Научная статья на тему 'Токсическое действие фторидных соединений сурьмы(iii) на опухолевые клетки карциномы эрлиха и эмбрионы морского ежа STRONGYLOCENTROTUS INTERMEDIUS'

Токсическое действие фторидных соединений сурьмы(iii) на опухолевые клетки карциномы эрлиха и эмбрионы морского ежа STRONGYLOCENTROTUS INTERMEDIUS Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
141
20
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Мамонтова В. А., Земнухова Л. А., Ковалева Е. В.

Проведены исследования токсического действия трифторида сурьмы и ряда фторидных комплексных соединений состава MSb2F7 (M = Rb, NH4), MSbF4 (M = Na, K, Cs, NH4) и M2SbF5 (M = K, Cs) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Определ╦н показатель ЛК50 (соответствует концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток) некоторых фторидных соединений сурьмы(III) по их действию на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и обнаружено, что наиболее токсичным соединением является тетрафторантимонат(III) аммония NH4SbF4. Установлено, что пороговые (максимально недействующие) концентрации всех соединений на эмбрионы морского ежа S. intermedius находятся ниже 1Ч10-6 моль╥л-1.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Мамонтова В. А., Земнухова Л. А., Ковалева Е. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Toxical effect of antimony(iii) fluoride compounds to the erlich carcinoma tumor cells and embryos of sea urchin

The toxicity of antimony(III) fluoride and some fluoride complexes such as MSb2F7 (M = Rb, NH4), MSbF4 (M = Na, K, Cs, NH4) and M2SbF5 (M = K, Cs) relative to the Erlich carcinoma tumor cells and embryos of sea urchin Strongylocentrotus intermedius was studied. LD50 index of some antimony(III) fluoride compounds by their effect to Erlich carcinoma tumor cells was determined (it corresponds to substance concentration inducing death of 50% cells). Ammonium tetrafluoroantimonate NH4SbF4 was found to be the most toxical compound. The maximal ineffective concentrations of all compounds were determined, they are lower than 1╥10-6 mol╥l-1.

Текст научной работы на тему «Токсическое действие фторидных соединений сурьмы(iii) на опухолевые клетки карциномы эрлиха и эмбрионы морского ежа STRONGYLOCENTROTUS INTERMEDIUS»

Токсическое действие фторидных соединений сурьмы (III) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа STRONGYLOCENTROTUSINTERMEDIUS

Мамонтова В.А. (1), Земнухова Л.А.(2), Ковалева Е.В.(2) (chemi@online.ru)

(1)Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, (2)Институт химии ДВО РАН, г. Владивосток

Проведены исследования токсического действия трифторида сурьмы и ряда фторидных координационных соединений сурьмы(Ш) состава MSb2F7 (M = Rb, NH4), MSbF4 (M = Na, K, Cs, NH4) и M2SbF5 (M = K, Cs) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedins. Определён показатель ЛК50 (соответствует концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток) некоторых соединений сурьмы(Ш) по их действию на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и обнаружено, что наиболее токсичным является тетрафторантимонат(Ш) аммония NH4SbF4. Установлено, что пороговые (максимально недействующие) концентрации всех соединений на эмбрионы морского ежа S. intermedins находятся ниже 1-10-6 моль-л-1.

Трехфтористая сурьма образует многочисленные координационные соединения, состав, строение и свойства которых изменяются в зависимости от природы катионов и ацидолигандов [1]. Особенностью стереохимии фторсодержащих соединений сурьмы(Ш) является образование низкосимметричных кристаллических решеток, вследствие чего многие вещества проявляют анизотропные электрофизические свойства, ценные для практики, например, для создания нелинейно-оптических устройств. Биологическая активность координационных соединений сурьмы(Ш), в том числе и фторидных, мало исследована [2 - 4]. Согласно [5-7], смертельная доза соединений Sb(III), которые являются более токсичными, чем соединения сурьмы (V), для человека равна 0,12 - 1,0 г, а предельно допустимая концентрация (ПДК) фторидов и хлоридов сурьмы (III) в воздухе составляет

7 1

3-10" г-л . Их токсичность объясняется действием как целой молекулы, так и продуктов их гидролиза (HF и HCl). В [8, 9] сообщалось о возможном использовании комплексных сульфатофторидных соединений сурьмы(Ш) с катионами натрия и аммония для борьбы с

некоторыми видами культур грибков. Установлено также, что окись сурьмы Sb2O3 не токсична даже при высоких концентрациях по отношению к эмбрионам пимефалес (Pimephales promelas) [10]. Биологическим эффектам воздействия фтора и его соединений со многими элементами, в отличие от Sb(III), посвящено много публикаций [11]. Считается, что ПДК свободных ионов фтора в воде равна 7-10-4 г-л-1.

