CC BY
74
Работа проводилась при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (гос-контракт № 14.B37.21.0202) и в рамках государственного задания (регистрационный № НИР 4.1569.2011).
Поступила в редакцию 15 мая 2013 г.
Lada G.A. VARIABILITY OF ANURAN AMPHIBIANS (ANURA) OF RUSSIAN PLAIN
Variability of external morphological characters of 9 species of anuran amphibians (Anura) of the Russian Plain was studied. Geographic and intra-population aspects and sexual dimorphism are analyzed.
Key words: variability; anuran amphibians; Anura; Russian Plain.
УДК 575.89:597.5
ТЕТРАПЛОИДНЫЕ ФОРМЫ КАК РЕЗУЛЬТАТ ГИБРИДИЗАЦИИ
при сосуществовании клонально-бисексуальных щиповок совтъ
© Е.С. Левенкова, В.П. Васильев
Ключевые слова: клонально-бисексуальные комплексы; гибридизация; мейоз; род Cobitis.
Мы исследовали мейоз у тетраплоидных самцов щиповок Cobitis из клонально-бисексуального комплекса рек Волжского бассейна. Неполная генетическая совместимость форм, участвующих в возникновении таких самцов, приводит к несбалансированности их гамет и отсутствию потенциала для репродукции. По-видимому, стабильные формы в этом комплексе Cobitis существуют в динамическом равновесии, спонтанно возникающие тетраплоидные особи маркируют своеобразную «гибридную зону».
ВВЕДЕНИЕ
У щиповок рода Cobitis (Cobitidae), обитателей рек и водоемов Евразии наряду с бисексуальными диплоидными видами обнаружены клональные формы, представленные, как правило, триплоидными самками [1, 2, 15, 22]. Уникальный случай существования одноположенского тетраплоидного клопа выявлен в бассейне р. Доп [4-5]. Клональные формы щиповок размножаются путем гиногенеза, для стимуляции их яйцеклеток нужна сперма, поэтому они обитают только совместно с близкими двуполыми видами. В комплексе Cobitis из бассейна р. Волга (р. Москва, Ока и Сура), помимо триплоидной формы (3n = 74), двуполых видов C. taenia (2n = 48) и C. melanoleuca (2n = 50), обнаружены две тетраплоидные формы, возникающие de novo в каждом поколении щиповок. Показано их происхождение в результате гибридизации триплоидной формы с самцом одного из диплоидных видов, когда при нарушении гиногенеза происходит истинное оплодотворение самки [7, 24]. Тетраплоидная форма (3n + 25) от скрещивания триплоидов с C. melanoleuca представлена только самками, тетраплоидная форма (3n + 24) от скрещивания с самцами C. taenia - самками и самцами. Исследование методом ДНК-фингерпринтинга подтвердило генетическую неоднородность и гибридное происхождение тетраплоидов из р. Москва, что принципиально отличает их от тетраплоидных самок из бассейна р. Доп. У последних обнаружены практически одинаковые фингерпринтные спектры, свидетельствующие о моноклональности и о клональном наследовании этой формы щиповок [б]. Тетраплоидные формы, представленные самками и единичными самцами, возникающие, по-видимому, de-novo, выявлены также в клонально-бисексуальных комплексах Cobitis из во-
доемов бассейна рек Висла и Одер, в среднем течении р. Дунай, где совместно с триплоидными женскими клонами обитают виды C. taenia и C. elongotoides (2n = = 50) [16-18, 21].
Исследование репродуктивных способностей тетраплоидных особей из бассейна р. Волги проводили с помощью экспериментальной гибридизации, оценки развития семенников, качества и подвижности спермы, гистологического и цитогенетического анализа [2, 7, 20, 24]. Тетраплоидные самки обоих форм, как и трип-лоидная родительская форма, оказались способны к гиногенетическому размножению, однако их плодовитость была снижена: в гонадах выявляли менее 10 зрелых ооцитов, у некоторых самок оогенез был заблокирован на стадии поздней мейотической профазы [2, 20, 24]. У некоторых тетраплоидных самцов гонады отсутствовали, у других были недоразвиты, в их протоках обнаруживали соединительную ткань. Генеративные клетки и, соответственно, сперматозоиды, были сформированы не у всех тетраплоидных самцов, нарушение подвижности и дефекты спермы указывали на стерильность носителей. Тем не менее, сперма оказалась способна к стимуляции гиногенетического развития клональных самок, однако процент развития личинок был намного ниже, чем таковой при использовании самцов бисексуальных видов [2, 24]. Частичная плодовитость тетраплоидных особей вызвала обсуждение гипотезы о возможности восстановления бисексуальности на четно-полиплоидном уровне в комплексах щиповок [2, 8-9].
