CC BY
34УДК 664.959.5
Е.Э. КУПРИНА, С.В. ВОДОЛАЖСКАЯ, Г.Г. НЯНИКОВА
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ОСНОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ИЗ РАКООБРАЗНЫХ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ СПОСОБОМ
(Санкт-Петербургский государственный технологический институт)
Разработана новая электрохимическая технология получения белковых гидроли-затов из ракообразных. Установлено, что экстрагирование белков из панциря основано на кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойствах сред, образующихся при электролизе воды. Технология позволяет получить в одном технологическом цикле хитин и белковые гидролизаты с заданными степенью гидролиза и значениями рН без применения традиционных химических реагентов и ферментных препаратов.
Общеизвестными способами получения белковых гидролизатов микробиологического назначения являются кислотный и ферментативный гидролиз. Однако при кислотном гидролизе разрушаются ценные аминокислоты и витамины, а при ферментативном не всегда достигается требуемая степень расщепления белка.
По предлагаемой электрохимической технологии обработку диспергированного белоксо-держащего сырья осуществляют в виде водно-солевой суспензии в электролизных блоках при воздействии постоянного электрического тока, при этом экстрагирование и гидролиз белка протекают в щелочной среде [1].
Особенностью электрохимической технологии является то, что она позволяет достичь глубокой степени экстрагирования белков при концентрации гидроксида натрия лишь 0,025 М, что более чем в 10-40 раз ниже, чем при традиционно применяемой щелочной обработке панциря.
Целью исследования была разработка технология получения белковых гидролизатов из ракообразных электрохимическим способом.
В качестве белоксодержащего сырья использовали: гаммарус сушеный; креветки мороженые; мышечную рыбную ткань; бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы "Serva" (Германия).
Экстрагирование и гидролиз белка осуществляли в диафрагменном электролизере с плоскопараллельным расположением электродов; при этом анод представлял собой пластину из платинированного титана, катод был выполнен из нержавеющей стали Х18Н9Т; мембрана - катионо-обменная перфторированная сульфосмола. Все материалы для электролизера выбирались исходя из принципа их электрохимической инертности и пригодности для использования в пищевом оборудовании.
Диспергирование сырья осуществляли до размера частиц 510-3 м. Электрообработку сырья в виде суспензии с раствором электролита (NaCl) проводили в катодной камере при объемной плотности тока j = 5 - 50 А/дм2, при постоянном перемешивании до достижения значений рН > 10,0±0,1 и Eh < - 600±10 мВ. Нагрев до 60±5оС и термоста-тирование осуществляли в реакторе с мешалкой в течение 45±5 мин [1-3].
Были поставлены модельные эксперименты по исследованию экстрагирования различных фракций белков в воде и в щелочной среде с заданной концентрацией гидроксида натрия 0,025 и 1,0 М.
В белковых гидролизатах определяли: сухие вещества; количество общего азота методом Кьельдаля на приборе Pertop Analytical (Tecator AB); хлористый натрий аргентометрическим титрованием; массовую долю остатка после прокаливания; общие липиды по Фолчу [4], белок по Ло-ури [5]. Анализ элементного состава гидролизатов осуществляли методом электронно-зондового рентгеновского микроанализа на базе аналитического комплекса, состоящего из растрового электронного микроскопа JSM-32CF и энергодисперсионного анализатора Link 860.
Определение концентрации сульфгидриль-ных и дисульфидных групп в растворах белков осуществляли методами прямого и обратного амперо-метрического титрования по известной методике [6,7]. Значения рН и Eh определяли потенциометри-чески при помощи рН-метра-милливольтметра.
По предложенной технологии создана схема комплексной переработки ракообразных, в результате которой получали белковый гидролизат, названный «Протеинэл», и хитиновый сорбент из панциря [8].
Согласно предлагаемой технологии, экстрагирование белка из панциря осуществляется в
два этапа: обработкой диспергированного сырья раствором катодной фракции (депротеинирование-I) и электрохимической обработкой его в катодной камере электролизера (депротеинирование-11). Катодная фракция представляет собой раствор со значениями рН >12,0, БЬ < -600 мВ, получаемый в катодной камере диафрагменного электролизера в результате электролиза электропроводящих сред (раствор КаС1) в постоянном электрическом поле и содержащий до 2 % белково-липидного комплекса, экстрагированного из панциря на этапе депротеинирования-11.
