Тетрахлорметановая модель гепатита и цирроза печени у крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Б >

ст

So L с

oe

gj о

Н1Ё

91

I- &

ТЕТРАХЛОРМЕТАНОВАЯ МОДЕЛЬ ГЕПАТИТА И ЦИРРОЗА К

ПЕЧЕНИ У КРЫС g

га

х *

Скуратов А. Г. jj

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет», Беларусь X

2

Скуратов Александр Геннадьевич а

E-mail: alexskuratov@mail.ru 5

V

m

РЕЗЮМЕ

Цель исследования: изучить в эксперименте на лабораторных животных особенности тетрах- н лорметановой модели токсического гепатита и цирроза печени, оценить возможности исполь- К зования этой модели при разработке способов коррекции процессов регенерации печени. Материалы и методы: белые крысы-самцы линии Vistar массой 200 г; внутрибрюшинное введение 50%-го раствора тетрахлорметана на оливковом масле в сочетании с пероральным назначением 10%-го раствора этилового спирта; морфологические и морфометрические методы. Результаты. В эксперименте получена модель токсического гепатита и цирроза печени при внутри-брюшном введении тетрахлорметана и пероральном назначении этилового спирта. Цирроз печени является постнекротическим и преимущественно мультилобулярным. Некроз, приведший к циррозу, чаще начинался центролобулярно и распространялся от центра дольки к ее периферии. Заключение. Выявлены особенности и недостатки данной экспериментальной модели цирроза печени: изменения в печени развивались различной степени выраженности, что может косвенно судить о неодинаковой чувствительности крыс к тетрахлорметану, фиброзные изменения имели обратимый характер после отмены препарата.

Ключевые слова: цирроз печени; тетрахлорметан; крысы; экспериментальная модель

SUMMARY

Research objective: to study in experiment on laboratory animals features of carbon tetrachloride-induced toxic hepatitis and liver cirrhosis, to estimate possibilities of application of this model for new methods of improvement of the liver regeneration research.

Materials and methods: Vistar white rats-males 200 g weight; intraperitoneal injection of 50% solution of carbon tetrachloride in olive oil with combination to administration per os of 10% ethyl alcohol; morphological and morphometrical methods.

Results. In experiment the model of a toxic hepatitis and liver cirrhosis is received in result of intraabdominal injections of carbon tetrachloride and peroral administration of ethyl alcohol. The liver cirrhosis is postnecrotic and mainly multilobular. The necrosis which has led to a cirrhosis, began centrolobularly is more often and extends from the lobe centre to its periphery.

Conclusion. The given experimental model of liver cirrhosis has its features and disadvantages: sensitivity of rats to carbon tetrachloride has appeared unequal, changes in a liver developed various degree of expression and had reversible character after carbon tetrachloride cancellation. Keywords: liver cirrhosis; carbon tetrachloride; rats; experimental model

m

ВВЕДЕНИЕ

СО

m

Цирроз печени и печеночная недостаточность (ПеН) является тяжелым состоянием, сопровождающимся печеночной энцефалопатией и полиорганной недостаточностью с чрезвычайно высокой летальностью, даже при проведении интенсивной терапии [1]. Лечение тяжелой ПеН продолжает оставаться одной из основных проблем в клинической медицине. Трансплантация печени является самой эффективной терапией, но ее применение ограничено из-за нехватки донорских органов. Несмотря на то, что продолжаются исследования различных устройств и систем для поддержания функции печени, не выявлены значительные эффекты на выживаемость пациентов с ПеН, и эти методики имеют значение как «мост» к трансплантации печени [2]. Экспериментальные модели позволяют дать комплексную оценку и разработать методы адекватной коррекции ПеН, что не всегда возможно в клинических исследованиях [3; 4]. Поэтому воспроизведение в эксперименте на животных моделей ПеН, близких к клиническим условиям, все еще необходимо [5; 6]. Существуют три основных подхода для воспроизведения ПеН у животных: хирургические манипуляции, токсическое повреждение печени и инфекционный процесс [7; 8]. Среди токсических моделей наиболее широко применяется тетрахлорметан-индуцированная ПеН. Однако остаются нерешенные вопросы, данные по ее адекватности и клинической сопоставимости противоречивы [9-11].

Цель работы — изучить в эксперименте на лабораторных животных особенности тетрахлорме-тановой модели токсического гепатита и цирроза печени, оценить возможности использования этой модели при разработке способов коррекции процессов регенерации печени.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проводили моделирование токсического гепатита у белых крыс самцов линии Вистар массой 200 г путем внутрибрюшинного введения 50%-го раствора СС14 (четыреххлористый углерод, тетрахлорметан) на оливковом масле из расчета 1 мл на кг массы тела два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Для потенцирования развития цирроза печени вместо питьевой воды крысы получали 10%-ный раствор этилового спирта с 3-х суток эксперимента. Условия опыта были стандартизированы. На 2, 20, 40, 60-й день животных выводили из эксперимента и изучали общую морфологическую и морфометри-ческую картину органов [12].