Целью данной работы было углубленное изучение стадий мейоза у тетраплоидных самцов Cobitis с наиболее продвинутым сперматогенезом для оценки генетического качества спермы, а также возможности их участия в дальнейшем размножении.
3028
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материал для исследования был собран летом 2004 г. в р. Ока (район г. Пущино) и в р. Москва (район г. Старая Руза), для цитогенетического анализа использованы 3б особей из диплоидно-полиплоидного комплекса Cobitis. Кроме того, для анализа мейоза использованы препараты трех тетраплоидных самцов из улова 2003 г. с наиболее продвинутым сперматогенезом.
Препараты митотических и мейотических хромосом щиповок готовили по стандартным методикам, использовали рутинную окраску раствором Гимза, анализировали под световым микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Триплоидные самки (3n = 74) составили более половины улова щиповок Cobitis в 2004 г., тетраплоид-ных оказалось 11 %, остальные особи принадлежали к диплоидным видам C. taenia (2n = 48) и C. melanoleuca (2n = 50). Сходное число тетраплоидов (до 20 %) по отношению ко всему улову щиповок оказалось в 2003 г. Отметим, что выявлены колебания относительной численности форм в комплексе Cobitis в зависимости от локального биотопа, времени нерестового периода и по годам [10]. Максимальная доля тетраплоидов в улове составила 34,б % в 1982 г. [2], что соответствует частоте формирования мужского пронуклеоса при оплодотворении яиц у триплоидных щиповок [23].
В происхождении клональной триплоидной формы предполагают участие вида, близкого к современному C. taenia, что подтверждено анализом ядерного и митохондриального геномов [13]. По-видимому, более близкое эволюционное родство триплоидной клональной формы с C. taenia, чем с C. melanoleuca объясняет тот факт, что ее скрещивание с первым более успешно, чем со вторым. Тетраплоидное потомство (3n + 24) от скрещивания клональной формы с C. taenia представ-лепо самками и самцами (в соотношении примерно 2:1); в целом, их больше, чем тетраплоидного потомства (3n + 25), представленного только самками, от скрещивания триплоидов с C. melanoleuca. Это обстоятельство само по себе косвенно подтверждает участие вида, близкого к C. taenia, в происхождении как современного C. taenia, так и триплоидной женской формы. Однако низкая плодовитость или стерильность потомства от скрещивания триплоидов с C. taenia указывает на независимую генную дивергенцию этих форм после их обособления в ходе эволюции.
Отметим, что если генетические расхождения исходных форм затрудняют совместное функционирование их генов в геномах гибридных особей, дополнительные осложнения вносит гетероморфность половых хромосом. Поэтому с ростом генетического расстояния между исходными видами первым утрачивает жизнеспособность или плодовитость гетерогаметный пол. Это наблюдение Д. Холдейна [19] впоследствии было показано при гибридизации разных таксонов, в т. ч. у млекопитающих [11]. У щиповок Cobitis мужской пол - гетерагаметный [3]. Вероятно, с этим связаны как различия в соотношении полов у потомства от гибридизации клональной формы с бисексуальными видами, так и более продвинутый оогенез по сравнению со сперматогенезом у потомства от оплодотворения трип-лоидов самцами C. taenia.
