CC BY
153
УДК [577.112.6:616.72-018.3-008-085]:57.084.1 Зупанец И.А., Зимин С.М.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОРИГИНАЛЬНОГО КОМБИНИРОВАННОГО ХОНДРОПРОТЕКТОРА НА МОДЕЛИ СИСТЕМНОГО СТЕРОИДНОГО АРТРОЗА У КРЫС
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков
Остеоартроз (ОА) является самой частой суставной патологией среди ревматических заболеваний, а также одной из основных причин преждевременной потери трудоспособности и инвалидности, особенно в старших возрастных группах. Актуальным является поиск новых эффективных препаратов-хондропротекторов для лечения ОА, в том числе содержащих комбинацию хондроитин сульфата и глюкозамина. В настоящем исследовании на модели системного стероидного артроза (ССА) у крыс проведено изучение хондропротекторной активности Хондролайф крем-геля, содержащего глюкозамина гидрохлорид, хондроитина сульфат, камфору, ментол и вспомогательные вещества. Моделирование ССА проводили путем трехкратного внутримышечного введения в мышцу бедра дексаметазона в разовой дозе 7 мг/кг с интервалом в 1 неделю. Хондролайф крем-гель и референт-препарат Хондроксид наносили ежедневно наружно путем накожных аппликаций в области коленных суставов на обоих лапах в эквивалентных количествах в условно-терапевтической дозе 50 мг на каждую, начиная с 28-го дня эксперимента и на протяжении 4-х недель. Исследование ультраструктуры суставного хряща крыс проводили с помощью стандартных методов электронной микроскопии. Производили морфометрические измерения - определяли толщину хряща (измеряли в 3-х точках и выражали в условных единицах), подсчитывали плотность расположения хондроцитов на условной единице площади. У животных с экспериментальным артрозом при нанесении на суставы препарата Хондролайф отмечено восстановление толщины суставного хряща до интактных величин, а также уменьшение (до 30%) количества микропрепаратов с отклонениями от нормы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что препарат Хондролайф проявляет позитивное воздействие на течение экспериментального артроза у крыс и обладает хондропротекторными свойствами - снижает интенсивность деструктивных процессов в тканях коленных суставов животных с ОА и повышает регенераторные возможности суставного хряща.
Ключевые слова: остеоартроз, хондропротекторы, хондроитина сульфат, глюкозамин.
Одной из наиболее распространенных жалоб пациентов являются боли в суставах, которые в большинстве случаев связывают с наличием дегенеративно-дистрофических заболеваний периферических суставов и позвоночника, в том числе остеоартроза (ОА). ОА является самой частой суставной патологией среди ревматических заболеваний - до 60%, а распространенность в общей популяции составляет 15-20% [1]. Социальная значимость ОА определяется также резким снижением качества жизни у пациентов: резкое снижение двигательной активности приводит к социальной дезадаптации, потере трудоспособности, а в запущенных случаях и способности к самообслуживанию, особенно в старших возрастных группах [2]. Кроме того, ОА является одной из основных причин преждевременной потери трудоспособности и инвалидности, уступая в этом только ишемической болезни сердца [3].
В основе развития ОА лежит взаимодействие множества факторов, в том числе дегенеративные изменения суставных структур, обусловленные возрастом, генетическая предрасположенность, чрезмерная механическая нагрузка на суставы, метаболические нарушения, воспаление и т.д. [4]. При этом нормальный метаболизм хрящевой ткани изменяется с превалированием катаболических процессов над анаболическими [5,6]. Согласно классификации Американской ассоциации ревматологов и Европейской антиревматической лиги [7,8], средства для лечения остеоартроза подразделяются на симптом-модифицирующие и структурно-модифицирующие - в зависимости от степени их влияния на прогрессирование заболевания. К симптоматическим препаратам медленного действия с возможной структурно-модифицирующей активностью (Symptomatic slow acting drugs for osteoarthritis - SYSADOA) сегодня относят: глюкозамин (ГА) и хондроитин сульфат (ХС), диацерин, препараты гиалуроновой кислоты для внутрисуставных инъекций и экстракты авокадо и сои, которые включены в рекомендации EULAR и OARSI по лечению ОА [9].
