CC BY
10
УДК 612.822:577.175.824]-092.4 03.03.05 Биология развития, эмбриология
ТЕЛЬЦА КАХАЛЯ В РАЗВИВАЮЩИХСЯ ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ МОЗГА КРЫСЫ © Федина Е.М., Заерко А.В., Зиматкин С.М.
Гродненский государственный медицинский университет, Беларусь, 230023, Гродно, ул. Горького, 80
Резюме
Цель. Цель настоящего исследования - оценка особенностей становления телец Кахаля в гистаминергических нейронах мозга крысы с 5-х по 45-е сут. постнатального онтогенеза.
Методика. Научная работа выполнена на потомстве беспородных белых крыс (12 животных). Декапитация крысят осуществлялась на 5-е, 20-е и 45-е сут. после рождения. В работе использовали гистологический, электронно-микроскопический, морфометрический и статистический методы исследования. Полученные данные обрабатывали методами непараметрической статистики.
Результаты. С 5-х по 45-е сут. постнатального периода в ядрах гистаминергических нейронов гипоталамуса крыс выявляются преимущественно контактирующие с ядрышком или лежащие свободно тельца Кахаля. В процессе установления тесной ассоциации с ядрышком данные структуры крепятся к нему, образуя на его поверхности «колпачок». На 20-е сут. выявляется увеличение степени ассоциации ядрышек с тельцами Кахаля, проявляющееся формированием перинуклеолярных кольцевых скоплений из телец Кахаля в форме розеток.
Заключение. За описанный период постнатального онтогенеза гистаминергических нейронов тельца Кахаля не претерпевают существенных изменений по форме и размерам, которые могли бы быть связаны с возрастом животных. Частота встречаемости данных структур уменьшается почти в 2,6 раза.
Ключевые слова: тельца Кахаля, гистаминергические нейроны, постнатальный онтогенез
CAJAL BODIES IN DEVELOPING HISTAMINERGIC NEURONS OF RAT BRAIN Phedina KM., Zaerko A.V., Zimatkin C.M.
Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230023, Grodno, Belarus Abstract
Objective. The aim of the study is to assess the features of Cajal bodies formation in rat brain histaminergic neurons from the 5th to the 45th days of postnatal ontogenesis.
Methods. The scientific work was performed on the offspring of outbred white rats (12 animals). The decapitation of rats was carried out on the 5th, 20th and 45th days after birth. In the work we used histological, electron microscopic, morphometric and statistical research methods. The obtained data were processed by nonparametric statistics.
Results. From the 5th to the 45th days of the postnatal period, in the nuclei of rat hypothalamus histaminergic neurons Cajal bodies, mainly in contact with the nucleolus or lying freely, are detected. In the process of establishing close association with the nucleolus, these structures are attached to it, forming a "cap" on its surface. On the 20th day, an increase in the degree of nucleoli association with Cajal bodies is revealed, which is manifested by the formation of perinucleolar ring clusters from Cajal bodies in the form of rosettes.
Conclusion. During the described period of postnatal ontogenesis of histaminergic neurons, Cajal bodies do not undergo significant changes in shape and size, which could be related to the age of the animals. The frequency of occurrence of these structures decreases by almost 2.6 times.
Keywords: Cajal bodies, histaminergic neurons, postnatal ontogenesis
Введение
Тельца Кахаля (ТК), или спиральные тельца, представляют собой отчетливые повсеместно распространенные в растительных и животных клетках ядерные структуры [8]. Впервые
23
обнаружены С.Ф. Рамоном-и-Кахалем в 1903 г. в ядре нейрона. Они были описаны как округлые аргирофильные образования и названы «вспомогательными тельцами ядрышка» из-за своего зачастую близкого к нему расположения. В 1969 году с помощью электронной микроскопии А. Моннерон и В. Бернхард заново открыли эти ядерные включения как клубки электронно-плотных неупорядоченных спиральных нитей и на основе выявленной структурной конфигурации назвали их «спиральными тельцами» [7]. После публикации результатов данных исследований ТК вели параллельную жизнь в качестве «спирального тельца» и «вспомогательного тельца» в течение более десяти лет, пока M. Лафарга и его коллеги окончательно не доказали, что все они имеют одинаковую структуру [6]. Позднее, в 1999 г., эти образования были переименованы в «тельца Кахаля» в честь своего первооткрывателя [3].
