CC BY
16
Серия «Биология. Экология»
2012. Т. 5, № 4. С. 10-17 Онлайн-доступ к журналу: http ://isu. ru/izvestia
И З В Е С Т И Я
Иркутского государственного университета
УДК 574.5; 574.2; 574.24
Температурно-зависимые изменения показателей перекисного окисления липидов у эндемичных байкальских и палеарктических амфипод и гастропод
Д. В. Аксенов-Грибанов1,2,3, Ж. М. Шатилина2,3, Ю. А. Лубяга2,3,
1 2 3 12 12
К. П. Верещагина , Д. С. Бедулина ' , Н. С. Шахтанова ' , А. Н. Гурков ' ,
2 2 1,2,3
М. В. Протопопова , В. В. Павличенко , М. А. Тимофеев ' '
1 Иркутский государственный университет, Иркутск
2 НИИ биологии, Иркутский государственный университет, Иркутск
3 Байкальский исследовательский центр, Иркутск E-mail: denis. axengri@gmail. com
Аннотация. Целью работы являлась оценка влияния изменений температуры окружающей среды на уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) у эндемичных и палеарктических видов амфипод и гастропод. Проведено сравнение уровня диеновых конъюгатов (ДК), как первичных продуктов ПОЛ, у организмов в условиях постепенного изменения температуры среды. Показано, что в условиях повышения температуры среды происходило увеличение содержания ДК у исследованных амфипод Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf) и Gammarus lacustris Sars. У гастропод Maackia herderiana (Lind.) в условиях повышения температуры среды отмечали снижение, а у Teratobaikalia ciliata (Dyb.) - повышение уровня ДК. В условиях понижения температуры среды у обоих видов амфипод не отмечали изменений в уровне ДК, а у гастропод отмечали увеличение уровня ДК.
Ключевые слова: перекисное окисление липидов, диеновые конъюгаты, Байкал, эндемики, амфиподы, гас-троподы.
Введение
Изменение температуры среды является стрессовым для большинства организмов. Одним из важных механизмов защиты клеток при воздействии температуры является поддержание гомеостаза биологических мембран. Воздействие стрессовых факторов приводит к изменению состава и нарушению структуры ли-пидов и может способствовать развитию пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) [10; 11]. Первичными продуктами ПОЛ являются диеновые конъюгаты (ДК), являющиеся токсичными метаболитами, которые оказывают повреждающее действие на липопротеиды, белки и нуклеиновые кислоты [4]. Вторичными продуктами ПОЛ являются альдегиды и кетоны (малоновый диальдегид и др.). При взаимодействии диальдегидов со свободными группами мембранных соединений образуются наиболее токсичные конечные продукты ПОЛ - основания Шиффа, накопление которых дестабилизирует биологические мембраны, что приводит к деструкции клеток и тканей [12]. Таким образом, продукты ПОЛ являются общепринятыми
показателями степени стрессового воздействия на организм.
Наиболее подходящими для исследования функционально-биохимических особенностей стресс-адаптации являются организмы, которые миллионы лет эволюционировали в крайне стабильных условиях и не сталкивались с их резкими изменениями. Одним из природных очагов видообразования и стабильности является древнейшее (более 25 млн лет) пресноводное озеро Байкал. Фауна Байкала насчитывает 2 600 видов, 80 % из которых являются эндемиками [1; 2].
Целью настоящей работы являлась оценка влияния изменений температуры окружающей среды на уровень ПОЛ у эндемичных и пале-арктических видов амфипод и гастропод.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись представители двух доминантных групп оз. Байкал: амфиподы (Amphipoda, Cructacea) и гастропо-ды (Gastropoda, Mollusca). Указанные группы организмов составляют основу биоразнообра-
зия Байкала. В озере представлены 148 видов и 24 подвида гастропод (степень эндемизма 80 %) [6] и 272 вида и 76 подвидов амфипод (степень эндемизма 99 %) [8]. Известно, что амфиподы и гастроподы населяют все типы грунтов и все глубины озера.
В работе исследованы следующие виды амфипод: эндемичный байкальский Eulimnogam-marus verrucosus (Gerstf., 1858) и палеарктиче-ский Gammarus lacustris (Sars, 1863), представленный в ряде соров и бухт Байкала, а также байкальские эндемичные гастроподы Maackia (Eubaikalia) herderiana (Lind., 1909) и Teratobai-kalia (Trichiobaikalia) ciliata (Dyb., 1875) [1].