Анализ результатов клинических исследований, проведенных с препаратами ХС и ГА, показал, что характерными для них являются противовоспалительный эффект, сравнимый с нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) и позволяющий снизить дозу последних, возможность сочетания с парацетамолом и НПВП, длительное сохранение лечебного эффекта, высокая безопасность и отсутствие серьезных побочных эффектов. При этом они способствуют замедлению прогрессирования ОА (по данным рентгенологических исследований). Механизм лечебного действия ХС и ГА при ОА связан с их способностью подавлять катаболические (дегенеративные) и активировать анаболические (восстановительные) процессы в хрящевой ткани, оказывать собственное противовоспалительное и обезболивающее действие
[10,11]. Также установлено, что ХС и ГА оказывают не совсем идентичное фармакологическое действие: они дополняют и усиливают эффекты друг друга, что определяет перспективность их совместного применения в лечении ОА [12]. Таким образом, актуальным является поиск новых эффективных препаратов для лечения Оа, содержащих комбинацию ХС и ГА. Наше внимание привлек оригинальный препарат Хондролайф крем-гель - крем для наружного применения, имеющий следующий состав (г/100 г): действующие вещества - глюкозамина гидрохлорид 5,0 г, хондроитина сульфат 5,0 г, камфора 3,2 г, ментол 0,5 г; вспомогательные вещества: крем-гелевая основа до 100 г. Целью настоящего исследования явилось изучение хондропротекторной активности Хондролайф крем-гель на модели системного стероидного артроза (СсА) у крыс. В качестве препарата сравнения был использован препарат Хондроксид гель 5% в тубах по 30 г производства ОАО „Нижфарм" (Россия), содержащий в 100 г хондроитина сульфата 5,0 г.
Материалы и методы
Исследование хондропротекторной активности препарата Хондролайф крем-гель проведено на 50 белых нелинейных крысах-самцах в возрасте 4-5 месяцев, массой 250-300 г. Моделирование ССА проводили путем трехкратного внутримышечного введения в мышцу бедра дексаметазона в разовой дозе 7 мг/кг с интервалом в 1 неделю. Все животные были распределены на 4 опытные группы по 10 животных в каждой следующим образом: 1 группа - интактный контроль; 2 группа -контрольная патология; 3 группа - крысы с артрозом, получающие препарат Хондролайф крем-гель в условно-терапевтической дозе 50 мг; 4 группа - крысы с артрозом, получающие препарат Хондроксид гель 5% в эквивалентной дозе 50 мг (ежедневно наружно путем накожных аппликаций в области коленных суставов на обоих лапах в эквивалентных количествах - по 50 мг на каждую, начиная с 28-го дня эксперимента и на протяжении 4-х недель). В ходе нанесения препарата проводили тщательное втирание его в кожные покровы крыс, при этом не допускали слизывания или стирания его самими животными. После завершения нанесения исследуемых препаратов (на 56-е сутки эксперимента) все животные подвергались декапитации под эфирным наркозом с целью получения биологического материала для проведения биохимических и морфологических исследований. Исследование ультраструктуры суставного хряща крыс проводили с помощью стандартных методов электронной микроскопии. Микроскопическое исследование проводили под микроскопом БИМАМ Р-12 (ПО «ЛОМО», Россия) с системой цифрового вывода изображений микропрепаратов Olympus-BX-41 (Япония). Для объективизации полученных данных производили морфометрические измерения. С помощью окуляр-микрометра на микропрепаратах определяли толщину хряща, которая измерялась в 3-х точках - центральная часть головки, верхний и нижний край. Толщину суставного хряща выражали в условных единицах. Также подсчитывали плотность расположения хондроцитов на условной единице площади. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрических методов анализа (Mann-Whitney U Test) с помощью компьютерных программ Statists 6.0 и StatPlus 2009 и представляли в виде сравнительных таблиц с результатами разных групп.
