CC BY
22Токсическое действие фторидных соединений сурьмы (III) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа STRONGYLOCENTROTUSINTERMEDIUS
Мамонтова В.А. (1), Земнухова Л.А.(2), Ковалева Е.В.(2) (chemi@online.ru)
(1)Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, (2)Институт химии ДВО РАН, г. Владивосток
Проведены исследования токсического действия трифторида сурьмы и ряда фторидных координационных соединений сурьмы(Ш) состава MSb2F7 (M = Rb, NH4), MSbF4 (M = Na, K, Cs, NH4) и M2SbF5 (M = K, Cs) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedins. Определён показатель ЛК50 (соответствует концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток) некоторых соединений сурьмы(Ш) по их действию на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и обнаружено, что наиболее токсичным является тетрафторантимонат(Ш) аммония NH4SbF4. Установлено, что пороговые (максимально недействующие) концентрации всех соединений на эмбрионы морского ежа S. intermedins находятся ниже 1-10-6 моль-л-1.
Трехфтористая сурьма образует многочисленные координационные соединения, состав, строение и свойства которых изменяются в зависимости от природы катионов и ацидолигандов [1]. Особенностью стереохимии фторсодержащих соединений сурьмы(Ш) является образование низкосимметричных кристаллических решеток, вследствие чего многие вещества проявляют анизотропные электрофизические свойства, ценные для практики, например, для создания нелинейно-оптических устройств. Биологическая активность координационных соединений сурьмы(Ш), в том числе и фторидных, мало исследована [2 - 4]. Согласно [5-7], смертельная доза соединений Sb(III), которые являются более токсичными, чем соединения сурьмы (V), для человека равна 0,12 - 1,0 г, а предельно допустимая концентрация (ПДК) фторидов и хлоридов сурьмы (III) в воздухе составляет
7 1
3-10" г-л . Их токсичность объясняется действием как целой молекулы, так и продуктов их гидролиза (HF и HCl). В [8, 9] сообщалось о возможном использовании комплексных сульфатофторидных соединений сурьмы(Ш) с катионами натрия и аммония для борьбы с
некоторыми видами культур грибков. Установлено также, что окись сурьмы Sb2O3 не токсична даже при высоких концентрациях по отношению к эмбрионам пимефалес (Pimephales promelas) [10]. Биологическим эффектам воздействия фтора и его соединений со многими элементами, в отличие от Sb(III), посвящено много публикаций [11]. Считается, что ПДК свободных ионов фтора в воде равна 7-10-4 г-л-1.
Целью настоящей работы было исследование влияния SbF3 (1) и фторидных комплексных соединений MSb2F7 (M = Rb (2), NH4 (3) ), MSbF4 (M = Na (4), K (5), Cs (6), NH4 (7) ) и M2SbF5 (M = K (8), Cs (9) ) на опухолевые клетки карциномы Эрлиха и эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedins.
Зародыши морских ежей являются популярным объектом для изучения токсических эффектов различных химических соединений [12-14]. Для оценки токсичности среды используются обычно показатели нарушений разных стадий эмбрионального развития, которые хорошо изучены [15]. Первичный скрининг противоопухолевых веществ часто проводится с помощью радиометрического экспресс-метода определения их цитостатического действия на опухолевые клетки карциномы Эрлиха [16].
Экспериментальная часть
1. Синтез фторидных комплексных соединений сурьмы(Ш). Синтез соединений проводился препаративным методом из водных растворов согласно [1, 4]. Чистота исходных компонентов (трехфтористой сурьмы, фторидов щелочных металлов и аммония) отвечала классификации «чда».
2. Определение противоопухолевой активности. В экспериментах использовали тетраплоидную линию опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха [16], которую
поддерживали путем перевивки белым беспородным мышам. Опухолевые клетки извлекали на 7-8 день развития опухоли. Противоопухолевую (цитотоксическую) активность по отношению к опухолевым клеткам определяли по ингибированию синтеза ДНК [17] (включение в опухолевые клетки 3Н -тимидина, вносимого из расчета 4,0 мкКи на 1мл клеточной суспензии). Инкубационная смесь содержала 90 мкл суспензии опухолевых
клеток (0,5 - 1,0 х 106 клеток/мл) в среде № 199 с добавлением пенициллина и стрептомицина (из расчета 250 ед. каждого антибиотика на 1 мл суспензии), 5% сыворотки и 10 мкл раствора исследуемого фторидного соединения сурьмы(Ш) или дистиллированной воды для контрольной пробы. Инкубацию проводили 2 часа при 37о C. Пробы наносили на бумажные фильтры ("Whatman 3MМ") размером 1х1 см, высушивали на воздухе, последовательно промывали 5%-ным холодным раствором ТХУ (три порции по 5 мл ) и этанолом (две порции по 5 мл). После высушивания фильтров уровень включения радиоактивной метки измеряли в толуольном сцинцилляторе на счетчике "Rackbeta" (LKB, Швеция). Цитотоксическую активность соединений сурьмы(Ш) рассчитывали по формуле:
% Ингибирования = 100-(А/Ао)х 100% (1),
где Ао - общая радиоактивность (имп/мин) контрольной пробы;
А - радиоактивность в исследуемой пробе.
