CC BY
90
40
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
УДК 577.15.03.
О. С. Логвинович
Кандидат биологических наук, ассистент кафедры биологической химии, Гомельский государственный медицинский университет, г. Гомель, Республика Беларусь
ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗА СЕЛЕЗЕНКИ СУСЛИКОВ SPERMOPHILUS UNDULATUS В ЛЕТНИЙ ПЕРИОД И В СЕЗОН ГИБЕРНАЦИИ
Орнитиндекарбоксилаза (ОДК, КФ 4.1.1.17.) - короткоживущий и динамично регулируемый фермент биосинтеза полиаминов. Регуляция функционального, метаболического и пролиферативного состояния органов и тканей включает изменения активности ОДК.
На селезенке зимоспящих млекопитающих - сусликов Spermophilus undulatus - показано снижение активности орнитиндекарбоксилазы в сезон зимней спячки. При этом отмечено наличие положительной корреляции между снижением и восстановлением специализированных функций лимфоидной ткани с соответствующими модификациями ферментативной активности ОДК в течение баутов спячки.
Ключевые слова: зимоспящие млекопитающие, Spermophilus undulatus, баут, гибернация, селезенка, орнитиндекарбоксилаза, спленоциты.
Введение
Одной из актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование адаптивных возможностей человека и животных к экстремальным факторам окружающей среды. В этом плане зимоспящие млекопитающие являются уникальными объектами для изучения резервных приспособительных способностей теплокровных животных путем гибернации. В сезон гибернации (лат. hibematio - зимовка, зимняя спячка, от hibemus - зимний) состояние оцепенения позволяет млекопитающим значительно экономить энергетические ресурсы организма за счет радикального снижения уровня физиологических и обменных процессов. Важно, что за короткий период пробуждения зимоспящие способны полностью восстановить измененный во время баута метаболизм. Показано, что в ходе гибернации происходит изменение активности ряда ферментов на разных стадиях их новообразования и функционирования [1], [2]. В этом отношении особый интерес представляет исследование короткоживущих и динамично регулируемых ферментов млекопитающих, одним из которых является орнитиндекарбоксилаза (ОДК, КФ 4.1.1.17). ОДК -ключевой фермент биосинтеза полиаминов, которые в свою очередь вовлечены в ряд клеточных процессов (упаковка нуклеиновых кислот, транскрипция, трансляция, стабилизация мембраны и апоптоз). Резкое повышение активности ОДК - одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клетки, готовящейся к росту и делению, дифференцировке или активному выполнению специализированной функции [3], [4]. На уровне целого организма активность ОДК регулируется нейроэндокринной системой, что важно для оценки системных адаптивных реакций организма на воздействия факторов внешней среды. Отмечено, что ОДК принимает участие в процессах адаптации млекопитающих к низким температурам окружающей среды и перехода в состояние гипобиоза [5].
Цель работы заключается в исследовании ферментативной активности ОДК в селезенке сусликов Spermophilus undulatus в активный летний период и в сезон гибернации в сопоставлении с функциональным состоянием органа в различных физиологических состояниях зимоспящих.
Методы исследования
В качестве объектов исследования использовали зимоспящих млекопитающих - якутские длиннохвостые суслики Spermophilus undulatus, которых отлавливали летом в окрестностях г. Якутска и содержали в стандартных условиях вивария (температура воздуха 20-21°С, влажность 65%) в индивидуальных клетках и естественном освещении. Гнездовой материал и пищу давали ad libitum. Перед сезоном спячки сусликов переносили в темное помещение с температурой 1-3°С и размещали в деревянных боксах размером 20 х 20 х 25 см. Для регистрации состояния животных
© Логвинович О. С., 2015
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
41
в подстилку гнезд были вмонтированы термодатчики. Температура «подстилки» у гибернирующих животных была порядка 2-4°С, и при выходе из спячки поднималась до 12-16°С.