Эндемичные байкальские амфиподы и гастроподы в большинстве стенотермны и негативно переносят изменения температуры среды обитания [7; 9], поскольку характеризуются узким диапазоном толерантности по отношению к температуре как фактору среды. Пале-арктические же виды, напротив, являются
обычно эвритермными и характеризуются широкими диапазонами толерантности. Материалы, характеризующие отношение байкальских и палеарктических амфипод к температуре, представлены в работах М. А. Тимофеева [7; 9]. Согласно экспериментальным данным, для байкальских амфипод E. verrucosus летальное время 50 LT50 при температуре 25 оС составляло 2 ч, а LT100 - 10 ч, в то время, как для G. lacustris в условиях экспозиции при данной температуре LT50 не была отмечена и при достижении 48 ч [9]. Отношение байкальских гас-тропод к повышенной температуре, как к фактору среды, исследовано в меньшей степени. По нашим экспериментальным данным, для гастропод M. herderiana при 25 оС LT50 составляло 3 ч, а LT100 - 36 ч. Для T. ciliata показатели LT50 и LT100 составляли 30 и 48 ч соответственно (рис. 1). Таким образом, исследованные виды амфипод и гастропод различаются по экологическим характеристикам.
Рис. 1. Динамика гибели байкальских гастропод в условиях температурного стресса 25 °С (в %)
Байкальские амфиподы были собраны в литоральной зоне озера в районе пос. Листвянка с глубин 0-2 м с использованием гидробиологического сачка, гастроподы - с глубин 5-10 м с использованием снаряжения для глубоководных погружений. Палеарктические амфиподы и гастроподы были собраны в безымянном озере, расположенном на о. Юность в черте города Иркутска. Организмы содержались раздельно по видам в аэрируемых термостатах при температуре +6 °С в течение 3-4 суток до проведения экспериментов. До эксперимента животных кормили коммерческим кормом Тйга-шт (Германия). Высокая двигательная актив-
ность, активное питание и отсутствие гибели организмов в акклимационный период позволяют предположить, что содержание в лабораторных условиях не являлось для них стрессовым. Во всех экспериментах использовали здоровых и активных особей.
Были проведены два типа экспериментов: 1) экспозиция организмов в условиях постепенного повышения температуры с 6 °С (средняя температура среды обитания, температура акклимации) до температуры, при которой отмечали гибель 100 % особей (29-31 °С); 2) экспозиция организмов в условиях постепенного понижения температуры с 6 °С до 0,5 °С. Из-
менение температуры проводили в термостате WiseCircu Wcr6 (Германия) со скоростью 1 оС-ч-1. В условиях постепенного понижения температуры гибели амфипод и гастропод не наблюдали. Фиксацию материалов в жидком азоте проводили при экспозиции гидробионтов в условиях постепенного повышения температуры через каждые 2 оС (2 ч), а при экспозиции в условиях постепенного понижения температуры - через 1 °С (1 ч). Контрольные образцы фиксировали непосредственно перед экспериментом при температуре акклимации (6 °С).
Определение содержания ДК проводили согласно методике И. Д. Стальной с модификациями М. А. Тимофеева [9]. Содержание ДК пересчитывали на сырой вес организмов. Измерение содержания ДК проводили на спектрофотометре Cary 50 (Varian, США) при X = 232 нм. При расчёте содержания ДК использовали молярный коэффициент экстинции сопряжённых двойных связей 2,2-10-5-М-1-см-1.
Все эксперименты проведены в девяти биологических параллелях. Биохимический анализ каждой пробы проведён в трёх аналитических измерениях. Проверку нормальности распреде-
ления осуществляли при помощи критерия Шапиро - Уилка. Оценку достоверности проверяли, используя двувыборочный ¿-критерий Стьюдента. Статистический анализ проводили с использованием пакета Statistica 7.0. На диаграммах указаны доверительные интервалы. * - обозначены случаи достоверного отличия значений от контрольного при доверительной вероятности 0,95.
Результаты и обсуждение
Повышение температуры. Материалы по оценке изменения содержания ДК при экспозиции амфипод и гастропод в условиях постепенного повышения температуры представлены на рис. 2 и 3. Как следует из представленных материалов, у байкальского вида амфипод E. verrucosus было отмечено достоверное увеличение содержания ДК при повышении температуры экспозиции с 9 до 13 °С, после чего содержание ДК снижалось до контрольных значений и оставалось на этом уровне до конца эксперимента.
ш и ш о
Q.
и "2 о
60 -,
50
40
30 ■
20 -
10
Е. verrucosus
0 I I I I I I I I I I I I
6t 9t 114: 13t ist 17t 19t 21t 23t 25t 27t 29t
50
ra 40 -и
Q.
и
L.