У одного из тетраплоидных самцов улова 2004 г. не удалось обнаружить гонад. На мейотических препаратах другого самца обнаружили только мелкие клетки, мейоциты отсутствовали. Визуальное отсутствие гонад или наличие на препаратах только сперматогониаль-ных клеток, указывающее на блокаду сперматогенеза на ранних стадиях, выявили и у тетраплоидных самцов улова 2003 г. Однако у одного тетраплоидного самца из пойманных в 2004 г. и у нескольких из улова предыдущего года на мейотических препаратах выявили клетки, соответствующие стадиям мейоза до метафазы I (рис. 1). В некоторых мейоцитах хромосомные элементы были более сжатыми, компактными, чем в клетках у самцов бисексуальных видов, такая аномальная упаковка хроматина косвенно свидетельствует о трудности функционирования в гибридном геноме генов, полученных от родителей [11]. В сперматоцитах на стадии поздней пахитены элементы были тесно ассоциированы (рис. 1а), в таких клетках вряд ли возможно завершение мейоза. Небольшое число клеток на поздних стадиях подтверждает блокаду мейоза в профазе I у исследованных самцов. На стадии диплотены выявляли несимметричные хромосомные ассоциации - цепочки, состоящие из более чем двух хромосомных элементов (рис. 1б, 1в). Эти ассоциации не распадались и в диакинезе - метафазе I, формируя мультиваленты наряду с унивалентами и бивалентами (рис. 1 г, 1 д, 1 е). В некоторых мейоцитах на стадии диакинез - метафаза I был сформирован как минимум один кольцевой те-травалент (рис. 1в, 1г, 1е), в других обнаруживали большое число унивалентов (рис. 1д). Разное число мультивалентов, бивалентов и унивалентов приводило к различию в общем числе хромосомных конфигураций, их насчитывали от 46 до 60 в разных мейоцитах.
Таким образом, у тетраплоидных самцов выявили спектр нарушений от отсутствия гонад до формирования аномальных сперматозоидов вследствие несбалансированного мейоза. Выраженность нарушений, по-видимому, зависит от индивидуальных различий в сочетании генетических факторов, которые, как и гетероморфность половых хромосом, оказывают влияние при частичной совместимости геномов, обусловленной генетической дифференциацией исходных форм.
Результаты светового исследования сперматоцитов указывают на неполное спаривание в бивалентах и мультивалентах, точные сведения о характере синапси-са в мейоцитах тетраплоидных самцов может дать только анализ синаптонемных комплексов (СК). Для завершения мейоза необходим регулярный синапсис в профазе I, существуют механизмы, позволяющие клетке пройти этот ключевой этап. Один из них - синаптическая подгонка, действующая на стадии пахитены и позволяющая сформировать спаренные биваленты и мультиваленты при отсутствии полной гомологии и четного числа хромосом. Однако в условиях несбалансированного генома не всегда возможно формирование регулярных мейотических конфигураций. Так, исследование СК у диплоидного вида тропических сомиков Trichomycterus йаугзг (2п = 54) показало неполное спаривание хромосом у самца со спонтанной триплоидией (3п = 81); на стадии пахитены, наряду с единичными полностью спаренными тривалентами, у него обнаружили частично спаренные биваленты и триваленты [14]. Другие механизмы, обеспечивающие регулярное
3029
спаривание хромосом, - премеиотическии эндомитоз, обособление или элиминация неспаренных хромосом. У триплоидных (3п = 75) гибридов от скрещивания диплоидной (2п = 50) и тетраплоидной (2п = 100) бисексуальных форм вьюна Misgurnus anguillicaudatus премейотический эндомитоз у самок приводил к формированию псевдобивалентов в мейозе I и формирова-
нию гамет, а у самцов гексаплоидные сперматогонии блокировались до начала мейоза [25].