В одной клетке может содержаться от 1 до 10 телец Кахаля. Их биогенез проявляет свойства самоорганизующейся структуры. Между ядрышком и ТК существует тесная физическая связь. Она особенно отчетливо прослеживается в большинстве типов нейронов крыс [10]. Известно, что тельце Кахаля включает малые ядерные и ядрышковые рибонуклеопротеины, участвующие в сплайсинге пре-мРНК и созревании пре-рРНК, а также содержит специфический маркер - белок р80-коилин и белок выживания мотонейронов (survival motor neuron protein), играющие важнейшую роль в поддержании структурной целостности данного образования. Кроме того, ТК разделяет с ядрышком белки фибрилларин, Nopp140, NAP57 и ДНК-топоизомеразу I, что обуславливает функциональный диалог между ними. В настоящее время тельце Кахаля интерпретируется как многофункциональная структура, вовлеченная в биогенез, транспорт и рециркуляцию малых ядерных и ядрышковых РНК [6].
У взрослых млекопитающих и человека тела гистаминергических нейронов расположены в туберомаммиллярной области гипоталамуса, где они образуют пять скоплений - ядер (Е1-Е5), которые пространственно взаимосвязаны между собой и постепенно переходят одно в другое. Аксоны гистаминергических нейронов распространяются во все отделы мозга, где могут координировать работу других нейротрансмиттерных систем. Эти нейроны играют важную роль в регуляции многих функций, систем и реакций организма: нейроэндокринной и сердечнососудистой, кровотока мозга, температуры тела, сна и бодрствования, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения [4]. Однако постнатальное развитие гистаминергических нейронов мозга крысы изучено недостаточно.
Цель исследования - оценка особенностей становления телец Кахаля в гистаминергических нейронах мозга крысы с 5-х по 45-е сут. постнатального онтогенеза.
Методика
Исследование выполнено на потомстве беспородных белых крыс (12 крысят), в соответствии с принципами биоэтики и требованиями Директивы Европейского Парламента и Совета № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [2]. На проведение данного исследования получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол №1 от 30.01.2018). Животные находились на стандартном рационе вивария. Декапитация крысят осуществлялась на 5-е, 20-е и 45-е сут. после рождения, после чего быстро извлекали головной мозг, вырезали кусочек заднего гипоталамуса и помещали его в 1% осмиевый фиксатор на буфере Миллонига (рН = 7,4) на 2 часа при температуре +4еС. Далее образцы промывали в смеси буфера Миллонига (20 мл) и сахарозы (900 мг), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, смеси спирта и ацетона и ацетоне, проводили через смеси смол (Araldite M + Araldite M hardener 964 + дибутилфталат + Araldite M accelerator 960) (Sigma-Aldrich) и ацетона и заключали в эту заливочную смесь смол. Полутонкие срезы (толщиной около 350 нм) изготавливали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Leica, Germany), окрашивали метиленовым синим для уточнения локализации изучаемой структуры - гистаминергического ядра Е2. Ультратонкие срезы (толщиной около 35 нм) собирали на опорные сеточки (Sigma), контрастировали ацетатом урана и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), фотографировали с помощью цифровой камеры Olympus Mega View III (Germany). Ультраструктурную морфометрию проводили с помощью программы обработки изображения iTEM (Version 5.0; Build 1224; Serial Number A3766900-7E852FAB, Germany), обводя курсором на мониторе компьютера выбранные объекты и оценивая их количество и размеры.
Полученные данные обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Количественные результаты представляли в виде «Ме (LQ; UQ)», где Me - медиана, LQ - верхняя граница нижнего квартиля, UQ - нижняя граница верхнего квартиля. Сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-
Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (p<0,05).
Результаты исследования
Установлено, что в ядрах развивающихся гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы площадь сечения телец Кахаля варьирует от 0,15 до 0,32 мкм2 Они имеют овальную или сферическую форму, не ограничены мембраной и состоят из гранул, плотных спиральных нитей и промежуточной матрицы более низкой осмиофильной плотности (рис. А). У 5-суточных крысят в ядрах у половины исследованных нами гистаминергических нейронов встречается от 1 до 3 ТК, преимущественно контактирующих с ядрышками (78%) (рис. Б), либо лежащих свободно на некотором удалении от них (22%), не обнаруживая топологических связей с ядерной оболочкой (рис. А). Их среднее число в ядре составляет 1,10 (табл.). В процессе формирования тесной ассоциации с ядрышком ТК крепится к нему, образуя на его поверхности, как правило, единичный «колпачок» («nucleolar cap»). Однако отмечено и попарное расположение телец Кахаля, связанных с одним и тем же ядрышком (5% случаев). При этом прикрепление данных образований осуществляется чаще в области расположения плотного фибриллярного компонента ядрышка (рис. Б).
