Тестирование праймеров, сконструированных для детекции генов а-субъединицы бифенил-2,3-диоксигеназы бактерий, выделенных из загрязненных почв Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2013 БИОЛОГИЯ Вып. 3

ГЕНЕТИКА

УДК 579.25

ТЕСТИРОВАНИЕ ПРАЙМЕРОВ, СКОНСТРУИРОВАННЫХ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ГЕНОВ а-СУБЪЕДИНИЦЫ БИФЕНИЛ-2,3-ДИОКСИГЕНАЗЫ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

Е. С. Шумковаа ь, Е. Г. Плотниковаа с

а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, Голева, 13; ekaterinash80@mail.ru ь Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, г. Москва, Вавилова, 32 с Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; peg@iegm.ru; (342)2808431

Проведены эксперименты по тестированию праймеров, сконструированных для скрининга генов bphAl (кодирующих а- субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы), на ДНК-матрице грам-положительных и грамотрицательных бактерий-деструкторов бифенила. Амплифицированы участки генов bphAl, соответствующие кластеру Риске бифенил 2,3-диоксигеназы. Для амплификации более протяженного участка гена bphA1, включающего фрагменты, кодирующие кластер Риске и активный центр фермента, прямые (forvard) праймеры были также использованы в комбинации с обратным (reverse) праймером, предложенным S. Iwai с соавторами [2010]. У исследуемых бактерий были выявлены bphA1 гены, сходные с bphA1 генами бактерий Rhodococcus sp. HA99 (AB272986) и R04 (DQ403247), существенно отличающиеся от известных генов, кодирующих а-субъединицы подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ. Выявлена пара праймеров, оптимальная для скрининга генов bphA1, кодирующих а-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназ разных подсемейств.

Ключевые слова: полихлорированные бифенилы (ПХБ); а-субъединица бифенил 2,3-диоксигеназы; бактерии; Rhodococcus; Pseudomonas; вырожденные праймеры; тестирование праймеров; гены bphA1.

Введение

Исследование разнообразия функциональных генов, кодирующих ключевые ферменты деструкции устойчивых ксенобиотиков, позволяет оценить биодеградативный потенциал микробного сообщества. Бифенил 2,3-диоксигеназа (БДО) является первым ферментом «верхнего» пути деструкции бифенила/ПХБ у бактерий [Pieper, 2005]. Структура ее активного центра, сформированного аминокислотами а-субъединицы (BphAl), определяет спектр утилизируемых конгенеров ПХБ - высокотоксичных стойких соединений, обладающих мутагенным и канцерогенным эффектом [Ross, 2004]. Известные праймеры для скрининга генов bphA1 [Witzig et al., 2006; Iwai et al., 2010] позволяют ам-плифицировать участок гена, кодирующий активный центр фермента. На основе известных нуклеотидных последовательностей генов а-субъединиц

БДО бактерий рода Rhodococcus, нами были подобраны вырожденнные праймеры (несколько вариантов прямого, &1гай(Р) - праймера и один обратный геуегее^)-праймер) к консервативным

участкам гена bphA1, позволяющие амплифициро-вать его фрагмент, соответствующий кластеру Риске [Шумкова, Плотникова, 2012]. Каждый вариант прямого праймера можно использовать в паре с обратным, для амплификации части гена, соответствующей кластеру Риске (450-500 п.н.); или с обратным праймером, предложенным S. ^а1 с соавторами [2010] - для амплификации более протяженного участка гена bphA1 (около 1000 п.н.), кодирующего кластер Риске и активный центр фермента.

Цель данной работы - экспериментальная проверка праймеров и выявление наиболее оптимальных из них для исследования разнообразия бакте-

© Шумкова Е. С., Плотникова Е. Г., 2013

Rhodococcus sp. G13mor, G13krg (почва, ОАО «Галоген», г. Пермь), R. ruber S9a (г. Серпухов, Московская обл.) и B107a-f, KT112-7b (почва, ОАО «Уралкалий», г. Березники, Пермский край). Бактерии были выделены из образцов почв методом накопительного культивирования, как описано [Шумкова и др., 2014].

Выделение тотальной ДНК и амплификация bphAl генов. Выделение тотальной ДНК бактерий-деструкторов проводили по общепринятому методу [Ausbel et al., 1995]. Амплификацию bphA1 генов, кодирующих а-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Б/Т ДО) [Gibbson, Parales, 2000], осуществляли с использованием праймеров, представленных в табл. 1 при условиях реакции, предложных S. Iwai с соавторами [2010].

