CC BY
52
УДК 612.822.1.0.15.1
ТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ КАТЕПСИНА Д ИЗ МОЗГА СУСЛИКА CITELLUS PIGMAEUS PALL. В ДИНАМИКЕ ЗИМНЕЙ СПЯЧКИ
© 2004 г. З. Т. Магомедова, П.М. Нурмагомедов., И.С. Мейланов
The temperature dependence of cathepsin D activity in soluble and lysosomal-mithochondrial fractions of suslic’s brain in the course of hibernation was studied.
Зимняя спячка (ЗС) мелких грызунов представляет собой адаптацию к нехватке пищи и низким температурам окружающей среды в зимний период года [1]. Температура тела в этот период существенно снижена и в некоторых случаях может достигать 1-2 °С [1]. При этом физиологическая активность и потребление кислорода в организме животного существенно (до 100-200 раз) снижены. Однако глубокая ЗС сусликов - не непрерывный процесс. Периодически (через каждые 10-15 дней) животные пробуждаются: температура тела за несколько часов повышается до 37-38 °С, они могут активно двигаться, уровень метаболизма повышается и может превышать уровень бодрствующих животных. Это состояние длится примерно 20 ч, после чего температура тела снова понижается и животное погружается в глубокую спячку. Следует отметить, что суслики во время периодических пробуждений не питаются и не выделяют продуктов метаболизма. Многие годы биологическое значение периодических пробуждений было загадкой для исследователей [2]. Однако в последнее время появились надежды на разрешение этого вопроса. Выяснилось, что значительную часть времени периодических пробуждений (примерно 70 %) в мозге суслика регистрируется электрическая активность, характерная для обычного сна [3]. Ли Каванау, анализируя механизмы памяти и сна у животных, предположил, что след памяти в мозге со временем угасает, и поэтому его нужно периодически восстанавливать (динамическая стабилизация) [4]. Динамическая стабилизация состоит в том, что по нейронным сетям мозга циркулируют нервные импульсы, а это в свою очередь приводит к увеличению силы синаптических контактов соответствующих нервных контуров. Во время баута глубокой спячки электрическая активность в мозге суслика практически отсутствует и сила синапсов постепенно угасает, следовательно, жизненно важная информация постепенно утрачивается. Поэтому животное должно периодически пробуждаться, восстанавливать работоспособное состояние памяти, и только после этого вновь погружаться в спячку. Эти теоретические построения подкрепляются и цитологическими данными. В [5] показано, что в течение баута глубокой спячки в гиппокампе мозга сусликов - структуре, играющей одну из важнейших ролей в механизмах памяти, резко сокращается число дендритных шипиков на дендритах пирамидных нейронов. Соответственно сокращается число синаптических контактов. Во вре-
мя периодических пробуждений в гиппокампе суслика идет интенсивный синаптогенез, растут дендритные шипики и образуются новые синапсы. Ясно, что этот морфогенез требует интенсификации биосинтетических процессов, в том числе и биосинтеза белка. Это в свою очередь требует повышения энергетического метаболизма, а значит, и окислительных процессов. Известно, что определенная доля кислорода, потребляемого клетками тканей, идет на образование супероксидного радикала, который инициирует дальнейшие свободно-радикальные процессы (СРП) [6]. Интенсификация СРП приводит к повышению окисления макромолекул и прежде всего белков. Большинство химических повреждений в белках не репа-рируется, а модифицированные молекулы направляются в лизосомы или протеасомы, где в конечном итоге распадаются на аминокислоты. Важную роль в лизосомальной деградации белков играет катепсин Д (КФ 3.4.23.5) (КД) - кислая протеиназа аспартатного типа. Значительная часть протеиназной активности в мозге приходится именно на КД [7]. В мозге КД локализован, главным образом, в нейронах. В глие его активность незначительна [7]. Следует отметить, что уровень аэробного энергетического обмена в нейронах намного (возможно, в 5-10 раз ) превосходит таковой в глие [8]. Связана ли преимущественная локализация КД в нейронах с высоким уровнем аэробного обмена в них, а следовательно, и с более высоким уровнем окисления белков, неизвестно, но имеются сведения о том, что среднее время жизни нейрональных белков меньше, чем глиальных [9], что само по себе предполагает более высокую протеазную активность.
Из вышесказанного следует, что в динамике ЗС в мозге суслика периоды биосинтетического молчания сменяются интенсивным биосинтезом макромолекул, который должен сопровождаться и их соответствующим распадом. В связи с этим представляется весьма актуальным исследовать изменения активности КД в мозге суслика в ходе зимней спячки. Эти изменения должны отражать процессы регуляции биохимических процессов в мозге при переходе от глубокого покоя к интенсивной физиологической и биосинтетической активности.