"2 q
о
30
20 -
10 -
G. lacustris
6t 9t 11t 13t 1St 17t 19t 21t 23t 25t 27t 29t 31t
Рис. 2. Изменение содержания ДК у байкальских и палеарктических амфипод в условиях постепенного повышения температуры среды (нМоль/г с.в.)
ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ перекисного окисления липидов
13
Рис. 3. Изменение содержания ДК у байкальских гастропод в условиях повышения температуры среды (нМоль/г с.в.)
Усиление ПОЛ было отмечено и у палеарк-тического вида амфипод О. \acustris, у которого достоверное увеличение содержания ДК было зафиксировано при повышении температуры экспозиции с 21-27 °С. Для гастропод, подверженных влиянию повышения температуры среды, была характерна иная картина. Так, у гастропод вида М. квгёвпапа было отмечено достоверное снижение содержания ДК относительно контроля при повышении температуры экспозиции с 13 °С до 21 °С с последующим восстановлением уровня ДК до контрольных значений. У Т. ciliata, как и у обоих исследовавшихся видов амфипод, было показано достоверное увеличение уровня ДК относительно контроля, начинающееся с повышения температуры экспозиции выше 17 °С.
Понижение температуры. Материалы по оценке уровней ДК при экспозиции амфипод и гастропод в условиях понижения температуры среды представлены на рис. 4 и 5. Как следует
из представленных материалов, при экспозиции амфипод E. verrusosus и G. lacustris содержание ДК не отличалось от контрольного уровня в течение всего эксперимента.
У обоих видов гастропод при экспозиции в условиях понижения температуры среды наблюдали увеличение уровня ДК. При этом у М. herderiana данное повышение фиксировали при температуре экспозиции 5-2 °С, а у T. ciliata - при температуре экспозиции 5-4 °С.
Таким образом, в условиях повышения температуры среды у обоих видов амфипод было выявлено увеличение содержания ДК относительно контрольных значений. При этом степень и время начала изменения содержания ДК у видов различны. Так, у E. verrucosus увеличение содержания ДК отмечали уже в первые часы экспозиции, тогда как у палеарктического G. lacustris увеличение содержания ДК происходило на более поздних этапах эксперимента.
8 30
<11
ш
d
3
о 20
"2 ц
о
10
Е. verrucosus
40 -,
30
га и <и о d
о
J 20 -I о
10 -
G. lacustris
-ь-
6t 5"С 4°С 3°С 2°С те 0,5"С 6°С 5t те 3°С 2°С те 0,5°С
Рис. 4. Изменение содержания ДК у амфипод в условиях понижения температуры среды (нМоль/г с.в.)
30 л
20
<о и о m о. л о
л
с;
о ю ^
rfl
rih
fb
M. herderiana
*
m
6t St 4t 3t 2t 1t 0,5t
Я О
о о
л
о
L.
q
О
30
20
10
T. ciliata
rih
rb
6t 5t 4t 3t 2t 1t 0,5t
Рис. 5. Изменение содержания ДК у байкальских гастропод в условиях постепенного понижения температуры (нМоль/г с.в.)
Данные по периоду температурно-индуцированных изменений в процессах ПОЛ согласуются с известными характеристиками видов [9]. Нарастание уровня ПОЛ у термочувствительного вида E. verrucosus происходит раньше, чем у терморезистентного G. lacustris. Отсутствие изменений в уровне ПОЛ у представленных видов амфипод, экспонированных в условиях понижения температуры среды, вероятно, также связано с экологическими характеристиками видов, в частности, со способностью обоих видов к обитанию в низкотемпературном подлёдном слое [3; 5].
Реакции байкальских гастропод на изменения температуры среды различались своей направленностью. Вероятные причины данных различий связаны с разной степенью терморезистентности видов. Так, у более термочувствительного М. herderiana в условиях повышения температуры среды наблюдали снижение уровня ПОЛ уже около 13 °С. Вероятно, это отражает снижение общего метаболизма гас-тропод как первоначальную реакцию на темпе-
ратурный стресс. У более терморезистентного T. ciliata температурный стресс индуцировал изменение уровня ПОЛ только при температурах экспозиции выше 17° С. Повышение уровня ПОЛ при этом наблюдали до окончания эксперимента.
В нашем исследовании увеличение содержания продуктов ПОЛ отмечали у обоих видов исследуемых амфипод в условиях повышения, а у обоих видов исследуемых гастропод в условиях понижения температуры окружающей среды. Это свидетельствует о развитии окислительных процессов в клетках в результате генерации активных форм кислорода и свободных радикалов, что приводит к нарушению структурно-функционального состояния мембран [12; 13].