Продукты реакции разделяли методом электрофореза в агарозном геле (1%) при напряжении 10 V/см, окрашивали раствором бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали в УФ-свете с использованием системы гель-документирования Gel DocTM XR («Bio-Rad Laboratories», США).

Таблица 1

Праймеры, использованные в работе, для амплификации генов bphA1

Название праймера Направление синтеза цепи ДНК Нуклеотидная последовательность праймера Ссылка

BphA1F409 BphA1F450 BphA1F462 BPHD-f3 BphA1R900 BPHD-r1 Прямой Прямой Прямой Прямой Обратный Обратный 5-TTCTTGGCTGYTKHTSGSNCA-3' 5-CCGGCGACTTYATSACSAMSTACAT-3' 5-TGACCACGTACATGGGBGARGA-3' 5'-AACTGGAARTTYGCIGCVGA-3' 5'-TCSGCDGCRAWYTTCCAGTT-3' 5'-ACCCAGTTYTCICCRTCGTC-3' Шумкова, Плотникова, 2012 Шумкова, Плотникова, 2012 Шумкова, Плотникова, 2012 Iwai et al., 2010 Шумкова, Плотникова, 2012 Iwai et al., 2010

риальных генов, кодирующих а-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. В работе использованы бактерии, выделенные из почвы, загрязненной (галоген)ароматическими соединениями (территория ОАО «Галоген», г. Пермь): Rhodococcus sp. P1, P2m, P2kr, P2(51), P12, P13, P20, Rhodococcus sp. P23a, G12a [Шумкова и др., 2014], Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ896) [Плотникова и др., 2012], Rhodococcus sp. G10; из почвы, загрязненной ПХБ (г. Серпухов, Московская обл.): Pseudomonas sp. S210, S211, S212; Rhodococcus sp. B7b, B106a [Шумкова и др., 2014], B7a [Егорова и др., 2010], KT112-7 [Егорова и др., 2013] (почва, ОАО «Уралкалий», г. Березники, Пермский край). Кроме того, в настоящей работе были использованы штаммы бактерий-деструкторов ароматических соединений (из рабочей коллекции лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН) Arthrobacter sp. P24a,

Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v 3.1 («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США), в соответствии c рекомендациями производителя. Сравнение выявленных нуклеотидных последовательностей bphA1 генов с гомологичными последовательностями, депонированными в GenBank (http:/www. ncbi.nlm.nih.gov), проводили с помощью алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Результаты и их обсуждение

Тестирование сконструированных праймеров для амплификации фрагмента гена bphAl, соответствующего кластеру Риске БДО. Для

экспериментальной проверки сконструированных праймеров была проведена ПЦР на ДНК-матрице грамположительных и грамотрицательных бактерий-деструкторов бифенила. У ряда исследуемых

бактерий (штаммы, близкие по гену 16S рРНК R. wratislaviensis, бактерии родов Arthrobacter, Pseudomonas) ранее с праймерами, предложенными R. Witzig с соавторами [2006], были обнаружены гены bphA 1 (кодирующие большую субъединицу БДО), относящиеся по классификации D. Gibbson и R. Parales [2000] к подсемейству бифенил-толуол диоксигеназ (Б/Т ДО). Однако у бактерий, близких R. erythropolis, амплификации не наблюдалось [Шумкова и др., 2014].

Комбинации тестируемых праймеров, сайты их отжига на нуклеотидной последовательности гена bphA1 и ожидаемый размер ПЦР-продукта представлены в табл. 2.

С прямыми праймерами BphA1F409, BphA1F450, BphA1F462 в комбинации с обратным праймером BphA1R900 [Шумкова, Плотникова, 2012], а также с праймерами BPHD-f3/BPHD-r1 [Iwai et al., 2010], была проведена ПЦР (табл. 3). Наиболее успешно прошла амплификация с праймерами BphA1F450/BphA1R900. При использовании олигонуклеотидов

BphA1F406/BphA1R900 концентрация полученно-

го ПЦР продукта была наименьшей. Амплифика- роткий неспецифический ПЦР-продукт. С ВРНЭ-

ция с праймерами BphA1F462/BphA1R900 помимо f3/BPHD-r1 положительный результат получен для

ПЦР-продукта ожидаемой длины давала более ко- всех исследуемых штаммов (табл. 3).