Опыты на сусликах S. undulatus проводили в летний период и в сезон зимней спячки; использовали животных обоих полов массой 600-850 г. Все процедуры с животными проводились в соответствии с требованиями институтской комиссии по этике и Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (European Communities Council Directive (86/609/EEC)). В ряде опытов физиологическое состояние длиннохвостых сусликов оценивали по температуре тела (измеряли ректально датчиком электротермометра ТЭМП-60) и частоте сердцебиений (регистрировали с помощью электроэнцефалографа ЭЭГ-4-02). В сезон гибернации зимние суслики были разделены на четыре группы: 1 - спящие, которых декапитировали в середине баута при температуре тела от 1,0 до 7,0°С (средняя температура тела 4,2°С); 2 - пробуждающиеся животные, которых забивали до их перехода в активное состояние при температуре тела от 29,0 до 6,0°С (средняя температура тела 22,0°С) (выходящие суслики); 3 - активные зимние суслики - животные, активные между баутами спячки, которых забивали через 24 ч после пробуждения; 4 - входящие суслики - животные, которых использовали при входе в спячку при температуре тела от 36,6 до 6,7°С (средняя температура тела 18,5°С).
Сусликов декапитировали с помощью гильотины, селезенку извлекали и замораживали в жидком азоте. Активность ОДК ткани по величине Vmax определяли радиоизотопным методом по освобождению 14СО2 из меченого L-[1-14C] орнитина [6] с некоторыми модификациями [7]. Результаты выражали в пмоль СО2х(ч»мг белка)-1. Белок определяли методом Лоури [8]. Подсчет спленоцитов проводили по методу Горизонтова [9] с некоторыми модификациями [10], используя микроскоп Carl Zeiss Jena (Германия) при общем увеличении 10х10. Определение содержания гемоглобина в селезенке проводили гематиновым методом [11] Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента, результаты представляли как среднее ± стандартная ошибка. Все экспериментальные исследования проводились на базе Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН (г. Пущино).
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно результатам исследованиям, в состоянии оцепенения в период гибернации активность ОДК в селезенке снижается до 9,4 ± 1,8% (n = 11) от активности фермента летних сусликов.
Вхождение сусликов в состояние оцепенения, по оценке активности ОДК селезенки, можно разделить на две стадии. Первая стадия вхождения (температура тела от 36,6оС до 22,0оС, включительно) - активность фермента (2,9 ± 0,5 пмоль СО2х(ч»мг белка)-1; n = 9, p < 0,05) достоверно превышает активность ОДК спящих сусликов (1,1 ± 0,2 пмоль СО2х(чхмг белка)-1; n = 11). На второй стадии (температура тела ниже 22,0оС) активность ОДК (1,2 ± 0,1 пмоль СО2х(чхмг белка)-1; n = 9) сравнивается с активностью фермента селезенки сусликов, находящихся в состоянии оцепенения. Активности ключевого фермента биосинтеза полиаминов на первой и второй стадиях вхождения сусликов в состояние оцепенения достоверно различаются между собой.
У выходящих из состояния оцепенения животных было выявлено, что в селезенке на раннем этапе пробуждения активность фермента сохраняется на низком уровне. Повышение активности ОДК в селезенке пробуждающихся сусликов происходит в соответствии с повышением температуры. Ферментативная активность ОДК у выходящих сусликов достоверно отличается от активности фермента спящих только при температуре тела пробуждающихся сусликов выше 20оС (2,6 ± 0,3 пмоль СО2х(чхмг белка)-1; n = 5, p < 0,05).