Целью настоящей работы было исследование влияния SbF3 (1) и фторидных комплексных соединений MSb2F7 (M = Rb (2), NH4 (3) ), MSbF4 (M = Na (4), K (5), Cs (6), NH4 (7) ) и M2SbF5 (M = K (8), Cs (9) ) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedins.

Зародыши морских ежей являются популярным объектом для изучения токсических эффектов различных химических соединений [12-14]. Для оценки токсичности среды используются обычно показатели нарушений разных стадий эмбрионального развития, которые хорошо изучены [15]. Первичный скрининг противоопухолевых веществ часто проводится с помощью радиометрического экспресс-метода определения их цитостатического действия на опухолевые клетки карциномы Эрлиха [16].

Экспериментальная часть

1. Синтез фторидных комплексных соединений сурьмы(Ш). Синтез соединений проводился препаративным методом из водных растворов согласно [1, 4]. Чистота исходных компонентов (трехфтористой сурьмы, фторидов щелочных металлов и аммония) отвечала классификации «чда».

2. Определение противоопухолевой активности. В экспериментах использовали тетраплоидную линию опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха [16], которую

поддерживали путем перевивки белым беспородным мышам. Опухолевые клетки извлекали на 7-8 день развития опухоли. Противоопухолевую (цитотоксическую) активность по отношению к опухолевым клеткам определяли по ингибированию синтеза ДНК [17] (включение в опухолевые клетки 3Н -тимидина, вносимого из расчета 4,0 мкКи на 1мл клеточной суспензии). Инкубационная смесь содержала 90 мкл суспензии опухолевых

клеток (0,5 - 1,0 х 106 клеток/мл) в среде № 199 с добавлением пенициллина и стрептомицина (из расчета 250 ед. каждого антибиотика на 1 мл суспензии), 5% сыворотки и 10 мкл раствора исследуемого фторидного соединения сурьмы(Ш) или дистиллированной воды для контрольной пробы. Инкубацию проводили 2 часа при 37о C. Пробы наносили на бумажные фильтры ("Whatman 3MМ") размером 1х1 см, высушивали на воздухе, последовательно промывали 5%-ным холодным раствором ТХУ (три порции по 5 мл ) и этанолом (две порции по 5 мл). После высушивания фильтров уровень включения радиоактивной метки измеряли в толуольном сцинцилляторе на счетчике "Rackbeta" (LKB, Швеция). Цитотоксическую активность соединений сурьмы(Ш) рассчитывали по формуле:

% Ингибирования = 100-(А/Ао)х 100% (1),

где Ао - общая радиоактивность (имп/мин) контрольной пробы;

А - радиоактивность в исследуемой пробе.

На рис. 1 показана зависимость процента ингибирования включения меченых предшественников в ДНК опухолевых клеток карциномы Эрлиха от концентрации внесённого вещества в пробе.

Рисунок 1. -

Цитотоксическое действие фторидных соединений сурьмы(Ш) на опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха (нумерация соединений дана по табл. 1 ).

Установлено, что трифторид сурьмы и фторидные координационные соединения адБЬгГт и М8ЬБ4 (М = Сб, КН4) вызывают гибель исследуемых клеток, а степень их токсичности зависит от концентрации вещества и его состава. Значения показателя ЛК50,

соответствующего концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток, представлены в табл. 1, которые свидетельствуют, что наиболее токсичным соединением по действию на опухолевые клетки карциномы Эрлиха является тетрафторантимонат(Ш) аммония,

Таблица 1

Летальная концентрация (ЛК50) фторидных соединений сурьмы(Ш) для опухолевых клеток карциномы Эрлиха

№ соединения (см. текст) Соединение ЛК50 -10-5, моль-л-1

1 8ЬБз 1.77

3 0.85

4 1.45

6 CsSЬF4 0.91

7 0.22

Однако выявить корреляции между физико-химическими свойствами фторидных соединений сурьмы(Ш) и их цитостатической активностью невозможно без изучения более широкого круга веществ.