Ранее мы отмечали, что, несмотря на прогресс сперматогенеза до созревания сперматозоидов у некоторых тетраплоидных самцов ЄоЬШ.'і и способность самок к гиногенетическому размножению, вряд ли возможны восстановление бисексуальности у тетра-
Рис. 1. Мейоз тетраплоидных самцов ЄоЬіНя, пойманных в 2003 (а-г; д) и в 2004 (е) гг.: а, б - мейоциты на стадии поздней па-хитены - диплотены, в - на стадии поздней диплотены; г-е - диакинез - метафаза I
б
а
д
в
г
е
3030
плоидов и/или образование новых форм у щиповок из рек Волжского бассейна [12]. Данное исследование подтвердило это предположение. У гибридных самцов мы не выявили ни одного мейоцита с регулярным спариванием, по-видимому, они формируют только неполноценные сперматозоиды. Особи со сниженной плодовитостью вряд ли могут составить конкуренцию существующим формам. Тетраплоидные самки, как и триплоидные родители, продуцируют клональные яйцеклетки посредством гиногенеза. Наличие клональной тетраплоидной женской формы в комплексе Cobitis, существующей совместно с бисексуальными видами, указывает на стабилизацию такой формы в ходе эволюции [5]. По-видимому, в исследуемом комплексе Cobitis формы сосуществуют в динамическом равновесии, где спонтанно возникающие тетраплоидные особи маркируют своеобразную «гибридную зону». Дивергенция стабильных форм этого комплекса, вероятно, достаточна, чтобы блокировать возникновение новых клональных форм и видов.
Дестабилизация геномов из-за различий исходных видов, по-видимому, служит причиной нарушений в мейоцитах и у возникающих спонтанно гибридных ящериц рода Darevskia, на выраженность аномалий влияет как вариант скрещивания, так и индивидуальные генные сочетания [9]. Сходное проявление гибридных нарушений в разных таксономических группах указывает на общность эволюционного процесса при становлении видов позвоночных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев В. П. Возможный путь возникновения тетраплоидных форм у позвоночных // Природа. 1981. № 4. С. 112-113.
2. Васильев В.П. Эволюционная кариология рыб. М.: Наука, 1985. 300 с.
3. Васильев В.П. Кариологическое разнообразие и таксономическая неоднородность Cobitis «taenia» Pisces, Cobitidae) // ДАН России. 1995. Т. 342. № 6. С. 839-842.
4. Васильев В.П., Васильева Е.Д., Левенкова Е.С. Тригибридное происхождение однополо-женской тетраплоидной формы рыб рода Cobitis (Pisces, Cobitidae) // ДАН. 2007. Т. 413. № 1. С. 124-127.
5. Васильев В.П., Лебедева Е.Б., Васильева Е.Д., Левенкова Е.С., Рысков А. П. Уникальный диплоидно^-тетраплоидный однополодвуполый комплекс рыб (Pisces, Cobitidae) // ДАН. 2005. Т. 404. № 4. С. 559-561.
6. Васильев В.П., Лебедева Е.Б., Васильева ЕД, Рысков А.П. Моноклональные и возникшие de novo тетраплоидные формы рыб рода Cobitis (Cobitidae) из различных клонально-бисексуальных комплексов // ДАН. 2007. Т. 416. № 4. С. 558-562.
7. Васильев В.П., Осинов А.Г., Васильева Е.Д. К проблеме сетчатого видообразования у позвоночных: диплоидно-триплоидно-тетраплоидный комплекс в роде Сobitis (Cobitidae^. V. Происхождение четно-полиплоидных видов // Вопросы ихтиологии. 1991. Т. 31. Вып. 2. С. 202-215.
8. Завьялов Е.В., Ручин А.Б., Шляхтин Г.В. Распространение и численность видов гиногенетических форм рыб семейства вьюновых (Pisces, Cobitidae) на севере Нижнего Поволжья и сопредельных территориях // Известия Саратовского университета. 2008. Т. 8. Вып. 2. С. 58-62.
9. Куприянова Л.А. Некоторые цитогенетические закономерности сетчатого видообразования однополых видов ящериц (Reptilia, La-certila) и других групп позвоночных животных // Цитология. 1997. Т. 39. № 12. С. 1089-1108.
10. Лебедева Е.Б. Структура и распространение клональнобисексуальных комплексов рыб р. Cobitis (Cobitidae): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2007. 25 с.
11. Левенкова Е.С. Гибридные нарушения мейоза у некоторых видов грызунов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2001. 24 с.
12. Левенкова Е.С., Васильев В.П. Мейоз у самцов тетраплоидной формы щиповок Cobitis из клонально-бисексуального комплекса р. Москвы // Современные проблемы биологической эволюции: материалы конф. М., 2007. С. 179-181.