Помимо этого, проводили полуколичественную оценку состояния основных структур сустава в соответствии с методическими рекомендациями [13]. Представленные в рекомендациях нарушения структурных компонентов сустава выраженные в баллах суммировались (А+Б+В+Г+Д) для подсчета среднего балла. Выраженные в баллах изменения в суставе распределялись следующим образом:
- 23-25 баллов - состояние сустава оценивается как норма;
- 19-22 балла - слабо выраженные нарушения в структуре хряща и капсуле сустава;
- 14-18 баллов - умеренно выраженные изменения в структуре хряща и капсуле сустава;
- 8-13 баллов - выраженные нарушения структуры хряща и капсулы сустава;
- 0-7 баллов - тяжелые нарушения, вплоть до разрушения суставного покрытия, деструкции субхондральной кости, фибротизации и склерозирования капсулы сустава.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что у всех животных после троекратного введения дексаметазона возникали клинические и морфометрические признаки поражения опорно-двигательной системы. При микроскопическом исследовании коленного сустава интактных крыс наблюдается картина, соответствующая современным представлениям о морфологическом строении суставов и хрящевой ткани. Средняя толщина суставного хряща интактных крыс составляет 15,33 усл.ед., плотность расположения клеток в нем равняется 42,40 экз. на усл.ед. площади (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические показатели суставного хряща крыс под воздействием препарата Хондролайф на 56 сутки эксперимента
Условия опыта Толщина хряща, усл. ед. Клеточная плотность на усл.ед. площади Сумма баллов по системе оценки состояния хряща % наблюдений с патологическими изменениями
Интактный контроль 15,33±1,15 42,40±5,64 24,5±0,2 0
Контрольная патология 13,59±0,57 21,90±1,25* 12,7±0,8* 100,0
Хондролайф 16,00±0,62** 30,46±1,41*/** 21,5±1,2*/**/* 30,0
Хондроксид 13,66±0,59 27,30±1,29*/** 17,3±1,0*/** 50,0
Примечания: 1) * - р<0,05 относительно интактных животных;
2) ** - р<0,05 относительно группы контрольной патологии;
3)' - р<0,05 относительно животных, получавших Хондроксид.
Сама кость имеет типичное для губчатой кости строение (рис. 1). В ячейках переплетенных трабекул содержится активный полиморфноклеточный костный мозг. Синовиальные оболочки ареолярного типа выступают в суставную полость в виде клинообразных складок. Синовиоциты группируются довольно близко друг к другу, на некоторых участках лежат в 3-4 ряда. Субсиновиальная ткань достаточно бедна клетками, в ней преобладают соединительнотканные волокна. Встречается и другой тип синовиального слоя - жировой, который покрывает внутрисуставные жировые подушки. При этом ее поверхностные клетки расположены в один слой.
Яр"
I
Рис. 1. Морфоструктура коленного сустава интактной крысы. Гиалиновый хрящ суставной поверхности.
Цитоархитектоника в состоянии нормы. Отчетливо видна зональность расположения хрящевых клеток.
Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При гистологическом исследовании коленных суставов крыс групп контрольной патологии, проведенном на 56 день эксперимента, обнаруживались признаки патологии, характеризующейся развитием гиперпластических, воспалительных и деструктивно-дистрофических процессов, что соответствует общим представлениям о патоморфологических особенностях развития остеоартроза (рис. 2).
Рис. 2. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА. Нарушение зонального строения хряща, гнездная резорбция
ткани (стрелка). Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При этом отмечалось поражение не только хрящевой ткани, но и ранние тканевые изменения синовиальных оболочек, в которых преобладали циркуляторные нарушения - появление в субсиновиальном слое многочисленных новообразованных сосудов, часто расширенных, кровенаполненных, содержащих в просвете значительное количество лейкоцитов, а также клеточная пролиферация, с преобладанием в инфильтрате гистиоцитов и фибробластов разной степени зрелости. У всех животных контрольной группы отмечается деструктивно-дистрофическое поражение суставного хряща. Обращает на себя внимание стертость зональной структуры хрящевой ткани: разделение на слои отсутствует, хондроциты расположены беспорядочно. Плотность расположения хондроцитов снижена по сравнению с интактными показателями (21,9 экземпляров на усл. ед. площади при 42,4 в интактном контроле). Результатом снижения плотности, а, следовательно, и синтетической активности хондроцитов, являются дегенеративные изменения межклеточного вещества: окраска основного вещества неравномерная, матрикс разволокнен, встречается гнездная резорбция хрящевой ткани (рис. 2). Суставная поверхность
теряет четкость границ, часто неровная, изъеденная, на многих участках имеет разной глубины узуры. В некоторых наблюдениях обнаружены признаки формирования паннуса, когда гиперплазированная синовиальная оболочка нарастает на суставную поверхность с боковых сторон. Результатом развития вышеописанных патологических процессов является снижение такого показателя как толщина хряща, которая составляет 88% от показателей интактных животных.
При изучении структуры суставного хряща крыс с ССА, которых лечили исследуемым препаратом Хондролайф, обнаруживалась морфологическая картина близкая к интактным животным при наличии незначительных патологических изменений Так, толщина суставного хряща недостоверно превышала уровень интактных животных и в среднем составляла 16,0 усл. ед., а показатель клеточной плотности достоверно превышал уровень контрольной патологии на 40% (30,46 против 21,90 экземпляров на усл. ед. площади).