В настоящей работе исследованы температурные зависимости активности КД в водорастворимой и лизосомально-митохондриальной фракциях мозга сусликов в динамике ЗС. Температурные зависимости
активности ферментов отражают структурные особенности самих молекул ферментов, и поэтому содержат важную информацию об изменениях структуры макромолекул и их взаимодействии с другими молекулами.
Экспериментальная часть
Животные. Опыты проведены на малом кавказском суслике Citellus pigmaeus Pall. Животных отловили в весенне-летний период (май-июнь) в Прикаспийских степях и содержали в индивидуальных клетках в условиях вивария. Рацион: пшеница, подсолнечник, капуста, зеленые корма.
Животных брали для исследования при следующих состояниях: 1. Бодрствующие животные перед залеганием в спячку (ноябрь, температура тела, Тт = =37-38 °С). 2. Животные в состоянии ЗС (декабрь, Тт= = 5-6 °С). 3. Перед первым баутом пробуждения (декабрь, Тт = 10-11 °С). 4. Перед выходом из спячки (апрель, Тт = 10-11 °С). 5. Выход из спячки (апрель, Тт = = 30-31 °С).
Зимняя спячка. Для поддержания состояния ЗС животных в начале октября помещали в специальные клетки (по одному в клетке), которые находились в затемненном и неотапливаемом помещении, температура в котором в течение периода октябрь - апрель изменялась в пределах 5 - 10 °С.
Приготовление гомогената и выделение фракций тканей мозга. Животных, находящихся в соответствующем состоянии, декапитировали, извлекали мозг, промывали ледяным физраствором. Мозг после отделения мозжечка и продолговатого мозга гомогенизировали в 0,32 М сахарозе (1:9 вес/объем) на холоде в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Супернатант центрифугировали при 20-103g в течение 30 мин. Супернатант-2 представляет собой водорастворимую фракцию (S) мозга, а осадок (Р) содержит митохондрии, лизосомы и фрагменты мембран различных структур.
Определение активности катепсина Д. Активность КД измеряли по методу Ансона с некоторыми изменениями [10] по скорости расщепления гемоглобина, используемого в качестве субстрата. Состав инкубационной среды: к 0,5 мл фракции добавляли 1 мл 2 % раствора гемоглобина в мединал-ацетатном буфере рН 3,8. Пробы инкубировали в течение 60 мин. Затем реакцию останавливали добавлением к пробе 2 мл 0,2 М трихлоруксусной кислоты. Через 30 мин пробы центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. В супернатанте определяли содержание свободного тирозина. Активность фермента выражали в мкг тирозина на мг белка фракции за 60 мин.
Определение белка. Белок во фракциях определяли по методу Лоури.
Исследование температурной зависимости активности катепсина Д. Для изучения температурной зависимости пробы инкубировали при 5, 10, 15, 20 и 37 °С. Время инкубации во всех случаях - 60
мин. Полученные результаты представлены в арре-ниусовских координатах lgV - 1/T, где V - скорость реакции, T - температура инкубации. Для водорастворимой фракции температурная зависимость имеет линейные участки, что позволяет охарактеризовать соответствующий температурный диапазон эффективной энергией активации.
Статистическая обработка. В каждой серии опытов было использовано 4 - 6 животных. Вычисляли среднее арифметическое и ошибку средней. Достоверность различий средних проверяли с помощью критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
На рис.1 представлены аррениусовские графики температурной зависимости активности КД в водорастворимой фракции мозга сусликов, соответствующей различным физиологическим состояниям животного. Температурная зависимость активности КД в водорастворимой фракции перед впадением в зимнюю спячку имеет линейный участок в температурном диапазоне 37-10 °С. Соответствующая эффективная энергия активации составляет 17,4 кДж/моль. При температуре инкубации 5 °С активность фермента практичнски равна нулю. Важно подчеркнуть, что температура тела суслика в бауте глубокой спячки составляет (в наших опытах) 5-6 °С. Это означает, что активность фермента в бауте глубокой спячки была бы практически равна нулю и in vivo, если бы впадение в спячку не сопровождалось изменениями в температурной зависимости активности фермента. Кривая 2 соответствует температурной зависимости активности фермента в состоянии глубокой спячки (Тт = 5-6 °С). Видно, что произошли существенные изменения активности фермента. В диапазоне температур 37-10 °С эффективная энергия активации составляет 1,9 кДж/моль, что значительно меньше, чем перед впадением в спячку. При температуре инкубации 5 °С вновь происходит резкое уменьшение скорости реакции. Однако в целом активность фермента в этом физиологическом состоянии значительно выше по сравнению с предыдущим в особенности при низких температурах инкубации, и при 5 °С она уже не равна нулю.