На этапе обработки сырья катодной фракцией происходит экстрагирование до 85% легкорастворимых белков, а труднорастворимые белки экстрагируются при депротеинировании-11 в электролизере. В результате остаточное содержание белка в твердом остатке - хитине не превышает 0,25 %.
Преимуществом способа является то, что удается достичь 95-98 %-ного извлечения белков из сырья в условиях, когда концентрация щелочи составляет всего 0,025 М, что в 10-40 раз ниже, чем при традиционно применяемой щелочной экстракции.
Известно, что основной причиной растворения белков в щелочной среде является разрыв дисульфидных связей между их макромолекулами, которые обеспечивают устойчивость их третичной структуры [6]. При высоких концентрациях щелочи (> 1,0 М) разрушение дисульфидных связей, главным образом, происходит по реакции Р-эли-минирования [9], в результате которой возможно образование ряда продуктов с токсичными свойствами, что снижает качество гидролизатов [10]. Однако, также известно, что деструкция по 8-8-связям и последующее разворачивание белковой молекулы в присутствии восстановителей происходит при значительно более низкой концентрации
гидроксидионов [11]. Последнее было подтверждено в экспериментах на модельном сырье при различных способах его обработки (табл.).
Из данных таблицы следует, что в водном растворе БСА, не подвергшемся электрохимической и щелочной обработке, отсутствуют -8Н группы цистеина, что согласуется с литературными данными [6], так как в нативном виде этот белок содержит только цистин, обеспечивающий формирование его третичной структуры за счет -88- связей.
При воздействии на белковые молекулы наиболее концентрированной щелочи 1,0 М практически все -8-8- связи разрушаются, их содержание уменьшается в 10 раз. Этот процесс способствует разворачиванию молекул белка, так как они теряют пространственные сшивки, и их третичная структура разрушается. Однако лишь 40% -8-8-групп цистина превращается в -8Н группы цис-теина. Остальные -8-8- группы, видимо, участвуют в побочных реакциях, идущих с разрывом -С-8- связей по реакции р-элиминирования и приводящих к образованию весьма вредных продуктов, образующихся в результате реакции Р-элиминирования и последующей реакции нуклеофильного присоединения [10].
В образцах, полученных обработкой сырья 0,025 М щелочью и электрохимически, количество -8-8- групп уменьшается в 4-5 раза, т.е. деструк-тирующее действие на молекулу белка оказывается в 2,0-2,5 раза ниже, чем в образце, полученном обработкой 1,0 М щелочью. В то же время, концентрация -8Н групп оказывается в 1,6-1,8 раза выше. Эти результаты свидетельствуют, с одной стороны, о меньших деструктивных процессах и сохранении нативной структуры белка при его растворении, с другой - о подавлении вредных побочных реакций при разрушении -8-8- связей.
Таблица.
Влияние способа экстрагирования на степень растворения белка и концентрацию дисульфидных , сульфгидрильных групп и аминного азота.
Способ обработки (растворитель) Раствор БСА* Раствор мышечной рыбной ткани**
СН8, млМ/г С88, млМ/г Степень разрушения 8-8, % Степень растворения ткани, % СН8, млМ/г С88, млМ/г СКН2, %
Вода 0 500 - 32 - - -
№ОН - 1,0 М 300 50 90 98 1000 300 1,02
№ОН - 0,025 М 500 125 75 38 - - -
Электрохимическая обработка до рН > 12,0, БЬ < -600 мВ 500 125 75 98 2200 550 1,20
* Во всех образцах концентрация БСА в растворе составила 5,0±0,2 мг/мл.
** В образцах, полученных обработкой 1,0 М ЫаОН и электрохимической обработкой, концентрация белка в растворе составила 29,0±1,0 мг/мл.
Таким образом, низкое содержание гидро-ксида натрия с концентрацией 0,025 М в экстра-генте - растворителе обеспечивает получение белкового экстракта улучшенного качества и увеличение концентрации гидроксида натрия до концентрации 1,0 М не желательно. К сожалению, определяемая концентрация -8Н групп также может быть занижена из-за «маскирования» этих групп в белке, которое происходит в результате как их стерической недоступности реагенту AgNOз, так и особенностями их ионного окружения и гидрофобными взаимодействиями [6], что несколько снижает достоверность результатов измерений, однако более точного метода в литературе не предлагается.
Таким образом, растворение белков БСА электрохимическим способом непосредственно в процессе электролиза в катодной камере электролизера оказывает в 2 раза меньшее деструктирую-щее действие на -8-8- связи и способствует протеканию деструкции по благоприятному механизму с образованием -8Н групп цистеина.
Для подтверждения установленных закономерностей было проведено исследование содержания сульфгидрильных и дисульфидных групп в белковых гидролизатах, полученных из мышечной рыбной ткани в аналогичных условиях, что и растворы БСА, за исключением образца при обработке 0,025 М щелочью, так как тканевые белки не растворяются при столь низкой концентрации гидроксида натрия. Во всех исследованных образцах концентрация белка в растворе составила 29,0±1,0 мг/мл.
Из данных таблицы следует, что в мышечных рыбных белках, экстрагированных и растворенных электрохимическим способом, оказывается меньше степень деструкции белка, обусловленная разрушением -8-8- связей, чем в образце, полученном с использованием 1,0 М №ОН. В то же время, в образце, полученном электрохимически, концентрация -8Н групп больше в 2,2^2,4 раза по сравнению с щелочным образцом, что свидетельствует о меньшем содержании побочных продуктов деструкции белков по -С-8- связям в результате реакции р-элиминирования [10].
Реакция разрыва -8-8- связей в белках под действием восстановителей, образующихся в результате электролиза воды и, в частности, атомарного водорода, исследована и протекает по следующему механизму [6]:
Кафедра технологии микробиологического синтеза
восстановитель +2е, 2Н+
Rj—S-S—R2 -Rj-SH—SH—R2
Известно также, что для растворения щело-черастворимых белков необходима стадия разрушения третичной структуры и разворачивания молекулы [6]. Японскими исследователями на модельных белках иммуноглобулинах было показано, что деструкция по -S-S- связям и последующее разворачивание белковой молекулы в присутствии восстановителей происходит при значительно более низкой концентрации ОН- -ионов при рН 8,5. В случае отсутствия восстановителей разворачивание молекул белка в растворе начиналось лишь при рН > 11,6 [9]. Этими же авторами было установлено, что при данных значениях рН никакие другие функциональные группы, кроме -SH, не принимают участия в разворачивании молекул белка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Патент № 2110926 РФ, МКИ6 А 23 J 1/ 04, 1/12, 1/14, 1/18. Способ растворения белка / Куприна Е.Э., Маслова Г.В. (РФ). - Заявл.11.01.96; Опубл. 20.05.98. Бюл. №14.
2. Калоус В., Павличек З. Биофизическая химия. М.: Мир. 1985. С.206-208.
3. Патент № 2170763 РФ, МКИ6 С2, 7 С 12 N 1/20. Способ получения основы микробиологических питательных сред / Водолажская С.В., Куприна Е.Э., Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. (РФ). - За-явл.21.07.99; Опубл.20.07.2001. Бюл. № 20.
4. Кейте М. Техника липидологии. М.: Мир. 1975. 73 с.
5. Бейли Дж. Методы химии белков. М.: Мир. 1965. 238 с.
6. Torchinsky J.M. Sulfur in proteins. Oxford: Perga-mon. 1981. 214p.
7. Соколовский В.В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма: СПб.: СПбМАПО. 1996. 30 с.
8. Куприна Е.Э. и др. Разработка технологии получения биологически активных хитиновых сорбентов на основе продуктов переработки ракообразных электрохимическим способом // Материалы 6-ой междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва-Щелково. 22-24 окт. 2001г. М.: ВНИРО. 2001 г. С.31-34.
9. Nashet A.S. et al. // J.Agric. Food. Chem. 1977. № 25. Р.245-273.
10. Whitaker J.R., Feeney R.E. // Crit. Rev. Food Sci. and Nutrition. 1983. V.3. № 19. Р.173-212.
11. Ashikari J., Arato Y., Hamaguchi K. // J.Biochem. 1985. V.97. № 2. Р.517-528.