3. Определение токсичности фторидных соединений сурьмы(Ш) по отношению

к эмбрионам морского ежа S. intermedius. Исходные маточные растворы 8ЬБз и комплексных фторидов сурьмы (III) готовили на дистиллированной воде при нагревании с концентрацией 1-10-4 моль-л-1. Из них приготавливали инкубационные смеси с конечными концентрациями веществ, равными 1-10-6, 5-10-6 и 1-10-5 моль-л-1, отбирая аликвоты в 10.0; 50.0 и 100.0 мкл, соответственно.

Работу с эмбрионами морских ежей БлМегте&т, которых использовали в качестве тест-объекта, проводили на морской экспериментальной станции (МЭС) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, расположенной в бухте Троица (зал. Петра Великого, Японское море), в сентябре 1999 и 2002 г. г.

Свежевыловленных морских ежей разделяли на самцов и самок, стимулируя нерест механическим встряхиванием, и содержали затем в отдельных аквариумах. Яйцеклетки 2-3 раза промывали отфильтрованной морской водой и пропускали через мельничный газ (размер ячеи 100х100 мкм). Перед началом опытов проводили пробное оплодотворение. В опытах использовали только те яйцеклетки, процент оплодотворения которых был не ниже 98%. От получения яйцеклеток до их осеменения проходило не более 1 час. Все опыты проводили одновременно на одних и тех же партиях эмбрионов морских ежей при температуре 22-23° С. Пробы оценивали под микроскопом МБС-9.

Для изучения токсического действия фторидных соединений сурьмы (III) на эмбрионы морского ежа готовили суспензию яйцеклеток плотностью 1000-1500 кл/мл. Через пять минут после осеменения, отмытые от лишней спермы оплодотворённые яйцеклетки, добавляли в предварительно подготовленные исследуемые растворы, содержащие фторидные соединения сурьмы(Ш). Объём пробы составлял 1 мл. Инкубационной средой была фильтрованная морская вода.

Анализ эмбрионального развития морского ежа проводили на основе классического руководства [13,15], фиксируя изменения в развитии оплодотворенной клетки под микроскопом на стадиях первого деления дробления, бластулы и плутеуса (через 90 минут, 15 и 48 часов после осеменения, соответственно). Каждый опыт проводили в двух параллелях.

Число нормальных зародышей и личинок на всех стадиях развития эмбриогенеза морского ежа в контрольных пробах было выше 95 %. Наблюдения за изменениями, происходящими с оплодотворенными клетками морского ежа под действием фторидных соединений сурьмы(Ш), показали на существование зависимости токсичности вещества от его состава и концентрации в пробе.

Концентрация веществ, равная 1-10-6 моль-л-1 (10,0 мкл исходного раствора):

- через 90 мин - под микроскопом были видны остановившиеся в развитии нормально оплодотворенные клетки (НОК), деления которых не происходило, а в некоторых клетках был частично или полностью нарушен гиалиновый слой: появилась зернистость, деформация, изменение цвета;

- через 48 ч - во всех опытах в клетках наблюдался более тонкий гиалиновый слой, кроме чашки с добавлением КН^Ь2Б7, где гиалиновый слой полностью отсутствовал.

Концентрация веществ, равная 5-10-6 моль-л-1 (50,0 мкл исходного раствора):

- через 90 мин - в опытах наблюдались как НОК, так и клетки с нарушенным гиалиновым слоем,кроме проб с добавлением растворов SЬF3 и К^ЬБ5. При этом, соединения располагались в следующий ряд по числу НОК в чашках (в скобках указано число НОК, %): Cs2SЬF5 (90-95) ^ ^Ь2р7, ОЬБ4 (80) ^ CsSЬF4, №^4 (50) ^ SЬFз, (0) (рис. 2);

Рисунок 2. - Зависимость количества нормально оплодотворенных клеток (НОК) морского ежа ЗлМетте&т, деление которых остановлено под действием фторидных соединений сурьмы(Ш) (концентрация веществ в пробах 5х10-6 моль-л-1, через 90 мин после осеменения): 1- SЬFз; 2 - К^Ь^; 3 - №^Ь2р7; 4 - ^ЬБ4; 5 - ^ЬБ4; 6 - CsSЬF4; 7 - №^4; 8 - ^ЬБ5; 9 - Cs2SЬF5.