Селезенка - периферический орган иммунной системы, отвечающий за развитие гуморального ответа в организме млекопитающих. Из литературных данных известно, что в период гибернации происходит снижение функциональной активности иммунной системы. Кроме того, показано, что в состоянии оцепенения в сезон зимней спячки отсутствует иммунный ответ на введенный антиген [1]; показан так же сниженный ответ на митогены у спленоцитов, выделенных из спящих сусликов [12]. Снижение ферментативной активности ОДК в селезенке сусликов при входе в состояние оцепенения и собственно спячки сопоставимо и вероятнее всего определяется снижением функциональной активности имммунокомпетентных клеток селезенки. Ранее на негибернирующих животных (крысах), искусственно введенных в состояние гипобиоза в условиях
42
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
гипотермии-гипоксии-гиперкапнии, было показано снижение активности ОДК в лимфоидных тканях - тимусе и селезенке, а так же в печени и слизистой оболочке тонкого кишечника. Падение активности фермента сопровождалось снижением доли клеток в S-фазе клеточного цикла, что указывало на снижение пролиферативной активности тимоцитов после воздействия условий искусственного гипобиоза [13].
Высокая активность ОДК селезенки сусликов на первой стадии вхождения животных в оцепенение, по-видимому, указывает на сохранение возможности клеток селезенки отвечать на антигенные и митогенные стимулы. Во время кратковременных пробуждений у межбаутных сусликов отмечено повышение ферментативной активности ОДК селезенки. Между активными зимними сусликами и сусликами, находящимися в состоянии оцепенения показана достоверная разница в активности фермента биосинтеза полиаминов. Предполагается, что периодические пробуждения зимоспящих необходимы для активации иммунной системы и ликвидации патогенной микрофлоры, накопленной во время спячки [12], [14]. Повышающийся уровень активности ОДК в селезенке у межбаутных сусликов, по-видимому, свидетельствует о восстановлении функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Из литературных данных известно, что после иммунизации крыс происходит повышение активности ОДК в селезенке [15].
Для контроля физиологического состояния селезенки в летний период и в сезон гибернации сусликов подсчитывалось количество спленоцитов, исследовались масса органа и количество белка. Показано незначительное повышение числа клеток на орган (таблица 1), увеличение массы селезенки (таблица 2) и количества белка (таблица 3) в период гибернации. Масса селезенки и количество белка у межбаутных активных сусликов снижаются, но не достигают уровня летних животных.
Таблица 1. - Количество клеток селезенки сусликов S. undulatus в различных физиологических
состояниях
Физиологическое состояние сусликов Количество животных (n) Количество спленоцитов на орган 109
Летние 6 3,5 ± 0,6
Зимние активные 4 4,0 ± 0,8
входящие 21 4,9 ± 0,3*
спящие 7 5,0 ± 1,0
выходящие 7 4,0 ± 0,8
Примечание: различие достоверно по отношению к летним сусликам: * - p < 0,05
Таблица 2. - Масса селезенки сусликов S. undulatus в различных физиологических состояниях
Физиологическое состояние Количество Масса селезенки, г
сусликов животных (n)
Летние 13 0,902 ± 0,1
Зимние активные 10 1,168 ± 0,1*
входящие 29 2,023 ± 0,1*
спящие 15 2,126 ± 0,2*
выходящие 10 1,467 ± 0,1*
Примечание: различие достоверно по отношению к летним сусликам: * - p < 0,05.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
43
Таблица 3. - Количество белка в селезенке сусликов S. undulatus в различных физиологических состояниях
Физиологическое состояние Белок супернатанта селезенки, Белок гомогената селезенки
сусликов мг/г-тк мг/г-тк
Летние 81,1±2,8 159,5±1,4
n=12 n=4
Зимние активные 102,0±10,1* 197,3±16,0*
n=7 n=3
входящие 161,0±7,5* 297,6±12,1*
n=21 n=14
спящие 157,2±8,1* 276,4±7,7*
n=15 n=10
выходящие 105,7±8,8* 197,0±4,0*
n=9 n=2
Примечание: различие достоверно по отношению к летним сусликам: * - p<0,05; n - количество животных.