При морфологическом исследовании обнаруженная гистологическая картина в целом коррелировала с полученными морфометрическими данными. У подавляющего большинства животных наблюдался суставной хрящ, имеющий ровную поверхность с нормальной цитоархитектоникой, в котором отмечались три нечетко очерченные зоны и неоднотипность клеточных элементов на разных уровнях структуры. Матрикс хряща выглядел слабоэозинофильным в поверхностной и базофильным в промежуточной и глубокой зонах (рис. 3). Синовиальные оболочки без патологических изменений, не гиперплазированы, по клеточному составу представлены синовиоцитами и фибробластами.
ч
Рис. 3. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА под воздействием препарата Хондролайф. Нормальная гистоструктура хряща. Цитоархитектоника в состоянии нормы. Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При гистологическом изучении суставов крыс с экспериментальным артрозом под воздействием референс-препарата Хондроксид наблюдалась картина ткани идентичная группе контрольной патологии, но при меньшей степени патологических проявлений (рис.4).
Рис. 4. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА под воздействием препарата Хондроксид. Многоклеточные изогенные группы, соседствующие с бесклеточными участками. Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
Так, показатель толщины суставного хряща находился на уровне группы контрольной патологии (13,66 против 13,59 усл. ед.), в то время как, показатель клеточной плотности достоверно увеличивался на 25% (27,3 против 21,9 экземпляров на усл. ед. площади). Так же наблюдалось уменьшение (до 50%) количества микропрепаратов с теми или иными отклонениями от нормы
(табл. 1). В части наблюдений отмечено появление кластеров, соседствующих с относительно бесклеточными участками (рис. 4), которые, видимо, не в состоянии полноценно синтезировать межклеточное вещество.
Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что в суставах крыс под воздействием дексаметазона возникают все морфологические маркеры ранних стадий деформирующего остеоартроза: снижение клеточной плотности; дистрофические изменения хондроцитов; многоклеточные изогенные группы, чередующиеся с опустошенными участками; неравномерная окраска матрикса; патологическая васкуляризация и оссификация хряща в местах, где имеются изменения; узурированность суставной поверхности; изменения в синовиальных оболочках; очаговый лизис костной и фиброз миелоидной ткани.
Выводы:
1. Накожное нанесение в лечебных целях исследуемого препарата Хондролайф существенно снижает выраженность патологических процессов в суставном хряще крыс с сСа - толщина суставного хряща восстанавливается до интактных величин, а также наблюдается уменьшение (до 30%) количества микропрепаратов, в которых обнаруживаются те или иные отклонения от нормы. Морфометрические данные коррелируют с особенностями морфологической структуры суставного хряща - поверхность хряща становится более ровной, без признаков разволокнения, состояние цитоархитектоники нормализуется, дистрофических изменений в хондроцитах при этом не наблюдается.
2. Применение комбинированного хондропротектора Хондролайф оказывает позитивное воздействие на течение экспериментального артроза у крыс, а именно приводит к нормализации морфоструктуры суставных тканей, с наличием слабо выраженных нарушений в структурах хряща и капсуле сустава.
Литература
1. Sellam, J. Osteoarthrosis: pathogenesis, clinical aspects and diagnosis [Text] / J. Sellam, G. Herrero-Beamont, F Berenbaum // Arthritis Rheum. - 2009. - Vol. 60 (2). - Р. 524-533.
2. Bekkers J.E. Diagnostic modalities for diseased articular cartilage - from defect to degeneration: a review [Text] / J.E. Bekkers, L. Creemers, W.J. Dhert [et al.]// Cartilage. - 2010. - Vol. 1. - Р. 157-164.
3. Van der Wall A.C. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study [Text] / A.C. Van der Wall // Neth Heart J. - 2014. - Vol. 22. - Р. 257-258.
4. Клинические рекомендации. Ревматология [Text] / Под ред. Е.Л. Насонова // М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. - С. 99-111.
5. Luger E.O. The challenge: understanding the molecular pathogenesis of osteoarthritis and developing innovative therapeutic concepts [Text] / E.O. Luger, A. Radbruch // Z Rheumatol. - 2014. - Vol. 73 (4). - Р. 310-314.
6. Lajeunesse D. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander [Text] / D. Lajeunesse, F. Massicotte, J.P. Pelletier [et al.] // Modern Rheumatology. - 2003. - Vol. 13. - Р. 7-14.
7. Badokin, V.V. Knee osteoarthrosis: Clinical presentation, diagnosis, treatment [Text] / V.V. Badokin // Modern Rheumatology. - 2013. - Vol. (3). - Р. 70-75.