100 п

80--—- -—-—-

60--- - - -

Ь£ ---

х 40--- - - - - -

20--- - - - - -

0

123456789

Номера веществ

- через 15 ч - по действию на клетки вещества разделились на две группы:

1) SЬF3, К^ЬБ5, - в опытных чашках присутствовали НОК и клетки с тонким гиалиновым слоем;

2) остальные соединения - все клетки были светлого цвета с отсутствующим

гиалиновым слоем;

- через 48 ч - клетки во всех опытах были без гиалинового слоя темного цвета, кроме пробы с К28ЬБ5, где присутствовали клетки с тонким гиалиновым слоем и клетки с отсутствующим гиалиновым слоем светлого цвета.

Концентрация веществ, равная 1-10-5 моль-л-1 (100,0 мкл исходного раствора):

- через 90 мин - наблюдаемые изменения в клетках зависели от состава фторидных соединений сурьмы(Ш) и группировались следующим образом:

1) НОК и клетки с первым делением дробления (примерно 10%) - опыт с ^БЬЕ^

2) НОК - опыт с К8ЬБ4;

3) НОК и клетки с нарушенным гиалиновым слоем, причём, вещества по числу НОК располагались в ряд (в скобках указано число НОК, %): КН48ЬБ4 (95) ^ Сб8ЬБ4, Сб28ЬБ5 (90) ^ К28ЬБ5 (80) ^ 8ЬБ3 (0);

4) клетки с тонким гиалиновым слоем - опыты с КЬ8Ь2Е7 и КН48Ь2Е7;

- через 15 ч - только в двух опытах с 8ЬБ3 и КН48ЬБ4 были видны клетки с тонким гиалиновым слоем, в остальных случаях наблюдались клетки светлого цвета с отсутствующим гиалиновым слоем;

- через 48 ч - во всех опытах фиксировались только клетки темного цвета с отсутствующим гиалиновым слоем.

Степень токсичности зависит от состава вещества, а в ряду однотипных комплексных соединений сурьмы(Ш) - от природы внешнесферного катиона. Возможно, это связано с изменением величины мембранного потенциала клетки, который меняется в зависимости от состава вводимого в среду вещества. Например, известно, что ионы ртути способны улучшить проницаемость клеточных мембран для ионов кальция [18], повысить рН внутри клетки [19] и гиперполяризовать мембрану клеток [20]. Возможно также, что токсический эффект от введения различных по составу фторидных соединений сурьмы(Ш) связан с процессом их гидролиза, сведения о котором практически отсутствуют. Известно только, что гидролиз 8ЬБ3 протекает с образованием кристаллического оксофторидного соединения

Sb3O2F5 [21]. Однако, наличие свободных ионов фтора в водных растворах комплексных фторидов сурьмы(Ш) не подтверждено проведенными ранее исследованиями [22, 23].

Выводы

1. Определены летальные концентрации SЬF3 и комлексных соединений КН^Ь2Б7, МБЬБ4 (М = Cs, КН4) для опухолевых клеток карциномы Эрлиха, имеющие значения в области 0,22-1,77-10-5 моль-л-1, и обнаружено, что наиболее токсичным является тетрафторантимонат(Ш) аммония КН^ЬБ4.

2. Исследовано действие SЬF3, комлексных соединений MSb2F7 (М= ЯЬ, КН4), MSЬF4 (М = К, Cs, КН4) и M2SЬF5 (М=К, Cs) на эмбриогенез морского ежа 8. Шетте&т и установлены пороговые (максимально недействующие) концентрации веществ для эмбрионов морского ежа 8. 1Метте&т, находящиеся ниже 1-10-6 моль-л-1.