Полученные данные хорошо согласуются с литературными по подсчету числа клеток в циркулирующей крови. Выраженная лейкопения обнаружена у всех зимоспящих в состоянии оцепенения. В литературе показано также снижение концентрации билирубина в крови в период глубокой спячки, что указывает на уменьшение количества циркулирующих эритроцитов [16]. Таким образом, полученное в эксперименте увеличение массы селезенки и повышение числа спленоцитов указывает на депонирование клеток крови в селезенке. Кроме того, учитывая то, что большая часть билирубина крови образуется из гемоглобина разрушающихся эритроцитов можно ожидать, что повышенное содержание белка в селезенке определяется депонирующимися в ней эритроцитами, содержащими гемоглобин. В связи с этим было исследовано содержание гемоглобина в супернатанте селезенки сусликов в летний период и в сезон гибернации. У сусликов, находящихся в состоянии оцепенения, показано достоверное увеличение количества общего гемоглобина в супернатанте селезенки до 271,6 ± 25,6% (n = 9, p < 0,05) от уровня летних животных. У активных зимних сусликов количество общего гемоглобина соответствует уровню летних животных.
Из полученных нами экспериментальных данных следует, что повышенное содержание белка в селезенке (таблица 3) в значительной степени определяется депонирующимися в ней эритроцитами, содержащими гемоглобин. Снижение массы органа, количества гемоглобина и количества белка селезенки у межбаутных сусликов, по-видимому, связано с выходом эритроцитов и лейкоцитов в кровяное русло. Согласно литературным данным, в крови спящих животных обнаруживаются многочисленные дегенеративно измененные лимфоциты, которые утилизируются в момент пробуждения. Утилизированные клетки заменяются вновь пришедшими из клеточных депо - слизистой желудочно-кишечного тракта, селезенки, легких, лимфоузлов. Наличие морфологически измененных лимфоцитов в крови связывают с реутилизацией лимфоцитов в качестве эндогенного пластического материала при снижении общего уровня метаболических процессов в состоянии спячки.
В связи с тем, что в ходе экспериментальных исследований обнаружено увеличение количества белка в селезенке сусликов в период гибернации, был выполнен пересчет активности фермента ОДК в пмоль СО2х(чхг ткани)-1 (таблица 4). Увеличивающийся белок дает несколько заниженные результаты активности ОДК в пмоль СО2х(чхмг белка)-1 по сравнению с активностью в пересчете на грамм ткани. Но снижение активности ОДК в селезенке сусликов в различных физиологических состояниях в период гибернации сохраняется.
44
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Таблица 4. - Активность ОДК в селезенке сусликов S. undulatus в летний период и в различных физиологических состояниях в сезон гибернации
Физиологическое состояние сусликов Количество животных (n) Активность ОДК
пмоль СО2 ч*мг белка пмоль СО2 ч*г ткани
Летние 13 11,9±1,4 1004,0±129,2
Зимние активные 7 8,0±3,0 776,3±254,3
входящие 20 2,0±0,3* 298,3±32,8*
спящие 11 1,1±0,2* 165,5±27,3*
выходящие 9 2,7±0,2* 285,1±28,5*
Примечание: различие достоверно по отношению к летним сусликам: * - p<0,05.
Отсутствие сведений о величине активности ОДК в клетках крови сусликов вносит неопределенность в трактовку причин уменьшения активности ОДК в селезенке при оцепенении.
Выводы
Таким образом, изменение активности ОДК (маркера активации клеток) в период зимней спячки совпадает с функциональным состоянием селезенки сусликов. В сезон гибернации в состоянии оцепенения селезенка выполняет пассивную роль клеточного депо; ингибирование активности ОДК селезенки коррелирует со снижением функциональной активности иммунной системы.
Автор статьи выражает благодарность коллективу лаборатории регуляции апоптоза Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН (г. Пущино) за помощь в проведении экспериментальной работы и обсуждении результатов.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Carey, H. V. Mammalian Hibernation: Cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature / H. V. Carey, M. T. Andrews, S. L. Martin // Physiol. Rev. - 2003. - V. 83. - P. 1153-1181.