Кривая 3 соответствует температурной зависимости активности фермента в процессе выхода из баута глубокой спячки, когда температура тела повышается (Тт= 10-11т °С). Видно, что происходит драматическое снижение активности фермента в диапазоне температур 37-10 °С. При этом эффективная энергия активации составляет 5,8 кДж/моль. И вновь при температуре инкубации 5 °С происходит изменение активности фермента - она резко возрастает и практически равна таковой при бауте глубокой спячки. Таким образом, в диапазоне температур 10-5 °С появляется отрицательная температурная зависимость (ОТЗ).
1
0.2
3,22 3,41 3,47 3,53 3,59 3,70
1000Т
Рис.1.Температурная зависимость активности КД в водорастворимой фракции больших полушарий мозга сусликов в динамике ЗС: 1 - подготовительный период Тт = 37-38 °С
(ноябрь); 2 - I баут глубокой спячки Тт = 5-6 °С (декабрь);
3 - I баут спячки перед пробуждением Тт = 10-11 °С (де-
кабрь); 4 - перед выходом из спячки Тт = 10-11 °С (апрель);
5 - выход из спячки Тт = 30-31 °С (апрель)
Перед окончательным выходом из спячки, но при низкой температуре тела (10-11 °С, кривая 4) происходит существенное изменение температурной зависимости активности фермента. Эффективная энергия активации резко увеличивается до 38 кДж/моль в диапазоне 37-20 °С. При этом сохраняется ОТЗ в диапазоне 10-5 °С.
Кривая 5 соответствует температурной зависимости активности фермента при выходе из спячки, когда температура тела достигла 30-31 °С. Активность
фермента в целом резко возрастает. При этом температурная зависимость активности фермента становится примерно такой же, как и перед впадением в спячку и в ее начале.
Таким образом, активность фермента в водорастворимой фракции мозга суслика в динамике ЗС претерпевает закономерное и сложное изменение. Обращает на себя внимание тот факт, что в диапазоне температур 37 - 10 °С температурная зависимость активности фермента незначительна, что проявляется в низких значениях эффективной энергии активации в этом диапазоне. Однако при температуре инкубации ниже 10 °С во всех случаях наблюдается резкое изменение активности фермента. Причем в трех состояниях: перед впадением в спячку, после выхода из нее (температура тела в этих состояниях составляет 3138 °С), первый баут глубокой спячки (температура тела 5-6 °С) - при уменьшении температуры ниже
10 °С, активность фермента резко снижается. А в двух других состояниях: перед выходом из первого баута глубокой спячки и перед полным пробуждением -активность фермента при температуре 5 °С, наоборот, резко повышается, т.е. наблюдается ОТЗ, что является одним из признаков температурной компенсации, характерной для пойкилотермии [11]. Как уже отме-
чалось выше, между баутами глубокой спячки во время периодических пробуждений в мозге суслика идет интенсивный синтез белков, в то время как в течение баута глубокой спячки синтез белка практически полностью подавлен [12]. И подавление, и инициация биосинтеза белка происходят не только за счет изменений температуры тела, но и в результате действия специальных регуляторных механизмов. Так, в [13] показано, что у золотых хомячков в состоянии глубокого оцепенения инициация синтеза белка прекращается при снижении температуры тела уже до 18 °С. При повышении температуры тела в процессе выхода из этого состояния инициация биосинтеза белка начинается при температурах тела даже ниже 18 °С. Надо полагать, что процесс деградации белков также регулируется в динамике спячки не только за счет температурного фактора. Сложные изменения температурной зависимости активности КД в динамике ЗС согласуются с таким предположением. Например, в состояниях 3 и 4 (рис.1) температура тела низкая, но предстоит ее повышение в связи с выходом из баута глубокой спячки и окончательным пробуждением.
На рис.2 показаны температурные зависмости активности КД в лизосомально-митохондриальной фракции мозга сусликов в динамике ЗС. Кривая 1 соответствует состоянию животного перед впадением в спячку (Тт = 37 °С). Эта зависимость имеет сложный характер. Особенностью здесь является ОТЗ в диапазоне 10-5 °С.
1*00 т
-^1 --2 -*-3 -*-4 —-5
Рис. 2. Температурная зависимость активности КД в лизосомально-митохондриальной фракции больших полушарий мозга сусликов в динамике ЗС (обозначения такие же, как на рис.1)
В состоянии глубокой спячки (Тт = 5-6 °С) активность фермента в целом возрастает. При этом происходит существенное изменение температурной зависимости: низкотемпературный минимум смещается в область высоких температур, а максимум теперь приходится на 10 °С. Перед выходом из первого баута глубокой спячки (Тт = 10 -11 °С) активность фермента в области высоких температур инкубации резко снижается, а в области низких температур близка к тако-
вой перед впадением в спячку. Перед окончательным выходом из спячки активность фермента продолжает снижаться по всему температурному диапазону. Наконец, после пробуждения (Тт = 30-31 °С) активность КД начинает восстанавливаться, не достигая при этом уровня перед впадением в спячку.