Заключение
Обсуждаемые результаты дают основание полагать, что у амфипод и гастропод имеются различия в характере метаболических реакций в ответ на температурные воздействия, что мо-
жет быть связано с экологическими характеристиками видов.
Исходя из литературных и вышеизложенных данных, можно констатировать, что постепенное изменение температуры среды ведёт к прогрессу процессов ПОЛ, что является свиде-
Авторский коллектив выражает благодарность водолазной группе ЛИН СО РАН за помощь в сборе глубоководных организмов, Т. Я. Ситниковой за помощь в определении гастропод.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке проектов РФФИ 11-04-00174-а, 10-04-00611, 11-04-91321-СИГ_а; CRDF 10-04092505-ИК_а, BRHE New Mini-grant Program; гранта ИГУ для поддержки аспирантов и молодых ученых 091-09-204; грантов Президента РФ МК-5466.2012.4, МД-2063.2012.4, МК-4772.2011.4; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»; DAAD-М. Ломоносов 2012-2013 (10.51.2011).
Литература
1. Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна / О. А. Тимошкин [и др.]. - Новосибирск : Наука, 2004. - 1679 с.
2. Байкаловедение : учеб. пособие / Н. С. Беркин [и др.]. - Иркутск : Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2009. -291 с.
3. Бекман М. Ю. Биология Gammarus lacustris Sars в прибайкальских озёрах / М. Ю. Бекман // Тр. Байкал. лимнол. станции АН СССР. - 1954. - Т. 14. -С. 268-311.
4. Бурлакова Е. Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е. Б. Бурлако-ва, Н. Г. Храпова // Успехи химии. - 1985. - Т. 54, вып. 9. - С. 1540-1558.
тельством развития мембранных повреждений как у байкальских, так и у палеарктических организмов. При этом различия в характере развития процессов ПОЛ могут быть обусловлены разными адаптивными способностями и экологическими характеристиками исследованных видов.
5. Лед - хранитель жизни / Н. А. Бондаренко [и др.] // Наука из первых рук. - Новосибирск, 2004. - № 1. - С. 76-83.
6. Ситникова Т. Я. Переднежаберные брюхоногие моллюски (Gastropoda: Prosobranchia) Байкала: морфология, таксономия, биология, формирование фауны : автореф. дис. д-ра биол. наук / Т. Я. Ситни-кова. - СПб. : ЗИН РАН, 2004. - 47 с.
7. Сравнительная оценка особенностей анаэробного метаболизма у байкальских амфипод Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.), E. cyaneus (Dyb.) и палеарктического Gammarus lacustris Sars / М. А. Тимофеев [и др.] // Сиб. экол. журн. - 2006. -№ 6. - С. 733-739
8. Тахтеев В. В. Очерки о бокоплавах озера Байкал (систематика, сравнительная экология, эволюция) / В. В. Тахтеев. - Иркутск : ИГУ, 2000. - 355 с.
9. Тимофеев М. А. Экологические и физиологические аспекты адаптации к абиотическим факторам среды эндемичных байкальских и палеарктиче-ских амфипод : дис. ... д-ра биол. наук : 03.02.08 / М. А. Тимофеев ; ТГУ. - Томск, 2010. - 384 с.
10. Хочачка П. Биохимическая адаптация / П. Хочачка, Дж. Сомеро. - М. : Мир, 1988. - 568 с.
11. Хочачка П. Стратегия биохимической адаптации / П. Хочачка, Дж. Сомеро. - М. : Мир, 1977. -398 с.
12. Crockett E. L. The cold but not hard fats in ec-totherms: consequences of lipid restructuring on susceptibility of biological membranes to peroxidation, a review / E. L. Crockett // J. Comp Physiol. - 2008. -Vol. 178. - P.795-809.
Temperature induced changes of lipid peroxidation processes in Baikal endemic and Palearctic amphipods and gastropods
D. V. Axenov-Gribanov 1,2,3 Zh. M. Shatilina 1,2,3 J. A. Lubyaga 1,2,3
K. P. Vereshagina 13, D. S. Bedulina 1,2,3 N. S. Shachtanova 1,2,3 A. N. Gurkov 1,2,3
M. V. Protopopova 13, V. V. Pavlichenko 13, M. A. Timofeyev 1,2,3
1 Irkutsk State University, Irkutsk
2 Research institute for Biology, Irkutsk State University, Irkutsk
3 Baikal Research Centre, Irkutsk
Abstract. The aim of present study was an evaluation of lipid peroxidation processes under temperature changes in Baikal endemic and Palearctic amphipods and gastropods species. It was compared diene conjugates level, as primary products of lipid peroxidation in organisms in conditions of gradual increase and decrease temperature. Elevation of diene conjugates level was showed under gradual temperature increase in both amphipods species: Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf), Gammarus lacustris Sars. Elevation of diene conjugates level under gradual temperature increase was showed for Teratobaikalia ciliata (Dyb.). In other gastropod species - Maackia herderiana (Lind.) was observed decrease of diene conjugates content. Under gradual temperature decrease, elevation of diene
conjugates level was increased in both mollusks species. Exposition of amphipods didn't lead to changes in lipid peroxidation.