Рис. Тельца Кахаля в ядрах развивающихся гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы. А - общий вид тельца Кахаля, свободно лежащего в нуклеоплазме, 5 сут. Б - тельце Кахаля, связанное с ядрышком, 5 сут. В - тельце Кахаля в виде колпачка на поверхности ядрышка, 20-е сут. Г - тельце Кахаля, лежащее в отдалении от ядрышка, 45-е сут. Тельца Кахаля показаны стрелками. Электронограммы. Масштабный отрезок - 1 мкм. Ув.: А, Б - 30000, В, Г - 25000
На 20-е сут. постнатального развития крыс количество гистаминергических нейронов, в ядрах которых замечены тельца Кахаля, уменьшается до 27% (табл.). При этом все выявляемые ТК связаны с ядрышками (рис. В). Среднее число телец Кахаля составляет 1,33 (табл.). Их количество, приходящееся на одно и то же ядрышко, увеличивается в среднем до 3, а характер крепления к нему не меняется, то есть по-прежнему оно осуществляется через плотный фибриллярный компонент последнего. В единичных случаях в нейронах встречается до 5 таких структур, формирующих при прикреплении к ядрышку перинуклеолярные кольцевые скопления - розетки.
Таблица. Тельца Кахаля в ядрах гистаминергических нейронов в период постнатального развития крыс__
Показатели Сроки исследования
5 сут. 20 сут. 45 сут.
Количество нейронов 50,000 27,273 16,667
с тельцами Кахаля, % (30,769; 58,824) (21,739; 33,333) (12,500; 33,333)
Количество телец Кахаля 1,100 1,333 1,000
в ядре нейрона, шт. (1,000; 1,333) (1,200; 2,000) (1,000; 1,500)
Площадь 0,210 0,190 0,200
телец Кахаля, мкм2 (0,180; 0,250) (0,120; 0,225) (0,150; 0,210)
Примечание: количественные результаты представлены в таблице в виде «Ме (LQ; UQ)», где Ме - медиана, LQ - верхняя граница нижнего квартиля, ир - нижняя граница верхнего квартиля
К 45-м сут. постнатального онтогенеза количество гистаминергических нейронов с тельцами Кахаля уменьшается до 17%. При этом вновь обнаруживаются, как ассоциированные с ядрышками (70%), так и свободно лежащие в нуклеоплазме (30%) ТК (рис. Г). Их среднее число составляет 1,00 (табл.). Количество телец Кахаля, связанных с одним и тем же ядрышком, колеблется от 1 до 3. При этом частота встречаемости данных структур, по сравнению с 5-ми сут., уменьшается почти в 2,6 раза (табл.), однако их размеры и внешний вид не претерпевают существенных изменений.
Обсуждение результатов исследования
В период постнатального развития у крыс в ядрах гистаминергических нейронов гипоталамуса встречаются тельца Кахаля, преимущественно контактирующие с ядрышками, что, в целом, является обычным явлением для нейронов головного мозга крысы [8]. При этом прикрепление ТК происходит, как правило, в области расположения плотного фибриллярного компонента ядрышка, являющегося местом синтеза и ранней обработки пре-рРНК [6]. Известно, что тельца Кахаля разделяют с ядрышком белки фибрилларин, ^рр140, NAP57 и ДНК-топоизомеразу I [3, 6]. В ядрышке данные соединения располагаются в области плотного фибриллярного компонента [6], и тем самым, по-видимому, служат молекулярной основой для взаимодействия между этими ядерными тельцами. Это позволяет предположить, что частые ассоциации ТК с ядрышками, наблюдаемые в развивающихся гистаминергических нейронах, способствуют целенаправленному воздействию на ядрышко основных компонентов механизма процессинга пре-рРНК [7] в связи с высокими цитоплазматическими потребностями растущих клеток в биосинтезе белка.
Интересно, что за описанный период развития нейронов тельца Кахаля, в отличие от ядрышек, не претерпевают существенных изменений по форме и размерам, то есть не проявляют никаких структурных различий, которые могли бы быть связаны с возрастом животных. Самая высокая частота встречаемости таких структур наблюдается на 5-е сут. Это в целом согласуется с данными, полученными при исследовании других типов нейронов в период их развития [1, 5]. На 20-е сут. в ядрах гистаминергических нейронов число ТК, приходящихся на ядрышко, увеличивается в среднем до 3, в единичных случаях в клетках встречается до 5 таких образований, формирующих розетки вокруг ядрышек. Предполагается, что ядра с большим количеством данных образований поддерживают более высокую скорость сборки малых ядерных и ядрышковых рибонуклеопротеинов из-за повышенной вероятности молекулярных взаимодействий между компонентами телец Кахаля, окружающих ядрышко [6]. Известно, что растущие нейроны обладают высокой транскрипционной активностью. Поскольку ТК являются транскрипционно зависимыми ядерными структурами [6, 7] и в наибольшей степени распространены в быстро развивающихся клетках [5, 7], наличие скоплений этих телец в виде розеток вокруг ядрышка, наблюдаемое нами на 20-е сут. постнатального развития гистаминергических нейронов, является вполне закономерным. Их количество динамически приспосабливается к поддержанию высокой потребности нейронов в сплайсинге и биогенезе рибосом, необходимых для стабилизации метаболической и биоэлектрической активности [6].