На рис. 1 показана зависимость процента ингибирования включения меченых предшественников в ДНК опухолевых клеток карциномы Эрлиха от концентрации внесённого вещества в пробе.
Рисунок 1. -
Цитотоксическое действие фторидных соединений сурьмы(Ш) на опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха (нумерация соединений дана по табл. 1 ).
Установлено, что трифторид сурьмы и фторидные координационные соединения адБЬгГт и М8ЬБ4 (М = Сб, КН4) вызывают гибель исследуемых клеток, а степень их токсичности зависит от концентрации вещества и его состава. Значения показателя ЛК50,
соответствующего концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток, представлены в табл. 1, которые свидетельствуют, что наиболее токсичным соединением по действию на опухолевые клетки карциномы Эрлиха является тетрафторантимонат(Ш) аммония,
Таблица 1
Летальная концентрация (ЛК50) фторидных соединений сурьмы(Ш) для опухолевых клеток карциномы Эрлиха
№ соединения (см. текст) Соединение ЛК50 -10-5, моль-л-1
1 8ЬБз 1.77
3 0.85
4 1.45
6 CsSЬF4 0.91
7 0.22
Однако выявить корреляции между физико-химическими свойствами фторидных соединений сурьмы(Ш) и их цитостатической активностью невозможно без изучения более широкого круга веществ.
3. Определение токсичности фторидных соединений сурьмы(Ш) по отношению
к эмбрионам морского ежа S. intermedius. Исходные маточные растворы 8ЬБз и комплексных фторидов сурьмы (III) готовили на дистиллированной воде при нагревании с концентрацией 1-10-4 моль-л-1. Из них приготавливали инкубационные смеси с конечными концентрациями веществ, равными 1-10-6, 5-10-6 и 1-10-5 моль-л-1, отбирая аликвоты в 10.0; 50.0 и 100.0 мкл, соответственно.
Работу с эмбрионами морских ежей БлМегте&т, которых использовали в качестве тест-объекта, проводили на морской экспериментальной станции (МЭС) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, расположенной в бухте Троица (зал. Петра Великого, Японское море), в сентябре 1999 и 2002 г. г.
Свежевыловленных морских ежей разделяли на самцов и самок, стимулируя нерест механическим встряхиванием, и содержали затем в отдельных аквариумах. Яйцеклетки 2-3 раза промывали отфильтрованной морской водой и пропускали через мельничный газ (размер ячеи 100х100 мкм). Перед началом опытов проводили пробное оплодотворение. В опытах использовали только те яйцеклетки, процент оплодотворения которых был не ниже 98%. От получения яйцеклеток до их осеменения проходило не более 1 час. Все опыты проводили одновременно на одних и тех же партиях эмбрионов морских ежей при температуре 22-23° С. Пробы оценивали под микроскопом МБС-9.
Для изучения токсического действия фторидных соединений сурьмы (III) на эмбрионы морского ежа готовили суспензию яйцеклеток плотностью 1000-1500 кл/мл. Через пять минут после осеменения, отмытые от лишней спермы оплодотворённые яйцеклетки, добавляли в предварительно подготовленные исследуемые растворы, содержащие фторидные соединения сурьмы(Ш). Объём пробы составлял 1 мл. Инкубационной средой была фильтрованная морская вода.
Анализ эмбрионального развития морского ежа проводили на основе классического руководства [13,15], фиксируя изменения в развитии оплодотворенной клетки под микроскопом на стадиях первого деления дробления, бластулы и плутеуса (через 90 минут, 15 и 48 часов после осеменения, соответственно). Каждый опыт проводили в двух параллелях.
Число нормальных зародышей и личинок на всех стадиях развития эмбриогенеза морского ежа в контрольных пробах было выше 95 %. Наблюдения за изменениями, происходящими с оплодотворенными клетками морского ежа под действием фторидных соединений сурьмы(Ш), показали на существование зависимости токсичности вещества от его состава и концентрации в пробе.