Таблица 2

Характеристика участков генов bphA1, амплифицируемых с разными комбинациями праймеров

Параметр Праймер BphAlF409 BphAlF450 BphAlF462 BPHD-O

Амплифицируемый участок BphAlR900 179 - 690 220 - 690 2З2 - 690 -

гена BPHD-rl 179 - 1194 220 - 1194 2З2 - 1194 670 - 1194

Размер амплифицированного BphAlR900B 511 470 458 -

фрагмента* PHD-rl 1115 974 962 524

Соответствие функциональ- BphAlR900B к р ** к.Р. к.Р. -

ным участкам белка PHD-rl к.Р.+а.ц. к.Р.+а.ц. к.Р.+а.ц. а.ц.

* Размер амплифицированного фрагмента с указанным в данной графе обратным праймером (BphAlR900 или

ВРНЭ-г1)

** к.Р - кластер Риске, а.ц. - активный центр

Таблица 3

Результат амплификации короткого фрагмента гена bphA1, соответствующего кластеру Риске

Праймеры

Штамм BphAlR900

BphAlF406 BphAlF450 BphAlF462

Rhodococcus sp. Р1З + + +

Rhodococcus ruber P25 - - +

Rhodococcus sp. G10 + + +

Rhodococcus sp. KTll2-7b + + +

Rhodococcus sp. KT112-7 + + +

Тестирование сконструированных праймеров в комбинации с обратным праймером, предложенным S. Iwai для амплификации протяженного фрагмента гена bphAl, соответствующего кластеру Риске и активному центру БДО. Прямые праймеры BphA1F409, BphA1F450, BphA1F462 в комбинации с обратным BPHD-r1 [Iwai et al., 2010] были протестированы на ДН-К-матрице 7 штаммов (R. wratislaviensis KT112-7, Rhodococcus sp. KT112-7b, P13, G10, P23a, Rhodococcus ruber P25, Pseudomonas sp. S211). Наиболее успешно прошла амплификация с олигонуклеотидами BphA1F450/BPHD-r1: ПЦР-продукт ожидаемой длины (около 1000 п.н.) был получен для 4 штаммов: R. wratislaviensis KT112-7, Rhodococcus sp. P13 и G10, Pseudomonas sp. S211 (табл. 4). При использовании праймеров BphA1F462/BPHD-r1 ПЦР положительный результат получен для 2 из 7 штаммов: Rhodococcus sp. P23a и Pseudomonas sp. S211. С праймерами BphA1F409/BPHD-r1 амплификации не было ни в одном случае. Вероятно, это связано с большой степенью вырожденности праймера BphA1F409 [Шумкова, Плотникова, 2012].

Дальнейший анализ проводили с парами праймеров BphA1F450/BPHD-r1,

BphA1F462/BPHD-r1 на ДНК-матрице 24 штаммов-деструкторов бифенила (Rhodococcus sp. P1, P2m, P2kr, P2(51), P12, P13, P20, P23a, G10, G12a, G13mor, G13krg, B7a, B7b, B106a, B106a-f, KT112-7b, R. wratislaviensis KT112-7, R. ruber P25 и S9a, Arthrobacter sp. P24a, Pseudomonas sp. S210, S211,

S212) (табл. 4). При использовании праймеров BphA1F450/BPHD-r1 амплификация прошла успешно с ДНК-матрицы 20 штаммов, а с праймерами BphA1F462/BPHD-r1 ПЦР-продукт ожидаемой длины получен только для 13 штаммов (табл. 4). При этом с праймерами BphA1F462/BPHD-r1 прошла специфичная аплификация с ДНК-матри-цы штаммов, близких по гену 16S рРНК R. erythropolis, R. ruber, Pseudomonas. Тогда как с праймерами BphA1F450/BPHD-r1 ампликоны ожидаемого размера (около 1000 п.н.) были получены с ДНК-матрицы штаммов, близких по гену 16S рРНК R. wratislaviensis.

Амплификации протяженного участка гена bphA1 R. ruber P25 (около 1000 п.н.) не было с парами праймеров: BphA1F450/BPHD-r1,

BphA1F462/BPHD-r1. Однако удалось амплифици-ровать небольшие фрагменты, около 450-500 п.н., соответствующие кластеру Риске (с использованием олигонуклеотидов BphA1F462/BphA1R900) и активному центру фермента (BPHD-f3/BPHD-r1).