2. Колаева, С. Г. Зимняя спячка / С. Г. Колаева // Вестник РАН. - 1996. - Т. 63; № 12. - C. 1076-1081.
3. Hayashi, S. Rapid and regulated degradation of ornithine decarboxylase / S. Hayashi, Y. Murakami // Biochem. J. - 1995. - V. 306. - P. 1-10
4. Pegg, A. E. Regulation of ornithine decarboxylase / A. E. Pegg // The J. of biol. chem. - 2006. - V. 281; № 21. - P. 14529-14532.
5. Мельничук, Д. О. Механизмы метаболических адаптаций / Д. О. Мельничук, В. О. Михайловский, С. Д. Мельничук // Укр. биохим. журн. - 2000. - Т. 72; № 4-5. - С. 70-80.
6. Janne, J. On the purification of L-ornithine decarboxylase from rat prostate and effects of thiol compounds on the enzyme / J. Janne, H. G. Williams-Ashman // The J. of Biol. Chem. - 1971. - V. 246 ; № 6P. 1725-1732.
7. Slozhenikina. L. V. Ornithine decarboxylase in organs of rat following chronic irradiation at low dose-rates / L. V. Slozhenikina, L. A. Fialkovskaya, I. K. Kolomiytseva // Int. J. Radiat. Biol. - 1999. - V. 75. - P. 193-199.
8. Lowry, O. H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O. H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. -1951. - V. 193. - P. 265-275.
9. Горизонтов, П. Д. Стресс и система крови / П. Д. Горизонтов. - М. : Медицина, 1983. - 239 с.
10. Лабораторная гематология / под ред С. А. Луговской [и др.]. - М. : изд-во Кад. КЛД, 2006. - 222 с.
11. Клинические лабораторные исследования / под ред. А. Я. Любиной [и др.]. - М. : изд-во Медицина, 1984. - 288 с.
12. Сезонные изменения продукции фактора некроза опухолей у зимнеспящих животных в норме и при действии электромагнитных и ионизирующих излучений / В. Б. Огай [и др.] // Рад. биология. Радиоэкол. -2002. - Т. 42 ; № 2. - С. 141-146.
13. Аксенова, Г. Е. Активность орнитиндекарбоксилазы в органах и тканях крыс при искусственной гипотермии / Г. Е. Аксенова [и др.] // Биохимия. - 2010. - Т. 75 ; выпуск 9. - С. 1257-1264.
14. Prendergast, B. J. Periodic arousal from hibernation is necessary for initiation of immune responses in ground squirrels / B. J. Prendergast [et al.] // Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. - 2002. - V. 282. -P. R1054-R1062.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
45
15. Cardinali, D. P. Effect of pinealectomy, superior cervical ganglionectomy, or melatonin treatment on 24-hour rhythms in ornithine decarboxylase and tyrosine hydroxylase activities of rat spleen / D. P. Cardinali [et al.] // J. Pineal Res. - 1997. - V. 22 ; №4. - P. 210-220.
16. Ануфриев, А. И. Экология и биоэнергетика зимней спячки мелких зимоспящих млекопитающих Северо-Востока Сибири : дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.16 / Ануфриев Андрей Иванович. - Якутск, 2005. -369 л.
Поступила в редакцию 07.07.15 E-mail: [email protected]
O. S. Logvinovich
THE ORNITHINE DECARBOXYLASE IN SPLEEN OF GROUND SQUIRREL SPERMOPHILUS UNDULATUS IN SUMMER AND HIBERNATION SEASON
Ornithine decarboxylase (ODC, EC 4.1.1.17.) is a short-lived and dynamically regulated enzyme of the biosynthesis of polyamines. Regulation of functional, metabolic and proliferative state of organs and tissues involves the modifications of the enzymatic activity of ODC. The specific changes in ODC activity were revealed in spleen of hibernating mammals - ground squirrels Spermophilus undulatus -during the hibernating season.
Key words: hibernating mammals, Spermophilu.