Кусочки органов фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике. Депарафинированные срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, после чего изучали общую

морфологическую картину органа. Подсчитывали митотический индекс (МИ) для определения активности клеточной регенерации и индекс двуядерных гепатоцитов (ИДГ) для оценки степени внутриклеточной регенерации и ацитокинетической активности. Для оценки выраженности метаболических процессов, связанных с делением клеток, определяли диаметр ядер, а в ядрах, имеющих овальную и неправильную форму, измеряли наибольший диаметр. Морфометрические исследования выполнялись с помощью аппаратно-системного комплекса Nicon Eclipse E200 c программой MorphoTest.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Острый токсический гепатит (ОТГ) характеризовался развитием колликвационного некроза, белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, локализованных преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, где максимальна активность зависимых от цитохрома Р450 монооксигеназ и преобладает продукция повреждающих метаболитов гепатотоксина.

Макроскопически печень увеличена в размерах, уплотнена, край закруглен (рис. 1 на цветной вклейке).

При ОТГ определяются деструкция, растворение и распад печеночных клеток, особенно выраженные в центральных отделах долек. Клеточная пролиферативная и инфильтративная реакция в первом деструктивном периоде болезни выражена очень слабо. Определяется также отек долек, связанный с токсическим повреждением стенок капилляров. Местами отек умеренно выражен и ведет к расширению пространств между трабекулами и капиллярами (пространств Диссе), местами отек более выражен и проявляется дис-комплексацией печеночных клеток: нарушением связи и образованием щелевидных пространств между отдельными клеточными элементами, составляющими трабекулу, в результате чего стирается нормальная архитектоника печени (рис. 2 на цветной вклейке).

В печени контрольной крысы гепатоциты имеют полигональную форму, поперечный размер составляет 15-25 мкм, диаметр ядер 6-9 мкм. Границы клеток хорошо различимы при окраске гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Определяются синусоидальный и билиарный (между соседними гепатоцитами) полюсы. Цитоплазма мелкозернистая и амфофильная. В перинуклеарной области и в области синусоидального полюса видны небольшие скопления мелкозернистого базофильного материала, соответствующего расположению зернистой эндоплазматической сети. Ядра преимущественно расположены в центрах клеток, содержат одно или несколько ядрышек. Большинство ядер правильной

округлой формы, некоторые ядра эллипсовидные, 10% — двуядерные (рис. 3 на цветной вклейке).

При введении тетрахлорметана в течение 20 дней в ткани печени определялись: жировой ге-патоз и центролобулярные некрозы; центролобу-лярные кровотечения и клеточная инфильтрация; гистиоцитарная инфильтрация в очагах некрозов; разрушение центров части долек с разрастанием соединительной ткани; регенерация печеночных клеток; аутолитические изменения, закупорка мелких желчных протоков желчными тромбами чередуются с пролиферацией мелких желчных протоков. Преимущественно в центрах долек определялись некрозы гепатоцитов с выраженной жировой и местами гидропической дистрофией, формированием ступенчатых некрозов и признаками замещения поврежденных гепатоцитов соединительной тканью, пролиферацией макрофагов и гистиоцитов. Портальные тракты расширены со слабовыра-женной лимфоидной инфильтрацией с примесью макрофагов, гистиоцитов и единичных нейтро-фильных гранулоцитов. Митотическая активность повышена, наблюдалась выраженная гиперплазия ядер, но количество двуядерных гепатоцитов уменьшено (рис. 4 на цветной вклейке).

В ткани печени крысы через 20 дней после введения четыреххлористого углерода наблюдались выраженные фиброзные изменения (рис. 5 на цветной вклейке). Так, площадь фиброза в печени контрольной крысы составила 49 мкм2, а в ткани печени опытной крысы — 294 мкм2.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ ПРИ РАЗВИТИИ ЦИРРОЗА

К 60-му дню опыта у большинства крыс развилась картина цирроза печени (ЦП). При этом было отмечено, что у разных крыс макро- и микроскопическая картина печени отличалась, что косвенно может свидетельствовать о неодинаковой чувствительности крыс к тетрахлорметану (рис. 6, 7на цветной вклейке).