Таким образом, с праймерами BphA1F450/BPHD-r1 успешно амплифицировались bphA1 гены всех перечисленных групп бактерий (табл. 4), за исключением Arthrobacter, bphA1, ген которого не удалось амплифицировать и с парой праймеров BphA1F462/BPHD-r1. Тогда как с олигонуклеотидами BphA1F462/BPHD-r1 удалось получить специфичный ПЦР-продукт с ДНК-матрицы псевдомонад, R. ruber S9a и бактерий, близких по гену 16S рРНК R. erythropolis (табл. 4).

Определение и анализ нуклеотидных последовательностей. Было проведено частичное се-квенирование и последующий анализ полученного ПЦР-продукта для ряда штаммов. Амплифициро-ванные участки функциональных генов штаммов Rhodococcus sp. Pl, P13 были сходны с генами а-субъединиц подсемейства бифенил/толуол диокси-геназ (Б/Т ДО) известных бактерий-деструкторов ароматических соединений, представителей рода Rhodococcus. Фрагмент гена, амплифицированного

на ДНК-матрице деструкторов бифенила Pseudomonas sp. S211, имел 100%-ное сходство с bphA1 геном известных грамотрицательных штаммов-деструкторов бифенила родов Achromobacter и Pseudomonas. Таким образом, нами амплифици-рованы более протяженные участки (около 1000 п.н.) тех же генов, короткие фрагменты которых были получены ранее [Шумкова и др., 2014] с помощью праймеров, предложенных R. Witzig [Witzig et al., 2006].

Таблица 4

Результат амплификации фрагментов гена bphA1, включающего кластер Риске и активный центр фермента, и короткого фрагмента, соответствующего активному центру

Праймеры

Штамм BPHD-rl

BphAlF450 1 BphAlF462 | BPHD-f3

Штаммы, близкие по гену 16S рРИК Rhodococcus wratislaviensis

Rhodococcus sp. Pl + - н.о.*

Rhodococcus sp. P12 + - н.о.

Rhodococcus sp. P13 + - +

Rhodococcus sp. P20 + - н.о.

Rhodococcus sp. G10 + - +

Rhodococcus sp. KTll2-7b - - +

R. wratislaviensis KT112-7 + - +

Rhodococcus sp. B7a + - +

Штаммы, близкие по гену 16S рPHК Rhodococcus erythropolis

Rhodococcus sp. P2m + + -

Rhodococcus sp. P2kr + + +

Rhodococcus sp. P2(51) + + н.о.

Rhodococcus sp. P23a - + +

Rhodococcus sp. Gl2a + + +

Rhodococcus sp. Gl3mor + - -

Rhodococcus sp. Gl3krg + + н.о.

Rhodococcus sp. B7b + + +

Rhodococcus sp. Bl06a + + -

Rhodococcus sp. Bl06a-f + + +

Штаммы Rhodococcus ruber

R. ruber P25 - - +

R. ruber S9a + + +

Arthrobacter sp.

Arthrobacter sp. P24a - - н.о.

Штаммы Pseudomonas sp.

Pseudomonas sp. S210 + + н.о.

Pseudomonas sp. S211 + + +

Pseudomonas sp. S212 + + н.о.

*н.о. - не определяли.

Для штаммов Rhodococcus sp. Bl06a и Gl2a уровень сходства амплифицированных участков ДИК с генами bphA1 бактерий Rhodococcus sp. HA99 (AB272986), R04 (DQ403247), R. erythropolis TA421 (AB272985), R. rhodochrous K37

(AB272984), существенно отличающихся от известных генов, кодирующих а-субъединицы подсемейства Б/Т ДО, составил 99.9 и 100%, соответственно. Таким образом, подобранные праймеры позволяют получить информацию о генах, кодирующих а-субъединицы БДО различных подсемейств, в отличие от использованных ранее праймеров [Witzig et al., 2006].

Заключение

При амплификации короткого фрагмента гена bphA1 (450-500 п.н.), соответствующего кластеру Риске БДО, ПЦР-продукт в достаточной концентрации без примеси неспецифического продукта реакции был получен с праймерами BphA1F450/BphA1R900.

Показано, что с праймерами BphA1F462/BPHD-г1 (ограничивающих более протяженный участок bphA1, включая кластер Риске и активный центр) успешно идет амплификация bphA1 генов псевдомонад и генов, сходных с bphA1 генами бактерий

Rhodococcus sp. HA99 (AB272986) и R04 (DQ403247), существенно отличающихся от известных генов, кодирующих a-субъединицы подсемейства Б/Т ДО.