Похожие перинуклеолярные скопления телец Кахаля были отмечены ранее [9] при изучении развития пирамидных нейронов гиппокампа крыс после 13-14 сут. постнатального развития на этапе их терминальной дифференцировки. Авторы наблюдали аналогичные розетки также в нейронах других областей головного мозга, в связи с чем, они предположили, что данное явление может быть своеобразным маркером финальной стадии нейрональной дифференцировки.
Таким образом, в постнатальном онтогенезе гистаминергических нейронов связь между тельцами Кахаля и ядрышком может быть охарактеризована как поддерживающая, учитывая, что данные образования способствуют формированию в ядрышках зрелых компонентов, необходимых для биогенеза рибосом.
Заключение
С 5-х по 45-е сут. постнатального периода в ядрах гистаминергических нейронов гипоталамуса крыс выявляются преимущественно контактирующие с ядрышком или лежащие свободно тельца Кахаля. В процессе установления тесной ассоциации с ядрышком данные структуры крепятся к нему, образуя на его поверхности «колпачок». На 20-е сут. выявляется увеличение степени ассоциации ядрышек с тельцами Кахаля, проявляющееся формированием перинуклеолярных кольцевых скоплений из телец Кахаля в форме розеток. За описанный период постнатального онтогенеза гистаминергических нейронов тельца Кахаля не претерпевают существенных изменений по форме и размерам, которые могли бы быть связаны с возрастом животных. Частота встречаемости данных структур уменьшается почти в 2,6 раза.
Литература (references)
1. Clark P., Jones K.J., La Velle A. Ultrastructural and morphometric analysis of nucleolar and nuclear changes during the early growth period in hamster facial neurons // Journal of Comparative Neurology. - 1990. - V.302, N4. - P. 749-760.
2. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes: text with EEA relevance 20.10.2010. - Strasbourg: Official Journal of the European Union, 2010. - 46 p.
3. Gall J.G. Cajal bodies: the first 100 years // Annual Review of Cell and Developmental Biology. - 2000. -V.16. - P. 273-300.
4. Haas H., Sergeeva O., Selbach O. Histamine in the nervous system // Physiological Reviews. - 2008. - V.88, N3. - P. 1183-1241.
5. Hervas J.P., Villegas J., Crespo D., Lafarga M. Coiled bodies in supraoptic nuclei of the rat hypothalamus during the postnatal period // American Journal of Anatomy. - 1980. - V.159, N4. - P. 447-454.
6. Lafarga M., Tapia O., Romero A.M., Berciano M.T. Cajal bodies in neurons // RNA Biology. - 2017. - V.14, N6. - P. 712-725.
7. Pena E., Berciano M.T., Fernandez R. et al. Neuronal body size correlates with the number of nucleoli and Cajal bodies, and with the organization of the splicing machinery in rat trigeminal ganglion neurons // Journal of Comparative Neurology. - 2001. - V.430, N2. - P. 250-263.
8. Raska I., Ochs R.L., Andrade L.E. et al. Association between the nucleolus and the coiled body // Journal of Structural Biology. - 1990. - V.104, N1-3. - P. 120-127.
9. Santama N., Dotti C.G., Lamond A.I. Neuronal differentiation in the rat hippocampus involves a stage-specific reorganization of subnuclear structure both in vivo and in vitro // European Journal of Neuroscience. - 1996. -V.8, N5. - P. 892-905.
10. Trinkle-Mulcahy L., Sleeman J.E. The Cajal body and the nucleolus: "In a relationship" or "It's complicated"? // RNA Biology. - 2017. - V.14, N6. - P. 739-751.
Информация об авторах
Федина Екатерина Михайловна - кандидат биологических наук, доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: phedina.katerina@mail.ru
Заерко Анастасия Викторовна - аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь.E-mail: wersall_91@mail.ru
Зиматкин Сергей Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: smzimatkin@mail.ru