При микроскопии печеночные клетки главным образом на периферии долек формируют фокусы узловой гиперплазии, не имеющие правильно сконструированной кровеносной и желчевыводящей систем, беспорядочно располагаются среди соединительной ткани и формируют цирроти-ческую печень. При этом паренхима представлена ложными дольками равномерной величины, разделенными узкими прослойками соединительной ткани — септами. В септах — инфильтрация из полиморфноя-дерных лейкоцитов с примесью гистиоцитов и отдельных лимфоцитов и пролиферация желчных протоков. В ложных дольках отсутствует балочное строение, характерна жировая дистрофия гепатоцитов. Цирроз является постнекротическим и преимущественно мультилобулярным, при этом определяется полное нарушение пластинчатого строения долек и формируются очень мелкие узелки, лежащие среди фиброзной ткани. Некроз, приведший к циррозу, чаще начинается центролобулярно и распространяется от центра дольки к ее периферии, встречаются также мостовидные некрозы (рис. 8 на цветной вклейке).

Для определения активности клеточной регенерации был рассчитан митотический индекс (МИ), а для оценки степени внутриклеточной регенерации и ацитокинетической активности — индекс двуядерных гепатоцитов (ИДГ). Для оценки выраженности метаболических процессов, связанных с делением клеток, определяли диаметр ядер (ДЯ), а в ядрах, имеющих овальную и неправильную форму, измеряли наибольший диаметр (табл. 1).

Таким образом, активность клеточной регенерации была наиболее выраженной при ОТГ в модели с тетрахлорметаном, снижалась к 40-му дню и далее. Внутриклеточная регенерация имела тенденцию к снижению к 20-40-му дню, а к 60-м суткам снова повышалась. Диаметр ядер гепатоцитов на

Б >

ст

So

1_ о

0£ QJ CT

HJË

2 £

I- £

и

га

L К

га

х

*

га

I-

х ш 2 s а ш с и

V

m

Таблица 1

ИЗМЕНЕНИЯ В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ, М ± 2

Группы МИ ИДГ ДЯ

1. ОТГ СС1, 3,4 ± 0,48 114,46 ± 11,69 16,96 ± 4,78

2. СС14 20 дней 2,9 ± 0,74 65,4 ± 7,1 14,24 ± 1,86

3. СС14 40 дней 1,6 ± 0,35 66,48 ± 7,61 13,04 ± 5,18

4. ЦП 60 дней № 1 1,9 ± 0,18 92,15 ± 9,3 17,89 ± 3,56

5. ЦП 60 дней № 2 1,9 ± 0,25 91,04 ± 8,5 18,56 ± 3,12

6. Контроль 1,7 ± 0,46 115,8 ± 12,6 8,15 ± 0,66

Достоверность различия (значение p, однофакторный дисперсионный анализ) < 0,05 < 0,05 < 0,05

Примечание. МИ — митотический индекс (%); ИДГ — индекс двуядерных гепатоцитов (%); ДЯ — диаметр ядер (мкм).

о m

Таблица 2

ОЦЕНКА ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПО ИНДЕКСУ СТЕПЕНИ ХРОНИЗАЦИИ

Показатель Группы животных

1 2 3 4 5 6

Фиброз и расширение портальных трактов 0 1 2 1 2 0

Сегментарный перипортальный фиброз 0 1 4 2 4 0

Синусоидальный фиброз 0 1 4 1 4 0

Наличие портосептальных септ 0 2 12 9 12 0

Наличие септ, фиброза и ложных долек 0 2 14 0 15 0

Всего 0 7 18 12 19 0

протяжении всего опыта был статистически значимо больше, чем у контрольной крысы.

Была произведена оценка фиброзных изменений по индексу степени хронизации (табл. 2).

Как видно из таблицы, при ОТГ (группа № 1) и в контрольной группе № 6 фиброзных изменений печени не выявлено. Через 20 суток наблюдалась I степень фиброзных изменений. Через 40 суток назначения тетрахлорметана была выявлена IV стадия хронизации фиброзных изменений (группа № 3). Через 2 месяца у крысы № 4 имел место тяжелый фиброз печени (III стадия хронизации), у крыс № 5 — цирроз печени (IV стадия хронизации).

После прекращения введения тетрахлормета-на через 2 месяца было отмечено, что фиброзные и цирротические изменения в печени стали менее выраженными, таким образом, они носили обратимый характер (рис. 9 на цветной вклейке).

ВЫВОДЫ

1. Проведенные исследования подтвердили, что при внутрибрюшном введении тетрахлорметана развивается токсическое поражение печени крысы. Гепатотропное действие тетрахлорметана потенцируется пероральным назначением 10%-го раствора этилового спирта вместо питьевой воды.

2. Токсические и дистрофические изменения начинаются уже на 2-е сутки с развитием острого токсического гепатита, к 20-м суткам — подострый токсический гепатит с начинающимися фиброзными изменениями, а к 40-60-м суткам развивается картина тяжелых фиброзных изменений и цирроза печени.

3. Цирроз печени является постнекротическим и преимущественно мультилобулярным. Некроз, приведший к циррозу, чаще начинается центро-лобулярно и распространяется от центра дольки к ее периферии, встречаются также мостовидные некрозы.