Концентрация веществ, равная 1-10-6 моль-л-1 (10,0 мкл исходного раствора):
- через 90 мин - под микроскопом были видны остановившиеся в развитии нормально оплодотворенные клетки (НОК), деления которых не происходило, а в некоторых клетках был частично или полностью нарушен гиалиновый слой: появилась зернистость, деформация, изменение цвета;
- через 48 ч - во всех опытах в клетках наблюдался более тонкий гиалиновый слой, кроме чашки с добавлением КН^Ь2Б7, где гиалиновый слой полностью отсутствовал.
Концентрация веществ, равная 5-10-6 моль-л-1 (50,0 мкл исходного раствора):
- через 90 мин - в опытах наблюдались как НОК, так и клетки с нарушенным гиалиновым слоем,кроме проб с добавлением растворов SЬF3 и К^ЬБ5. При этом, соединения располагались в следующий ряд по числу НОК в чашках (в скобках указано число НОК, %): Cs2SЬF5 (90-95) ^ ^Ь2р7, ОЬБ4 (80) ^ CsSЬF4, №^4 (50) ^ SЬFз, (0) (рис. 2);
Рисунок 2. - Зависимость количества нормально оплодотворенных клеток (НОК) морского ежа ЗлМетте&т, деление которых остановлено под действием фторидных соединений сурьмы(Ш) (концентрация веществ в пробах 5х10-6 моль-л-1, через 90 мин после осеменения): 1- SЬFз; 2 - К^Ь^; 3 - №^Ь2р7; 4 - ^ЬБ4; 5 - ^ЬБ4; 6 - CsSЬF4; 7 - №^4; 8 - ^ЬБ5; 9 - Cs2SЬF5.
100 п
80--—- -—-—-
60--- - - -
Ь£ ---
х 40--- - - - - -
20--- - - - - -
0
123456789
Номера веществ
- через 15 ч - по действию на клетки вещества разделились на две группы:
1) SЬF3, К^ЬБ5, - в опытных чашках присутствовали НОК и клетки с тонким гиалиновым слоем;
2) остальные соединения - все клетки были светлого цвета с отсутствующим
гиалиновым слоем;
- через 48 ч - клетки во всех опытах были без гиалинового слоя темного цвета, кроме пробы с К28ЬБ5, где присутствовали клетки с тонким гиалиновым слоем и клетки с отсутствующим гиалиновым слоем светлого цвета.
Концентрация веществ, равная 1-10-5 моль-л-1 (100,0 мкл исходного раствора):
- через 90 мин - наблюдаемые изменения в клетках зависели от состава фторидных соединений сурьмы(Ш) и группировались следующим образом:
1) НОК и клетки с первым делением дробления (примерно 10%) - опыт с ^БЬЕ^
2) НОК - опыт с К8ЬБ4;
3) НОК и клетки с нарушенным гиалиновым слоем, причём, вещества по числу НОК располагались в ряд (в скобках указано число НОК, %): КН48ЬБ4 (95) ^ Сб8ЬБ4, Сб28ЬБ5 (90) ^ К28ЬБ5 (80) ^ 8ЬБ3 (0);
4) клетки с тонким гиалиновым слоем - опыты с КЬ8Ь2Е7 и КН48Ь2Е7;
- через 15 ч - только в двух опытах с 8ЬБ3 и КН48ЬБ4 были видны клетки с тонким гиалиновым слоем, в остальных случаях наблюдались клетки светлого цвета с отсутствующим гиалиновым слоем;
- через 48 ч - во всех опытах фиксировались только клетки темного цвета с отсутствующим гиалиновым слоем.
Степень токсичности зависит от состава вещества, а в ряду однотипных комплексных соединений сурьмы(Ш) - от природы внешнесферного катиона. Возможно, это связано с изменением величины мембранного потенциала клетки, который меняется в зависимости от состава вводимого в среду вещества. Например, известно, что ионы ртути способны улучшить проницаемость клеточных мембран для ионов кальция [18], повысить рН внутри клетки [19] и гиперполяризовать мембрану клеток [20]. Возможно также, что токсический эффект от введения различных по составу фторидных соединений сурьмы(Ш) связан с процессом их гидролиза, сведения о котором практически отсутствуют. Известно только, что гидролиз 8ЬБ3 протекает с образованием кристаллического оксофторидного соединения
Sb3O2F5 [21]. Однако, наличие свободных ионов фтора в водных растворах комплексных фторидов сурьмы(Ш) не подтверждено проведенными ранее исследованиями [22, 23].
Выводы
1. Определены летальные концентрации SЬF3 и комлексных соединений КН^Ь2Б7, МБЬБ4 (М = Cs, КН4) для опухолевых клеток карциномы Эрлиха, имеющие значения в области 0,22-1,77-10-5 моль-л-1, и обнаружено, что наиболее токсичным является тетрафторантимонат(Ш) аммония КН^ЬБ4.
