи циркадианных и овариальных циклов в гипоталамической регуляции репродукции (экспериментальное исследование) / Кореневский А. В. [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. — 2007. — Т. 56, №4. — С. 24-30.

10. Cognitive and neurochemical alterations in hyperhomo-cysteinemic rat / Gao L. [et al.] // Neurol. Sci. — 2011. — Vol. 7.

11. Effects of high methionine diet on oxidative stress in serum, apo-B containing lipoproteins, heart, and aorta in rabbits /

Yalpinkaya-Demirsoz S. [et al.] // Ann. Clin. Lab. Sci. — 2009. — Vol. 39, №4. — P. 386-391.

12. Effects of S-adenosylhomocysteine and homocysteine on DNA damage and cell cytotoxicity in murine hepatic and microglia cell lines / Liu C.C. [et al.] // J. Biochem. Mol. Toxicol. — 2009. — Vol. 23, №5. — P.49-56.

13. Experimental evidence of oxidative stress in plasma of ho-mocystinuric patients: a possible role for homocysteine / Vanzin C. S. [et al.] // Mol. Genet. Metab. — 2011. — Vol.104, №1-2. — P.112-117.

14. Folate deficiency induces neurodegeneration and brain dysfunction in mice lacking uracil DNA glycosylase / Kronenberg G. [et al.] // J. Neurosci. — 2008. — Vol. 9, № 28. — P. 7219-7230.

15. Herbison A. E. Noradrenergic regulation of cyclic GnRH secretion // Rev. Reprod. — 1997. — Vol. 2, №1. — P.1-6.

16. Homocysteine induces oxidative-nitrative stress in heart of rats: prevention by folic acid / Kolling J. [et al.] // Cardiovasc. Toxicol. — 2011. — Vol. 11, №1. — P. 67-73.

17. Hooijmans C. R., Blom H. J. S-adenosylmethionine and S-adeo-sylhomocysteine levels in the aging brain of APP/PS1 Alzheimer mice // Neurol. Sci. — 2009. — Vol. 30. — P. 439-445.

18. Hosoi T., OgawaK., Ozawa K.. Homocysteine induces X-box-binding protein 1 splicing in the mice brain // Neurochem. Int. — 2010. — Vol.56, № 2. — P. 216-220.

19. Ladosky W., Azambuja H. M., Schneider H. T. Possible mechanism of action of 2-hydroxylated estradiol on the positive feedback control for LH release in the rat // J. Steroid Bio-chem. — 1983. — Vol. l. — P. 639-44.

20. L-homocysteine sulfinic acid and other acidic homocysteine derivatives are potent and selective metabotropic glutamate receptor agonists / Shi Q. [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 2003. — Vol. 305. — P. 131-142.

21. MaduenoF, GuerroM. G. Use of mutant strain of the cyanobac-terim Synechococcus R2 for the determination of nitrate // Anal. Biochem. — 1991. — Vol. 198, №1. — P. 220-202.

22. Melatonin prevents oxidative stress and inhibits reactive gliosis induced by hyperhomocysteinemia in rats / Baydas G. [et al.] // Biochemistry. — 2006. — Vol.71, suppl 1. — P. 91-95.

23. Neuroprotective effects of the polyphenolic antioxidant agent, Curcumin, against homocysteine-induced cognitive impairment and oxidative stress in the rat / Ataie A. [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. — 2010. — Vol. 96, №4. — P. 378-385.

24. Perna A. F., IngrossoD., Lombardi C. Possible mechanisms of homocysteine toxicity // Kidney Int. — 2003. — Vol. 63. — P. 137 — S140.

25. The use of different experimental models of hyperhomo-cysteinemia in neurochemical studies / Arutyunyan A.V. [et al.] // Neurochemical Journal. — 2012. — Vol. 6, №1. — P. 71-76.

26. Upchurch G. R., Welch C. N, Fabian A. J. Homocysteine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 17012 -17017.

27. Vera J. C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable turbidimetric procedure // Analyt. Biochem. — 1988. — Vol.174. — P. 187-196

Статья представлена В. В. Дорофейковым, ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург

EFFECT OF HYPERHOMOCYSTEINEMIA ON REPRODUCTION HYPOTHALAMIC REGULATION CATECHOLAMINERGIC LINK IN FEMALE RATS

Milyutina Yu. P., Korenevsky A. V.,

Stepanov M. G., Oparina T. I.,

Pustygina A. V., Zaloznyaya I. V., Arutjunyan A. V.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

■ Summary: The content of norepinephrine and dopamine have been studied in female rat hypothalamic areas that are responsible for the gonadoliberin synthesis (the medial preoptic area, MPA)

■ Адреса авторов для переписки-

Милютина Юлия Павловна — к. б. н., научный сотрудник

лаборатории биохимии с КДЛ.

ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН.