CC BY
20
УДК 611.81-018.82:577.175.824]:612.65 Б01: 10.36361/2307-4698-2019-21-1-50-54
Зиматкин С. М., Заерко А. В., Федина Е. М., Островская О. Б., Конончик А. Э.
УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь
ПОСТНАТАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ МОЗГА КРЫСЫ
Гистаминергическая система головного мозга играет важную роль в регуляции многих функций, систем и реакций организма. У взрослых млекопитающих и человека тела гистаминергических нейронов расположены исключительно в гипоталамусе, преимущественно в его туберомаммиллярной части, где образуют пять скоплений - ядер (Е1 - Е 5). Цель исследования - оценка ультраструктурных изменений гистаминергических нейронов ядра Е 2 гипоталамуса крысы в постнатальном онтогенезе. Электронно-микроскопически установлено, что в процессе постнатального развития гистаминергические нейроны укрупняются, в их цитоплазме увеличивается количество всех органелл клетки, в ядре уменьшается число ядрышек и количество субъединиц рибосом, собирающихся вблизи кариолеммы, контуры которой становятся более ровными, а в цитоплазме уменьшаются размеры ядрышкоподобных телец.
Ключевые слова: гистаминергические нейроны, ультраструктура, постнатальный онтогенез, гипоталамус.
Введение. Гистаминергические нейроны играют важную роль в регуляции многих функций, систем и реакций организма: нейроэндокринной и сердечно-сосудистой систем, кровотока мозга, температуры тела, сна и бодрствования, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения, а также в патогенезе многих заболеваний [2]. У взрослых млекопитающих и человека тела гистаминергических нейронов головного мозга расположены исключительно в гипоталамусе, преимущественно в его туберомаммиллярной части, где образуют пять скоплений - ядер (Е1 - Е5) [10]. При этом ядро Е2 является самым крупным: составляет 40% от общего объёма гистаминергических ядер и содержит 54% гистаминергических нейронов гипоталамуса [2]. В литературе описаны локализация, пространственная организация, а также ультрамикроскопическое строение гистаминергических нейронов гипоталамуса у взрослых животных [3, 5, 10, 11, 15, 17]. Однако исследований постнатального развития ультраструктуры гистаминергических нейронов мозга крысы не проводилось.
Цель исследования. Оценка ультраструктурных изменений гистаминергических нейронов ядра Е2 гипоталамуса крысы в постнатальном онтогенезе.
Материал и методы. Научная работа выполнена на 4 самках беспородных белых крыс с начальной массой 230 ± 20 г и их потомстве (12 крысят). Исследование проведено в соответствии с принципами биоэтики и требованиями нормативных документов по проведению медико-биологических исследований (Деректива 2016/63/Еи; ГОСТ 33044-2014). Получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 30.01.2018). Животные находились на стандартном рационе вивария. Декапитация крысят осуществлялась на 5-е, 20-е и 45-е сутки после рождения (для лучшей оценки динамики развития брали по одному крысенку из каждого помета на каждый срок, всего по 4 крысенка). После декапитации
быстро извлекали головной мозг, вырезали кусочек заднего гипоталамуса с гистаминергическими ядрами и помещали его в 1% осмиевый фиксатор на буфере Миллонига (рН = 7,4) на 2 часа при температуре +4 °С. Далее образцы промывали в смеси буфера Миллонига (20 мл) и сахарозы (900 мг), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, смеси спирта и ацетона и ацетоне, проводили через смеси смолы и ацетона и заключали в заливочную смолу (аралдит М + аралдит Н + дибутилфталат + ДМР-30). Полутонкие срезы (толщиной около 350 нм) изготавливали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Leica, Germany), окрашивали метиленовым синим для уточнения локализации изучаемой структуры - гистаминергиче-ского ядра Е2. Ультратонкие срезы (толщиной около 35 нм) собирали на опорные сеточки, контрастировали ацетатом урана [16] и цитратом свинца [14].
Полученные препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), для получения снимков использовался комплекс из цифровой камеры Olympus Mega View III (Germany) и программы iTEM (Version 5.0; Build 1224; Serial Number A3766900-7E852FAB).
Результаты исследования. Результаты электронно-микроскопического исследования показали, что гистаминергические нейроны гипоталамуса крысы на 5-е сутки постнатального онтогенеза имеют преимущественно овальную форму. При этом можно различить 2 типа нейронов: довольно крупные, отличающиеся большим числом внутриклеточных органелл, с ядром, смещенным на периферию клетки, и реже встречающиеся более мелкие клетки с тонким ободком цитоплазмы, содержащей небольшое количество органелл.
Ядра гистаминергических нейронов отличаются крупными размерами и неровным контуром. Они занимают большую часть площади клетки и располагаются преимущественно в центре, однако в некоторых нейронах ядра смещаются на периферию. Многие
ядра нейронов имеют неровный контур, с выпячиваниями или углублениями в форме слепо оканчивающихся каналов. Кариолемма характеризуется обилием ядерных пор, наружная мембрана извилистая, на ней единично, либо группами расположены рибосомы, внутренняя мембрана с более ровным контуром. В перинуклеарном пространстве наблюдаются локальные расширения. Преобладает эухроматин, за счет чего ядра клеток выглядят светлыми. В ядрах гистаминергических нейронов 5-суточных животных встречается от 1-го до 3-х ядрышек (чаще 2), располагающихся эксцентрично (преимущественно по разным полюсам ядра). Ядрышки ретикулярного типа: имеют нуклеолонемное строение с хорошо развитыми преобладающим гранулярным компонентом
Рис. 1. Ультраструктурная организация гистаминергических нейронов ядра Е2 гипоталамуса крысы. А - ядрышко, Б - ядрышкоподобное тельце, В - комплекс Гольджи, Г - мультивезикуляр-ные тельца, Д - гранулярная эндоплазматическая сеть, Е - лизосомы, А, Б - 5-е сутки; В, Г - 20-е сутки; Д, Е - 45-е сутки постнатального развития. ГрЭС - гранулярная эндоплазматическая сеть, КГ - комплекс Гольджи, Л - лизосомы, Мх - митохондрии, МТ - мультивезикулярные тельца, СР -субъединицы рибосом у кариолеммы, Я - ядро, Ядр - ядрышко, ЯПТ - ядрышкоподобное тельце. Масштабный отрезок равен 1 мкм. Ув. 30000. Электронограмма
и плотным фибриллярным компонентом, окружающим фибриллярные центры. Между ядрышком и ка-риолеммой часто наблюдается чёткое скопление субъединиц рибосом наподобие облака-тени (рис. 1А).
В цитоплазме гистаминергических нейронов 5-су-точных крысят отмечается умеренное количество митохондрий, которые имеют округлую, овальную, продолговатую, изредка, неправильную форму и располагаются диффузно (рис. 1А, Б). Иногда наблюдается их деление. Отдельные митохондрии почти вплотную прилегают к ядерной оболочке, цистернам и канальцам эндоплазматической сети (рис. 1Б) или друг к другу, иногда контактируя между собой. Кристы митохондрий не всегда хорошо выражены и располагаются неупорядоченно: как вдоль, так и поперек по отношению к длинной оси
органелл. Иногда они изгибаются и не имеют выраженной ориентации (рис. 1А, Б).
Гранулярная эндо-плазматическая сеть (ГрЭС) в цитоплазме гистаминергических нейронов 5-суточ-ных крысят состоит из многочисленных канальцев и цистерн, различных по длине и извилистых, чаще всего хаотично разбросанных по всей цитоплазме. Наружная поверхность цистерн несет рибосомы, которые располагаются неравномерно: в одних участках присутствуют в одиночку или группами, другие участки мембран свободны от рибосом. Помимо связанных рибосом в цитоплазме гистами-нергических нейронов в большом количестве встречаются свободные рибосомы, лежащие как поодиночке, так и объединяющиеся в полисомы (в среднем по 6 штук), которые формируют розетки и спирали (рис. 1А, Б).
Комплекс Гольджи (КГ) в основном представлен микропузырьками, немногочисленными вакуолями
и единичными цистернами. Он располагается в непосредственной близости от ядра.
Интересно отметить, что в цитоплазме гистаминергических нейронов в этот период встречаются единичные первичные лизосомы, которые представляют собой тельца разнообразной формы, мелких и средних размеров, заполненные гомогенным веществом равномерной плотности. Гораздо чаще, чем лизосомы, в нейронах встречаются мультивезикуляр-ные тельца - образования, располагающиеся преимущественно на периферии клетки, окруженные мембраной и содержащие различное количество мелких пузырьков с разной осмиофильностью (рис. 1Б).
У 5-суточных крысят в цитоплазме нейронов ядра Е2 гипоталамуса отмечено наличие образований округлой или овальной формы, не ограниченных мембраной, состоящих из гранулярного осмиофиль-ного материала с участками просветления (рис. 1Б). В отдельных случаях заметна краевая фрагментация их гранулярного субстрата. Данную структуру окружает светлый ободок цитоплазмы, обедненный орга-неллами. Такие образования располагаются как в пе-рикарионе, в различной степени удаленности от ядра, так и в отростках нейронов. Поскольку они напоминают ядрышки, их называют «ядрышкоподобными тельцами».
К 20-м суткам постнатального развития размеры гистаминергических нейронов увеличиваются более чем в 2 раза, при этом происходит значительное увеличение объёма цитоплазмы и общего количества в ней органелл. Ядро располагается, как правило, на периферии нейрона и характеризуется более четкими и ровными контурами кариолеммы (глубокие складки, характерные для ядерной оболочки гистаминергических нейронов 5-суточных животных, встречаются лишь в единичных случаях). Количество ядерных пор остается высоким, в то же время локальные расширения перинуклеарного пространства становятся менее выраженными. В структуре ядра преобладает мелкозернистый хроматин (рис. 1Г), при этом ядра клеток выглядят светлее, чем на 5-е сутки. В ядрах встречается 1-2 ядрышка, располагающихся преимущественно эксцентрично, их структурная организация существенно не меняется. Скопления субъединиц рибосом между ядрышком и кариолеммой наблюдаются реже, чем у 5-суточных крысят.
К 20-м суткам с увеличением объёма цитоплазмы происходит возрастание суммарного количества митохондрий, которые по внешнему виду и своей локализации существенно не отличаются от описанных на 5-е сутки (рис. 1В, Г). По-прежнему встречаются делящиеся органеллы. В цитоплазме гистаминерги-ческих нейронов на 20-е сутки постнатального развития более четко выражена ГрЭС (рис. 1В, Г), в ней увеличивается количество цистерн и канальцев, приобретающих более правильную параллельную ориентировку, большая часть наружной поверхности которых покрыта рибосомами, а межканальцевые участки
содержат множество свободных полирибосом. Происходит усложнение комплекса Гольджи, проявляющееся в увеличении количества цистерн и их протяженности. Однако встречается КГ, состоящий только из двух компонентов - многочисленных мелких пузырьков и более крупных вакуолей (рис. 1В, Г).
На 20-е сутки постнатального развития в цитоплазме гистаминергических нейронов увеличиваются количество и размеры лизосом. Присутствуют как первичные лизосомы мелких и средних размеров, заполненные гомогенным веществом равномерной плотности, так и вторичные лизосомы средних и крупных размеров с гетерогенным содержимым. Зачастую данные органеллы располагаются в непосредственной близости от КГ. Также довольно часто в клетках встречаются мультивезикулярные тельца (рис. 1Г).
На 20-е сутки постнатального развития в цитоплазме гистаминергических нейронов выявляются ядрышкоподобные тельца, в которых сохраняется краевая фрагментация их гранулярного субстрата. Обедненный органеллами светлый ободок цитоплазмы, окружающий данные структуры, становится заметнее. Интересно, что размеры ядрышкоподобных телец с 5-х суток существенно не меняются, но они встречаются реже и занимают преимущественно периферическое положение.
В период с 20-х по 45-е сутки рост гистаминер-гических нейронов, обусловленный увеличением объёма цитоплазмы и ядра, продолжается, но менее интенсивно, чем с 5-х по 20-е сутки, при этом их форма становится более вытянутой. Ядра нейронов 45-суточных животных располагаются ближе к центру перикарионов и характеризуется неровным контуром кариолеммы. Количество ядерных пор уменьшается, локальные расширения перинуклеарного пространства отмечаются реже, по-прежнему преобладает мелкозернистый хроматин (рис. 1Е), при этом ядро выглядит светлым, как и на 20-е сутки. Количество ядрышек уменьшается, и они располагаются в большинстве случаев эксцентрично. Структурная организация ядрышек существенно не меняется, но скопления субъединиц рибосом между ядрышком и кариолеммой практически не наблюдаются.
В цитоплазме гистаминергических нейронов на 45-е сутки выявляются разнообразные по форме, величине и электронной плотности митохондрии, которые по-прежнему контактируют с другими орга-неллами клетки и друг с другом (рис. 1Д, Е). Зачастую отмечаются местные скопления данных органелл рядом с ядром или ГрЭС (рис. 1Д). Делящиеся митохондрии наблюдаются чаще, чем на ранние сроки постнатального развития. К 45-м суткам ГрЭС сохраняет неупорядоченное расположение относительно коротких цистерн и канальцев, количество которых возрастает, при этом в промежутке между ними увеличивается число свободных рибосом (рис. 1Д). Комплекс Гольджи располагается исключительно в перинуклеарной области (рис. 1Е) и выявляется
в виде нескольких территориально разобщенных зон, которые могут отличаться друг от друга как числом и структурой цистерн, так и количеством и величиной пузырьков. Зачастую рядом с данной органеллой обнаруживаются первичные и вторичные лизосомы, количество и размеры которых возрастают (рис. 1Е), а также мультивезикулярные тельца. Ядрышкоподоб-ные тельца становятся меньше по размеру, чем у 5-ти и 20-суточных крысят. Они по-прежнему располагаются на периферии клетки.
Обсуждение результатов. Анализ данных электронно-микроскопического исследования показал, что в раннем постнатальном онтогенезе наблюдается интенсивное развитие ультраструктур гистаминер-гических нейронов гипоталамуса. Так, преобладание эухроматина, наличие эксцентричного расположения ядра и ядрышек, инвагинаций ядерной оболочки, обилие ядерных пор и скоплений субъединиц рибосом между ядрышками и кариолеммой на 5-е и 20-е сутки постнатального онтогенеза свидетельствуют об активном функциональном состоянии ядерного аппарата. При этом к 45-м суткам постнатального развития отмечается более центрированное расположение ядра, уменьшение количества ядерных пор и локальных расширений перинуклеарного пространства, а также отсутствие зон выраженной конденсации субъединиц рибосом между ядрышком и кариолеммой, что отражает снижение интенсивности их транспорта из ядра в цитоплазму. Наблюдающийся контакт митохондрий с ядерной оболочкой, цистернами и канальцами ГрЭС указывает на высокий уровень обменных процессов со значительными энергетическими затратами именно в этих зонах.
Процесс дифференцировки гистаминергических нейронов гипоталамуса в постнатальном онтогенезе сопровождается формированием КГ, ростом и более упорядоченным расположением его цистерн. Период активного функционирования КГ совпадает во времени с возрастанием количества лизосом в клетках (особенно с 20-х по 45-е сутки). В нейронах 5-суточ-ных крысят обращает на себя внимание однородность популяции лизосом, большая часть которых заполнена гомогенным зернистым веществом равномерной плотности (первичные лизосомы, гидролазные пузырьки). В процессе взросления животных лизосомы становятся более гетерогенными (появляются вторичные лизосомы, фаголизосомы).
Интересной особенностью гистаминергических нейронов является наличие в их цитоплазме ядрыш-коподобных телец на всех вышеописанных сроках развития. Подобные структуры обнаружены в секреторных нейронах и олигодендроцитах гипоталамуса на ранних этапах развития [1, 7, 8, 12], а также у нейронов передней амигдалярной области гонадэк-томированных крыс [9]. Такие же структурные образования отмечены нами в цитоплазме гистаминерги-ческих нейронов взрослых животных после введения алкоголя [4]. Эти цитоплазматические тельца назы-
вают также «стрессорными гранулами» [6, 13]. Они возникают в клетках, в том числе и нейронах, в ответ на стресс и представляют собой скопления неполных инициаторных комплексов, содержащих связанную с белками иРНК и субъединицы рибосом. Накоплению компонентов стрессовых гранул в локальных областях цитоплазмы способствуют микротрубочки цитоскелета. Появление данных структур трактуют как результат высокой потребности клетки в синтезе белка в цитоплазме, которая, вероятно, реализуется посредством ускоренной доставки субъединиц рибосом из ядра в цитоплазму и формированием новых центров их агрегации в нуждающихся отделах клетки [9]. Поскольку в гистаминергических нейронах взрослых интактных животных подобные образования не обнаружены [5, 11, 15, 17], мы предполагаем, что с возрастом ядрышкоподобные тельца исчезают, появляясь вновь лишь в случае крайней необходимости (например, после введения алкоголя [4]).
Выводы. В процессе постнатального развития ги-стаминергические нейроны укрупняются, в их ядрах уменьшается число ядрышек и количество субъединиц рибосом, скапливающихся между ядрышками и кариолеммой, которая становится менее складчатой, с меньшим числом пор, при этом в цитоплазме уменьшаются размеры ядрышкоподобных телец и увеличивается количество всех органелл.
Литература
1. Войткевич А. А., Дедов И. И. Ультраструктурные основы гипоталамической нейросекреции. М.: Медицина, 1972.- 240 с.
2. Зиматкин С. М. Гистаминергические нейроны мозга. Мн.: Новое знание, 2015. 319 с.
3. Зиматкин С. М., Кузнецова В. Б., Стрик О. Н. Пространственная организация и морфометрическая характеристика гистаминергических нейронов мозга крысы // Морфология. 2005. вып. 2. С. 27-30.
4. Зиматкин С. М., Федина Е. М., Кузнецова В. Б., Гистами-нергические нейроны мозга крысы после острого воздействия алкоголя // Морфология.- 2012.- Т. 142, № 5.-С. 17-22.
5. Зиматкин С. М., Кузнецова В. Б., Кравчук Р. И. Электронно-микроскопическое исследование нейронов гистаминергического ядра Е 2 гипоталамуса крысы // Журнал ГрГМУ.- 2004.- № 5.- С.46-49.
6. Иванов П. А., Надеждина Е. С. Стрессовые гранулы: РНП-содержащие цитоплазматические тельца, возникающие в ответ на стресс. Состав и механизмы формирования // Молекулярная биология.- 2006.- Т. 40, № 6.-С. 937-944.
7. Красновская И. А. Реакция некоторых нейросекретор-ных центров гипоталамуса крысы при охлаждении и введении тиролиберина // Проблемы эндокринологии.- 1984.- Т. 30, № 1.- С. 52-55.
8. Сенчик Ю. И. О ядрышкоподобных тельцах в цитоплазме нейросекреторных клеток гипоталамической области // Цитология.- 1967.- Т. 9, № 8.- С. 10131014.