2. Исследовано действие SЬF3, комлексных соединений MSb2F7 (М= ЯЬ, КН4), MSЬF4 (М = К, Cs, КН4) и M2SЬF5 (М=К, Cs) на эмбриогенез морского ежа 8. Шетте&т и установлены пороговые (максимально недействующие) концентрации веществ для эмбрионов морского ежа 8. 1Метте&т, находящиеся ниже 1-10-6 моль-л-1.
3. Установлено, что все соединения, взятые в концентрациях 1-10-6, 5-10 и 1-10-моль-л-1, вначале останавливали развитие нормально оплодотворенных клеток морского ежа, а затем вызывали гибель эмбрионов. Исключение составило соединение NaSЬF4 (концентрация 1-10-5 моль-л-1), в присутствии которого через 90 мин с момента оплодотворения обнаруживалось первое деление дробления клетки. Наблюдалась зависимость степени токсичности от состава вещества, а в ряду однотипных комплексных соединений сурьмы(Ш) - от природы внешнесферного катиона.
Список литературы
1 . Земнухова Л. А. Синтез, спектроскопия ЯКР и строение координационных соединений сурьмы(Ш), висмута(Ш), индия(Ш) и теллура (IV): Дисс. ... д. х. н., Владивосток: Ин-т химии ДВО РАН, 1998. 290 с.
2. Крисс Е.Е., Волченкова И.И., Григорьева А.С., Яцимирский К.Б., Бударин Л.И. Координационные соединения металлов в медицине. Киев: Наук. думка, 1986. 216 с.
3. Соединения фтора: синтез и применение. M.: M^, 1990. 407 с.
4. Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Никитин B.M., Корякова M^., Спешнева Н.В. // Журн. прикладной химии. 2002. Т. 75. № 6. С. 971-975.
5. Чекунова M.^, Mинкина Н.Я. // Гигиена труда. 1969. № 10. С. 25 - 29.
6. Вредные вещества в промышленности. Л.: Химия, 1977. Т. 3. С. 228 - 234.
7. Саипбаев В.С., Субботин В.В., Кожомкулов Э.Т., Джайлоев Т.А., Арамбеков Д.А., Зейферт О.Р. // Mеждун. симпоз. "Проблемы экологии в химическом образовании", Mосква, 5 - 7 сент., 1990 : Тез. докл., M., 1990. С. 52.
8. Takeo Shibamoto, Yoshiyuki Inoue. // Mokuzai Gakkaishi. 1958. V. 4. P. 106.
9. Ивамото Хиромити, Кикути Mrom // J. Ferment. Assoc., Japan. 1964. V. 22. № 5. P. 218 -222.
10. Le-Blanc G.A., Dean J.W. // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1984. V. 32. N 5. P. 565569.
11. Иваницкий Г.Р. //Биофизика. 2001. Т. 46. № 1. С. 5-26.
12. Hagstrom B.E., Lonning S.// Acta Pharmacol. Toxicol. 1973. V. 32 (Suppl.). P. 1 - 49. Pharmacol. Toxicol. 1973. V. 32 (Suppl.). P. 1-49.
13. Кобаяси Н., Найденко Т. Х., Ващенко M. А. // Биол. моря. 1994. Т. 20. №6. С. 457-464.
14. Ващенко M. А., Жадан П. M., Mалахов В. В., Mедведева Л. А. // Биол. моря. 1995. Т.21. № 5. С. 333-340.
15. Бузников Г. А., Подмарёв В. К. Mорские ежи (Strongylocentrotus drobachiensis, S. nudus, S. intermedius). Объекты биологии развития. M.: Наука. 1975. С. 188-216.
16. Волколупова Ü. П., Mакухо Л. В. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. N. 3. С. 213-215.
17. Wand M., Zeuthen E., Evans E.A. // Science. 1967. V. 157. P. 436-438.
18. Walter P., Allemand D., Renzis G., Payan P. // BBA. 1989. N 1012. P. 219-226.
19. Dell'Antone P. // J. Cell. Physiol. 1989. V. 139. P. 76-82.
20. Jungwirth A., Ritter M., Paulmichl M., Lang F. // J. Cell Physiol. 1991. V. 146. P. 25-33.
21. Удовенко А. А., Волкова Л.М., Давидович Р. Л., Земнухова Л. А., Панин Е.С.// Коорд. химия. 1985. Т.11. № 8. С. 1132 - 1135.
22. Буслаев Ю.А., Пешков В.В. // Журн. неорган. химии . 1973. Т. 18. № 6. С. 1523 - 1526.
23. Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Коньшин В.В. // Коорд.химия. 2002. Т. 28. № 11. С. 809811.