13. Осинов А.Г., Васильева Е.Д., Васильев В.П. Гибридное происхождение триплоидной формы p. Cobitis (Pisces, Cobitidae) // ДАН СССР. 1983. Т. 272. № 3. С. 716-718.
14. Borin L.A., Martins-Santos I.C., Oliveira C. A natural triploid in Tri-chomycterus davisi (Siluriformes, Trichomycteridae): mitotic and mei-otic characterization by chromosome banding and synaptonemal complex analyses // Genetica. 2002. V. 115. P. 253-258.
15. Boron A. Karyotype study of diploid and triploid Cobitis taenia (Pisces, Cobitidae) from Vistula river basin // Cytobios. 1992. V. 72. P. 201-206.
16. Boron A. Karyotipes and cytogenetic diversity of the genus Cobitis (Pisces, Cobitidae) in Poland: a review. Cytogenetic evidence for a hybrid origin of some Cobitis triploids // Folia Biologica. 2003. V. 51, Suppl. P. 49-54.
17. Boron A., Danilkewicz Z. Diploid-polyploid complex of spined loach Cobitis taenia sensu stricto and Cobitis sp. from the Bug River, Poland (Pisces, Cobitidae) // Cytobios. 1998. V. 96. P. 13-22.
18. Boron A., Kotusz J. The preliminary data on diploid-polyploid complexes of the genus Cobitis in the Odra River basin, Poland (Pisces, Cobitidae) // Folia Zool. 2000. V. 49, Suppl. P. 79-84.
19. Haldane J.B.S. Sex-ratio and unisexual sterility in hybrid animals // J. Genet. 1922. V. 12. № 2. P. 101-109.
20. Lees J., Saat T. Oocyte final maturation in tetraploid spined loaches (Cobitis) from the Moscow river // Folia Biologica (Krakow). 2003. V. 51. P. 75-78.
21. Rab P., Rabova M., Bonlen J., Lusk S. Genetic differentiation of the two hybrid diploid-poliploid complexes of loaches, genus Cobitis (Co-bitidae) involving C. taenia, C. elongatoides and C. spp. in the Czech Republic: Karyotypes and cytogenetic diversity // Folia Zool. 2000. V. 49, Suppl. 1. P. 55-66.
22. Rab P., Slavik O. Diploid-triploid-tetraploid complex of the spined loach, genus Cobitis in Psovka Creek: the first evidence of the new species of Cobitis in the ichthyofauna of the Czech Republic // Acta Univ. Carolinae. Biologica. 1996. V. 39. № 3-4. P. 201-214.
23. Saat T. Reproduction of diploid and polyploidy spinous loaches (Cobi-tis, Teleostei). Oocyte maturation and fertilization in the triploid form // Ontogenez. 1991. V. 22. P. 533-541.
24. Vasil 'ev V.P., Akimova N.V., Emel’yanova N.G., Pavlov D.A., Va-sil’eva E.D. Reproductive capacities in the polyploidy males of spined loaches from the unisexual-bisexual complex, occurred in the Moscow River // Folia biologica (Krakov). 2003. V. 51, Suppl. P. 67-73.
25. Zhang Q., Arai K., Yamashita M. Cytogenetic mechanisms for triploid and haploid egg formation in the triploid loach Misgurnus anguillicau-datus // The Journal of Experimental Zoology. 1998. V. 281. P. 608-619.
Поступила в редакцию 15 мая 2013 г.
Levenkova E.S., Vasilyev V.P. TETRAPLOID FORMS AS A RESULT OF HYBRIDIZATION AT COEXISTENCE OF CLONAL-BISEXUAL SPINED LOACHES COBITIS
We investigated the meiosis of tetraploid males of spined loaches Cobitis from the unisexual-bisexual complex of Volga Basin’s river. Incomplete genetic compatibility of the forms, involved in the emergence of such males, leads to an imbalance of their gametes and the absence of potential for reproduction. Apparently the stable forms in this complex Cobitis exist in equilibrium, the spontaneously occurring tetraploid individual mark unique “hybrid zone”.
Key words: bisexual-clonal complexes; hybridization; meiosis; genus Cobitis.
3031