9. Хисматуллина З. Р., Ахмадеев А. В., Шарафутдино-ва Л. А., Калимуллина Л. Б. Цитологические характери-
стики нейронов передней амигдалярной области и их реактивных изменений на фоне различных уровней половых стероидов // Цитология.- 2008.- Т. 50, № 5.-С. 381-387.
10. Haas H., Panula P. The role of histamine and the tuberomamillary nucleus in the nervous system // Nat. Rev. Neurosci. 2003.Vol. 4. P. 121-130.
11. Hayashi H, Takagi H, Takeda N, Kubota Y, Tohyama M, Watanabe T, Wada H. Fine structure of histaminergic neurons in the caudal magnocellular nucleus of the rat as demonstrated by immunocytochemistry using histidine decarboxylase as a marker // J. Comp. Neurol.- 1984.- Vol. 229.- P. 233-245.
12. Kawabata I. Electron microscopy of the rat hypothalamic neurosecretory system. II. Nucleolus-like inclusion bodies in the cytoplasm of neurosecretory cells // Arch. Histol. Jpn.- 1965.- Vol. 26, № 2.- P. 101-113.
13. Papanicolaou J., Fennessy M. R. The acute effect of ethanol on behaviour, body temperature, and brain histamine in mice // Psychopharmacology. (Berl.).- 1980.- Vol. 72.-P.73-75.
14. Reynolds E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol.- 1963.- Vol. 17.- P. 208-212.
15. Tohyama M., Tamiya R., Inagaki N., Tagaki H. Morphology of histaminergic neurons with histidine decarboxylase as a marker, in Histaminergic Neurons: Morphology and Function. // T. Watanabe, H. Wada, Eds. New York: CRC Press.- 1991.- P. 107-126.
16. Watson M. L. Staining of tissue sections for electron
microscopy with heavy metals // J. Biophys. Biochem. Cyt.-1958.- Vol. 4.- P. 475-478. 17. Wouterlood F. G., Sauren T. M., SteinbuschH. W. Histaminergic neurons in the rat brain: correlative immuno cytochemistry, Golgi impregnation, and electron microscopy // J. Comp. Neurol.- 1986.- Vol. 252.- P. 227244.
Сведения об авторах
Зиматкин Сергей Михайлович, д. биол. н, профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь.
Заерко Анастасия Викторовна, аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь.
Федина Екатерина Михайловна, к. биол. н., доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь.
Островская Оксана Борисовна, к. м. н., старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь.
Конончик Анна Эдуардовна, студентка 2 курса, 19 ЛФ группы УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь. Адрес для переписки: e-mail: [email protected].
Zimatkin S. M., Zaerko A. V., Phedina ^ M., Ostrovskaya O. B., Kononchik A. E.
Grodno State Medical University, Grodno, Belarus
THE ULTRASTRUCTURE DEVELOPMENT OF RAT BRAIN HISTAMINERGIC NEURONS IN POSTNATAL ONTOGENESIS
The brain histaminergic system plays an important role in the regulation of many functions, systems and reactions of the body. In adult mammals and the human, histaminergic neurons are located exclusively in the hypothalamus, mainly in its tuberomam-millary part, where they form five clusters - nuclei (E 1 - E 5). The aim of the study is to evaluate the ultrastructural changes in histaminergic neurons of the E2 nucleus of the rat hypothalamus in postnatal ontogenesis. Using electronic microscopy it was established that in the process of postnatal development histaminergic neurons become larger, the quantity of all cell organelles increases in their cytoplasm, the number of nucleoli goes down, the amount of ribosome subunits gathering near the karyolemma decrease, the contours of which become more straight, the size of the nucleolar-like bodies in cytoplasm reduces. Keywords: histaminergic neurons, ultrastructure, postnatal ontogenesis, hypothalamus.