4. Было выявлено, что при одинаковых условиях эксперимента у различных крыс развивались неодинаковые морфологические изменения в печени к 60-м суткам, что может говорить о различной чувствительности крыс к тетрахлорметану. Также было отмечено, что после отмены препарата фиброзные цирротические изменения в печени носили обратимый характер. Эти факторы могут затруднить объективную оценку регенераторных процессов в печени при разработке новых методов их коррекции. Необходимо продолжить изучение и разработку оптимальной модели цирроза печени.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белякин С.А. Смертность от цирроза печени как индикатор уровня потребления алкоголя в популяции / С.А. Белякин, А.Н. Бобров // Вестн. Рос. Военно-мед. акад. — 2009. — Т. 3. — С. 189-194.

2. ДолгихМ.С. Перспективы терапии печеночной недостаточности с помощью стволовых клеток / М.С. Долгих // Биомед. химия. — 2008. — Т. 54, вып. 4. — С. 376-391.

3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2005. — 832 с.

4. Constandinou C. Modeling liver fibrosis in rodents / C. Constandinou, N. Henderson, J.P. Iredale // Methods Mol. Med. — 2005. — Vol. 117: 237-250.

5. Abraldes J.G. Animal model of portal hypertension / J.G. Abraldes, M. Pasarin, J.C. Garcia-Pagan // World J. Gastroenterol. — 2006. — Vol.

12, № 41. — P. 6577-6584.

6. Hayashi H. Animal models for the study of liver fibrosis: new insights from knockout mouse models. / H. Hayashi, T. Sakai // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2011. — Vol. 300, № 5. — G729-738.

7. Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия / Ю.М. Лопухин. — М.: Медицина, 1971. — 344 с.

8. Laleman W. A stable model of cirrhotic portal hypertension in the rat: thioacetamide revisited / W. Laleman et al. // Eur. J. Clin. Invest. —

2006. — Vol. 36, № 4. — P. 242-249.

9. Mullen K.D. Problems with animal models of chronic liver disease: suggestions for improvement in standardization / K.D. Mullen, A.J. McCullough // Hepatology. — 1989. — Vol. 9. — P. 500-503.

10. Jimenez W. Carbon tetrachloride induced cirrhosis in rats: a useful tool for investigating the pathogenesis of ascites in chronic liver disease / W. Jimenez, J. Claria, V. Arroyo // J. Gastroenterol. Hepatol. — 1992. — Vol. 7: 9097

11. Tu C.T. Antifibrotic activity of rofecoxib in vivo is associated with reduced portal hypertension in rats with carbon tetrachloride-induced liver injury / C.T. Tu, J.S. Guo, M. Wang // J. Gastroenterol. Hepatol. —

2007. — Vol. 22, N 6. — P. 877-884.

12. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. — М.: Медицина, 1990. — 383 с.

ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ

ТЕТРАХЛОРМЕТАНОВАЯ МОДЕЛЬ ГЕПАТИТА И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ У КРЫС

Рис. 2. Ткань печени крысы при ОТГ: деструкция гепа-тоцитов в центральных отделах долек, инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами, жировая дистрофия гепатоцитов. х 400. Окраска гематоксилин-эозин.

Рис. 1. Фотография брюшной полости крысы при моделировании ОТГ.

Рис. 3. Ткань печени контрольной крысы: участок дольки печени с портальным трактом. х400. Измерение диаметра ядер. Окраска гематоксилин-эозин.

Рис. 4. Ткань печени крысы через 20 дней после введения тетрахлорметана: участок дольки печени с центральной веной. х400. Выраженная жировая и гидропическая дистрофия гепатоцитов, центролобулярные кровоизлияния. Окраска гематоксилин-эозин

Рис. 5. Ткань печени крысы через 20 дней после введения тетрахлорметана: фиброзные изменения в строме с тенденцией к формированию ложных долек (указано стрелками). х100. Окраска гематоксилин-эозин

Рис. 6. Фотография печени крысы № 1 на 60-е сутки введения тетрахлорметана: печень увеличена, мелкобугристая, уплотнена, край закруглен

Рис. 7. Фотография печени крысы № 2 на 60-е сутки назначения тетрахлорметана: печень уменьшена, разнобугристая, плотная, имеются признаки портальной гипертензии (асцит, спленомегалия)

Рис. 8. Ткань печени при постнекротическом циррозе: формирование мультилобулярных ложных долек, разделенных полями соединительной ткани, перицеллюлярный и центролобулярный фиброз, жировая дистрофия гепатоцитов.х100. Окраска по Ван-Гизон: Л — крыса № 1, Б — крыса № 2

Рис. 9. Печень крысы через 2 месяца после прекращения введения тетрах-лорметана