8. Zhang W. EULAR evidence-based recommendations for the diagnosis of knee osteoarthritis [Text] / W. Zhang, M. Doherty, M.A. Bierma-Zeinstra [et al.] // Ann. Rheum. Dis. - 2010. - Vol. 69. - Р. 483-489.
9. Zhang W. OARSI recommendations for the Management of hip and knee osteoarthritis Part III: changes in evidence following systematic cumulative update of research published through January 2009 [Text] / W. Zhang, G. Nuki, R.W. Moskowitz [et al.] // Osteoarthr. Cartilage. -2010. - Vol. 18 (4). - Р. 476-499.
10. Bottegoni C. Oral chondroprotection with nutraceuticals made of chondroitin sulphate plus glucosamine sulphate in osteoarthritis [Text] / C. Bottegoni, R.A. Muzzarelli, F. Giovannini [et al.] // J. Carbohydr. Polym. - 2014. - Vol. 30. - Р. 126-138.
11. Hochberg M.C. Structure-modifying effects of chondroitin sulfate in knee osteoarthritis: an updated meta-analysis of randomized placebo-controlled trials of 2-year duration [Text] / M.C. Hochberg // Osteoarthritis Cartilage. - 2010. - Vol. 18. (Suppl 1.). - Р. 28-31.
12. Clegg D.O. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis [Text] / D.O. Clegg, D.J. Reda, C.L. Harris [et al.] // N. Engl. J. Med. - 2006. - Vol. 354. - Р. 795-808.
13. Методические рекомендации по экспериментальному исследованию и клиническому изучению противоартрозных (хондромодулирующих) лекарственных средств / [И.А. Зупанец, Н.А. Корж, Н.В. Дедух и др.] - К., 1999. - 56 с.
Реферат
ТЕРАПЕВТИЧНА ЕФЕКТИВН1СТЬ ОРИПНАЛЬНОГО КОМБ1НОВАНОГО ХОНДРОПРОТЕКТОРА НА МОДЕЛ1 СИСТЕМНОГО СТЕРО1ДНОГО АРТРОЗУ У ЩУР1В Зупанець 1.А., Зiмiн С.М.
Ключовi слова: остеоартроз, хондропротектори, хондроТтину сульфат, глюкозами.
Остеоартроз (ОА) е найчаспшою суглобовою патолопею серед ревматичних захворювань, а також одшею з основних причин передчасно'Т втрати працездатност та швалщносп, особливо в старших в1кових групах. Актуальним е пошук нових ефективних препарат1в - хондропротектор1в для л1кування ОА, у тому числ1 таких, що мютять комбшацш хондро'Ттин сульфату та глюкозамшу. У цьому дослщжены на модел1 системного стеро'Тдного артрозу (ССА) у щур1в проведено вивчення хондропротекторноТ активност Хондролайф крем-гелю, що мютить глюкозамшу гщрохлорид, хондроТтину сульфат, камфору, ментол та допом1жн1 речовини. Моделювання ССА проводили шляхом триразового внутр1шньом'язового введення в м'яз стегна дексаметазону в разовш доз1 7 мг/кг з штервалом в 1 тиждень. Хондролайф крем-гель i референт-препарат Хондроксид наносили щоденно зовшшньо шляхом нашмрних аплкацш в дтянц колшних суглобiв на обох лапах в ешвалентних ктькостях в умовно-терапевтичнш дозi 50 мг на кожну, починаючи з 28-го дня експерименту i протягом 4-х тижшв. Дослщження ультраструктури суглобового хряща щурiв проводили за допомогою стандартних методiв електронноТ мiкроскопiТ. Проводили вивчення морфометричних показниш - визначали товщину хряща (вимiрювали в 3-х точках i виражали в умовних одиницях), пщраховували щтьнють розташування хондроцитов на умовнш одиниц площк У тварин з експериментальним артрозом при нанесены на суглоби препарату Хондролайф
вщзначено вщновлення товщини суглобового хряща до штактних величин, а також зменшення (до 30%) кiлькостi мiкропрепаратiв з вщхиленнями вiд норми. Отриманi результати дозволяють зробити висновок про те, що препарат Хондролайф проявляв позитивний вплив на переб^ експериментального артрозу у щурiв i мае хондропротекторн властивостi - знижуе iнтенсивнiсть деструктивних процеав у тканинах колiнних суглобiв тварин з ОА i шдвищуе регенераторнi можливостi суглобового хряща.