C праймерами BphAlF450/BPHD-rl успешно амплифицируются все перечисленные группы генов, включая bphA1 гены подсемейства Б/Т ДО. Праймеры обладают более широкой специфичностью по отношению к генам bphA1, кодирующим a-субъединицам разных подсемейств.

Таким образом, праймеры BphAlF450/BPHD-rl оптимальны для скрининга широкого спектра bphA1 генов, кодирующих a-субъединицы различных подсемейств.

Работа выполнена при поддержке Президиума PAH (Программа «Молекулярная и клеточная биология», УрО PAH, номер ГР проекта 01201256872) и гранта РФФИ-Урал № 13-04-96049 р_урал_а (номер ГР 01201365699).

Библиографический список

Егорова Д.О. и др. Разложение хлорированных бифенилов и продуктов их биоконверсии штаммом Rhodococcus sp. В7а // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46, № 6. С. 644650.

Егорова Д.О. и др. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № 3. С. 267-278. Плотникова Е.Г. и др. Особенности разложения 4-хлорбифенила и 4-хлорбензойной кислоты штаммом Rhodococcus ruber P25 // Микробиология. 2012. Т. 81, № 2. С. 159-170.

Шумкова Е.С. и др. Молекулярно-биологическая характеристика бактерий-деструкторов бифенила и идентификация генов а- субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы // Микробиология. 2014. № 1.

Шумкова Е.С., Плотникова Е.Г. Олионуклеотид-ные праймеры для детекции генов, кодирующих большую субъединицу бифенил 2,3-диок-сигеназы, бактерий порядка Actinomycetales // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2012. Вып. 1. С. 34-40.

Ausbel F.M. et al. Short protocols in molecular biology. Third edition. N.Y.: John Wiley and Sons, 1995. 450 p.

Gibson D.T., Parales R.E. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. Vol. 11. P. 236243.

Iwai S. et al. Gene-targeted-metagenomics reveals extensive diversity of aromatic dioxygenase genes in the environment // ISME J. 2010. Vol. 4, № 2. P. 279-285.

Pieper D.H. Aerobic degradation of polychlorinated biphenyls // Appl. Microbiol. Biotech. 2005. Vol. 67. P. 170-191.

Ross G. The public health implications of polychlorinated biphenyls (PCBs) in the environment // Rev. Ecotox. Environ. Safety. 2004. Vol. 59. P. 275-291.

Witzig R. et al. Assessment of toluene/biphenyl dioxygenase gene diversity in benzene-polluted soils: links between benzene biodegradation and genes similar to those encoding isopropylbenzene dioxygenases // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, № 5. P. 3504-3514.

Поступила в редакцию 16.10.2013

Testing of primers designed for biphenyl 2,3-dioxygenase a-subunit genes detection in bacteria isolated from contaminated soil

E. S. Shumkova, candidate of biology, research scientist

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Golev str, 13; ekaterinash80@mail.ru Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 119991, Moscow, Vavilov str, 32 E. G. Plotnikova, doctor of biology, professor, leading scientist

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Golev str., 13; peg@iegm.ru; (342)2808431 Perm State University, 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990

The experiments to test PCR-primer set designed for screening bphA1 genes (encoding the а-subunit of biphenyl 2,3-dioxygenase) with DNA template of Gram-positive and Gram-negative bacteria-destructors of biphenyl were done. The bphA1 gene region, corresponding to cluster Riske of biphenyl 2,3-dioxygenase was amplified. To amplify extended region of the bphA1 gene, comprising fragments encoding the cluster Riske and the enzyme active site, forvard primers were used in combination with the proposed by S. Iwai et al. (2010) reverse primer. Some of tested bacteria had bphA1 gene similar to this one of Rhodococcus sp. strian HA99 (AB272986) and strain R04 (DQ403247), were significantly different from the bphA1 genes, encoding the а-subunit of biphenyl/toluene dioxygenases subfamily. We defined the primers pair, optimal for screening of bphA1 genes, encoding of biphenyl 2,3 dioxygenase а-subunits, relating to different subfamilies.

Key words: polychlorinated biphenyl (PCB); а-subunit of biphenyl 2,3-dioxygenase; bacteria; Rhodococcus; Pseudomonas; degenerate PCR-primers; PCR-primers testing; bphA1 genes.

Шумкова Екатерина Сергеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН

Плотникова Елена Генриховна, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник

ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»