3. Установлено, что все соединения, взятые в концентрациях 1-10-6, 5-10 и 1-10-моль-л-1, вначале останавливали развитие нормально оплодотворенных клеток морского ежа, а затем вызывали гибель эмбрионов. Исключение составило соединение NaSЬF4 (концентрация 1-10-5 моль-л-1), в присутствии которого через 90 мин с момента оплодотворения обнаруживалось первое деление дробления клетки. Наблюдалась зависимость степени токсичности от состава вещества, а в ряду однотипных комплексных соединений сурьмы(Ш) - от природы внешнесферного катиона.

Список литературы

1 . Земнухова Л. А. Синтез, спектроскопия ЯКР и строение координационных соединений сурьмы(Ш), висмута(Ш), индия(Ш) и теллура (IV): Дисс. ... д. х. н., Владивосток: Ин-т химии ДВО РАН, 1998. 290 с.

2. Крисс Е.Е., Волченкова И.И., Григорьева А.С., Яцимирский К.Б., Бударин Л.И. Координационные соединения металлов в медицине. Киев: Наук. думка, 1986. 216 с.

3. Соединения фтора: синтез и применение. M.: M^, 1990. 407 с.

4. Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Никитин B.M., Корякова M^., Спешнева Н.В. // Журн. прикладной химии. 2002. Т. 75. № 6. С. 971-975.

5. Чекунова M.^, Mинкина Н.Я. // Гигиена труда. 1969. № 10. С. 25 - 29.

6. Вредные вещества в промышленности. Л.: Химия, 1977. Т. 3. С. 228 - 234.

7. Саипбаев В.С., Субботин В.В., Кожомкулов Э.Т., Джайлоев Т.А., Арамбеков Д.А., Зейферт О.Р. // Mеждун. симпоз. "Проблемы экологии в химическом образовании", Mосква, 5 - 7 сент., 1990 : Тез. докл., M., 1990. С. 52.

8. Takeo Shibamoto, Yoshiyuki Inoue. // Mokuzai Gakkaishi. 1958. V. 4. P. 106.

9. Ивамото Хиромити, Кикути Mrom // J. Ferment. Assoc., Japan. 1964. V. 22. № 5. P. 218 -222.

10. Le-Blanc G.A., Dean J.W. // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1984. V. 32. N 5. P. 565569.

11. Иваницкий Г.Р. //Биофизика. 2001. Т. 46. № 1. С. 5-26.

12. Hagstrom B.E., Lonning S.// Acta Pharmacol. Toxicol. 1973. V. 32 (Suppl.). P. 1 - 49. Pharmacol. Toxicol. 1973. V. 32 (Suppl.). P. 1-49.

13. Кобаяси Н., Найденко Т. Х., Ващенко M. А. // Биол. моря. 1994. Т. 20. №6. С. 457-464.

14. Ващенко M. А., Жадан П. M., Mалахов В. В., Mедведева Л. А. // Биол. моря. 1995. Т.21. № 5. С. 333-340.

15. Бузников Г. А., Подмарёв В. К. Mорские ежи (Strongylocentrotus drobachiensis, S. nudus, S. intermedius). Объекты биологии развития. M.: Наука. 1975. С. 188-216.

16. Волколупова Ü. П., Mакухо Л. В. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. N. 3. С. 213-215.

17. Wand M., Zeuthen E., Evans E.A. // Science. 1967. V. 157. P. 436-438.

18. Walter P., Allemand D., Renzis G., Payan P. // BBA. 1989. N 1012. P. 219-226.

19. Dell'Antone P. // J. Cell. Physiol. 1989. V. 139. P. 76-82.

20. Jungwirth A., Ritter M., Paulmichl M., Lang F. // J. Cell Physiol. 1991. V. 146. P. 25-33.

21. Удовенко А. А., Волкова Л.М., Давидович Р. Л., Земнухова Л. А., Панин Е.С.// Коорд. химия. 1985. Т.11. № 8. С. 1132 - 1135.

22. Буслаев Ю.А., Пешков В.В. // Журн. неорган. химии . 1973. Т. 18. № 6. С. 1523 - 1526.

23. Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Коньшин В.В. // Коорд.химия. 2002. Т. 28. № 11. С. 809811.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.