Из приведенных данных видно, что удельная активность КД в водорастворимой фракции примерно в 5 раз меньше, чем в лизосомально-митохондриальной. Это соответствует литературным данным о преимущественно лизосо-мальной локализации КД. При гомогенизации ткани часть лизосом разрушается и некоторое количество фермента переходит в водорастворимую фракцию. Если в динамике ЗС механическая прочность и/или осмотическая устойчивость мембран лизосом изменяются, то и доля КД, переходящая при гомогенизации в водорастворимую фракцию, тоже должна изменяться. При прочих равных условиях переход части фермента из лизосом в надосадочную жидкость должен уменьшать активность фермента в лизо-сомально-митохондриальной фракции. Однако из полученных нами данных видно, что активности КД при высокой температуре инкубации (37 °С) изменяются в обеих фракциях при переходе от одного физиологического состояния к другому симбатно. Таким образом, объяснить наблюдаемые изменения активности фермента во фракциях только простым его перераспределением невозможно.
Следует отметить, что изменения активности КД в низкотемпературной области (20 - 5 ° С) в динамике ЗС более сложные, чем в высокотемпературной области (37 - 20 °С). Это касается обеих фракций, но в лизосомально-митохондриальной фракции температурная зависимость в целом сложней, чем в водорастворимой. Возможно, что на скорость реакции мембраносвязанного фермента влияют термотропные структурные перестройки в лизосомальной мембране.
Обращает на себя внимание тот факт, что при подготовке к спячке и выходе из нее понижение температуры инкубации от 10 до 5 °С приводит к снижению активности КД. В состоянии глубокой спячки понижение температуры в этом диапазоне приводит к противоположному изменению - активность КД увеличивается. Резкое снижение активности ферментов при температурах инкубации меньших 15-10 °С - обычное явление у зимоспящих животных [14]. Объясняется оно необходимостью подавления метаболизма при ЗС. Увеличение активности КД в низкотемпературном диапазоне при ЗС указывает на необходимость деградации белков в мозге на определенных стадиях ЗС. Важно подчеркнуть, что температурная зависимость активности КД водорастворимой фракции в диапазоне 10 - 5 °С в
динамике ЗС изменяется кардинально - от положительной до отрицательной. Происходит как бы переключение работы фермента с одного режима на другой.
Обнаруженные нами изменения активности фермента в динамике ЗС ведут к постановке двух важных вопросов: 1) каков биологический смысл этих изменений? 2) каков механизм этих изменений? Ответ на первый вопрос требует выяснения роли КД в клетке. Наиболее распространенный взгляд на функцию КД в клетке состоит в том, что он является начальным звеном в цепи процессов, ведущих к распаду белков.
В то же время начинают накапливаться данные о внелизосомальных, более специфических функциях КД. В частности, высказывалась гипотеза, что КД может участвовать в ремоделинге синаптических контактов уже после завершения синаптогенеза [7 ]. Известно, что цитоскелет нейронов претерпевает переходы между статическим и динамическим режимами в процессе роста дендритов и их шипиков [15]. Поэтому можно предположить, что одной из функций КД может быть участие в процессах регуляции состояния цитоскелета при периодических пробуждениях.
Литература
1. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М.,1985.
2. Willis J.S. // Hibernation and torpor in mammals and birds. eds. Academic Press. 1982.
3. Strijkstra A.M. et al. // Sleep-Wake Research in Netherlands. The Nether-lands:Drukkerij Elinkwijk. 1995. P. 127129.
4. Kavanau J.L. // Brain Res.Bull. 1998. Vol. 46. P. 269-279.
5. Popov V.I. et al. // Neuroscince.1992. Vol. 48. P. 45-51.
6. Maher P., Schubert D. // Cell. Mol. Life Sci. 2000. Vol. 57. P. 1287-1305.
7. Suopanki J. et al. // Molecular Genetics and Metabolism. 2000. Vol. 71. P.190-194.
8. Иванов К.П., Кисляков Ю.Я. Энергетические потребности и кислородное обеспечение головного мозга. Л., 1979.
9. Нейрохимия / Под ред. И.П. Ашмарина. М., 1996.
10. Нурмагомедова П.М. и др. // Укр. био-хим. журн. 1983. Т. 5. № 2. С.175-178.
11. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М., 1988.
12. Storey K.B., Storey J.M. Life in the cold. N.Y., 2000. P. 303-313.
13. Van Breukelen F. et al. // J.Physiol. 2001. Vol. 281. № 5. P. R1374-R1379.
14. Storey K.B. // Comp. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 118A. № 4. P. 1115-1124.
15. Kaech S. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. № 13. P. 7086-7092.
Дагестанский государственный университет_______________________________________28 августа 2003 г.