Key words: lipid peroxidation, diene conjugates, Baikal, endemics, Amphipods, Gastropods.
Аксёнов-Грибанов Денис Викторович Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора,5 аспирант
тел. (395 2) 24-30-77 E-mail: denis. axengri@gmail. com
Axenov-Gribanov Denis Victorovich Irkutsk State University 5 Sukhe-Bator St., Irkutsk, 664003 doctoral student phone: (3952) 24-30-77 E-mail: denis. axengri@gmail. com
Шатилина Жанна Михайловна Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете 664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3 кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник тел. (3952) 24-30-77, факс (3952) 20-12-19 E-mail: [email protected]
Shatilina Zhanna Mikhailovna
Research Institute for Biology
Irkutsk State University
3 Lenin St., Irkutsk, 664003
Ph. D. in Biology, leading research scientist
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19 E-mail: [email protected]
Лубяга Юлия Андреевна
Научно-исследовательский институт биологии
при Иркутском государственном университете
664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3
младший научный сотрудник
тел. (3952) 24-30-77, факс (3952) 20-12-19
E-mail: yuliya. a. [email protected]
Lubyaga Julia Andreevna
Research Institute for Biology
Irkutsk State University
3 Lenin St., Irkutsk, 664003
junior research scientist
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19
E-mail: yuliya. a. [email protected]
Верещагина Ксения Петровна Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора,5 студент
тел. (395 2) 24-30-77
E-mail: [email protected]
Vereshagina Kseniya Petrovna Irkutsk State University 5 Sukhe-Bator St., Irkutsk, 664003 student
phone: (3952) 24-30-77 E-mail: [email protected]
Бедулина Дарья Сергеевна
Научно-исследовательский институт биологии при
Иркутском государственном университете
664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3
старший научный сотрудник
тел. (3952) 24-30-77, факс (3952) 20-12-19
E-mail: daria. [email protected]
Bedulina Darya Sergeevna
Research Institute for Biology
Irkutsk State University
3 Lenin St., Irkutsk, 664003
senior research scientist
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19
E-mail: [email protected]
Шахтанова Надежда Сергеевна Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора,5 студент
тел. (395 2) 24-30-77 E-mail: n. [email protected]
Shachtanova Nadezhda Sergeevna Irkutsk State University 5 Sukhe-Bator St., Irkutsk, 664003 student
phone: (3952) 24-30-77 E-mail: n. [email protected]
Гурков Антон Николаевич Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул.Сухэ-Батора,5 студент
тел. (395 2) 24-30-77 E-mail: [email protected]
Gurkov Anton Nicolaevich Irkutsk State University 5 Sukhe-Bator St., Irkutsk, 664003 student
phone: (3952) 24-30-77 E-mail: [email protected]
Протопопова Марина Владимировна
Научно-исследовательский институт биологии при
Иркутском государственном университете
664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3
старший научный сотрудник
тел. (3952) 24-30-77, факс (3952) 20-12-19
E-mail: [email protected]
Павличенко Василий Валерьевич Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете 664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3 научный сотрудник
тел. (3952) 24-30-77, факс (3952) 20-12-19 E-mail: [email protected]
Тимофеев Максим Анатольевич Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете 664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3 доктор биологических наук, зав. лабораторией тел. (395 2) 24-30-77, факс (395 2) 20-12-19 E-mail: [email protected]
Protopopova Marina Vladimirovna
Research Institute for Biology
Irkutsk State University
3 Lenin St., Irkutsk, 664003
senior research scientist
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19
E-mail: [email protected]
Pavlichenko Vasiliy Valerievich Research Institute for Biology Irkutsk State University 3 Lenin St., Irkutsk, 664003 research scientist
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19 E-mail: [email protected]
Timoveyev Maxim Anatolyevich
Research Institute for Biology
Irkutsk State University
3 Lenin St., Irkutsk, 664003
D. Sc. of Biology, Head of laboratory
phone: (3952) 24-30-77, fax (3952) 20-12-19
E-mail: [email protected]
